CMV-IgM-ELA Test PKS medac. Magyar 110-PKS-VPU/010512

Átírás

1 CMVIgMELA Test PKS medac Magyar PKSVPU/010512

2 GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ RENDELÉSI CÍM Tel.: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ PKSVPU/010512

3 CMVIgMELA Test PKS medac Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, cytomegalovirus (CMV) elleni IgM antitestek kimutatására Katalógusszám: 110PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA! BEVEZETÉS A Cytomegalovirus (CMV) a humán patogén Herpesviridae családba tartozik, melyet dupla szálú DNS genom jellemez. Ezekre a vírusokra jellemző, hogy latensen perzisztál a szervezetben az elsődleges fertőzés után. Ezért a vírus reaktivációja bizonyos körülmények között előfordulhat. A CMV fertőzés immunokompetens egyénekben rendszerint tünetmentes. Azokban az egyénekben, akik immunszuppresszáltak (pl. transzplantáltak, HIV fertőzöttek, tumoros betegek, újszülöttek) komoly tünetek variációja észlelhető. A CMV egyike a leggyakoribb patogéneknek prenatális fertőzésekben, mely komoly rendellenességeket okozhat, szintén beleértve a késői károsodásokat olyan gyerekekben, melyek tünetek nélkül születtek. A CMVIgMELA Test PKS medac CMV IgM specifikus antitestek kimutatására használható szérum mintákban. Akut CMV fertőzés IgM antitestek kimutatásával demonstrálható. Figyelemmel kell lenni arra, hogy IgM antitestek nem minden esetben termelődnek. Immunszuppresszált betegek esetében például a reaktiváció és újrafertőződés során az IgM antitestek ritkán mutathatóak ki. 110PKSVPU/

4 A TESZT ELVE A lemez antihumán IgM immunoglobulinnal van bevonva. A mintában levő IgM szelektíven kötődik a lyukakhoz. A CMVspecifikus IgM antitestek kötődnek a peroxidázzal jelzett CMV antigénhez (AG = antigen, P = peroxidase). Inkubáció a TMBszubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le. A teszt előnyei Nincs nemspecifikus reakció és nincs a reumatoid faktor által okozott álpozitív reakció. A magas IgG titer nem blokkolja az IgM antitesteket. A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetővé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását. A törhető csíkok lehetővé teszik a teszt gazdaságos felhasználását. Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerű ELISA készülékeken. 110PKSVPU/

5 A KIT TARTALMA Katalógusszám: 110PKS 1. MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk (jelölés: CMM, kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhető, U alakú, kecske antihumán IgM immunoglobulinnal bevont, BSA és ph indikátor, felhasználásra kész. 2. Control Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 3. Control + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 4. WB Mosó puffer: 1 flakon, 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, ProClin TM 300 tartalmú. 5. VIRDIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, felhasználásra kész, ProClin TM 300 tartalmú. 6. ANTIGEN CMVIgMELA (Enzim jelzett antigén): 2 fiola, mindegyik 5,0 ml, liofilizált, FCSt tartalmaz, piros színű, HRPvel konjugált. 7. TMB TMBszubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész. 8. STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H 2 SO 4 ), felhasználásra kész. 110PKSVPU/

6 1. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS Anyag/Reagens Állapot Tárolás Stabilitás Teszt kit bontatlan C lejárati idő végéig Mikrotiterlemez bontott C 6 hét zacskóban szárítószerrel Kontrollok bontott C 6 hét Mosó puffer hígított C 6 hét Minta hígító bontott C 6 hét CMVIgMELA feloldott C 5 nap 18 C * 6 hét TMBszubsztrát bontott C 6 hét Leállító oldat bontott C lejárati idő végéig * Osszuk le aliquot részekre és felengedés után mégegyszer ne fagyasszuk. Ne használjuk a reagenseket a lejárati időn túl. 2. SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK 2.1. Víz injekcióhoz (H 2 O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást Állítható mikropipetták Tiszta üveg, vagy műanyag edények a mosó puffer és a minták hígításához Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó) Inkubátor, 37 C Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és nm szűrőkkel. 3. A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE A mérés megkezdése előtt az összes komponenst szobahőmérsékletűre kell hozni a kondenzáció elkerülése érdekében. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát. 110PKSVPU/

7 3.1. Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. Megjegyzés: A mikrotiter lemez lyukai halvány zöld színűek. A lyukakban időnként előforduló zöldesbarna elszíneződést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítőképességét nem befolyásolja Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minőségű vízzel (pl. 50 ml mosó puffert (10x) 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) előforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 C) és/vagy szobahőmérsékleten keveréssel CMVIgMELA A liofilizált CMVIgMELA konjugátumot oldjuk fel 5 ml mintahígítóban. Óvatosan keverjük és ügyeljünk arra, hogy a dugóba ragadt részecskék is feloldódjanak. A CMVIgMELA feloldás után piros színű és felhasználásra kész. Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, CMVIgMELA) a különböző gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a minta hígító, a mosó puffer, a TMBszubsztrát és a leállító oldat általában cserélhető az összes Medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények csak a használati utasítás pontos betartása esetén nyerhetők. 4. MINTÁK 4.1. A kit szérum minták vizsgálatára alkalmas. A beteg minták 7 napig tárolhatóak 28 ºCon. Hosszabb tárolás 20 C alatt. Kerüljük az ismételt felolvasztást és fagyasztást A szérumok előkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroroganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket A mintákat 1:100szorosra kell hígítani mintahígítóval. A minták tovább hígíthatóak titer meghatározáshoz. 110PKSVPU/

8 5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a smítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, előmosás nem szükséges Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 μl hígított mintát, negatív és pozitív kontrollt duplikátban a lyukakba. A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kékre változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahőmérsékleten 30 percig nedves kamrában, illetve 60 percig 2 8 Con tarthatjuk Inkubáljuk a lemezt 60 percig ( 5 perc) 37 ( 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva. o Con 5.4. Oldjuk fel a CMVIgMELAt (ld. 3.3.) Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 μl mosópufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szűrőpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal használjuk fel! 5.6. Adjunk CMVIgMELAt (piros színű) minden lyukba (kivétel A1). 50 μl ELAt pipettázzunk a lyukakba, ha manuálisan dolgozzuk fel. Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 μl ELAt pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában előforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerősítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban működő automatával való kompatibilitást ellenőrizzük Inkubáljuk újra 60 percig ( 5 perc) 37 kamrában, vagy fóliával lezárva. o Con ( 1 C) nedves 5.8. Az inkubáció után mossuk a lemezt újra (ld. 5.5.). 110PKSVPU/

9 5.9. Adjunk 50 μl TMBszubsztrát oldatot minden lyukba (A1be is) és inkubáljuk 30 percig ( 2 perc) 37 o Con ( 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik Állítsuk le a reakciót 100 μl leállító oldattal minden lyukba (A1be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás előtt tisztítsuk meg a mikrotiter lemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegőbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni. 5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN Negatív kontroll Pozitív kontroll Minta Háttér (A1) Negatív kontroll 50 μl Pozitív kontroll 50 μl Minta 50 μl Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3 x 200 μl mosóoldattal CMVIgMELA 50/60 μl*) 50/60 μl*) 50/60 μl*) Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3 x 200 μl mosóoldattal TMBszubsztrát 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl Inkubáljuk 30 percig 37 Con sötétben Leállító oldat 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl Fotometrikus leolvasás 450 nmen (ref nm) *) manuális/automatikus eljárás (ld. 5.6.) 110PKSVPU/

10 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG) Olvassuk le az OD értékeket 450 nmen (referencia hullámhossz nm). Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékből. A negatív kontroll átlagos OD értéke < 0,100 legyen. A pozitív kontroll átlagos OD értéke > 0,800 legyen. Cutoff = negatív kontroll átlag OD értéke + 0,140 Szürke zóna = Cutoff 10 % Ismételjük meg a vizsgálatot, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak. 6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE A szürke zóna alsó határánál kisebb OD értékű minták NEGATÍVnak tekintendők. A szürke zónába eső OD értékű minták KÉTESnek tekintendők. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal később friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében. A szürke zóna felső határánál nagyobb OD értékű minták POZITÍVnak tekintendők. Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal és további diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni. Egyéb Herpesvírusok elleni antitestekkel való keresztreakció bizonyos esetekben nem zárható ki. A negatív mintákban előforduló nagyon nagy koncentrációjú lipidek álpozitív reakciót eredményezhetnek. A Hemoglobin, vagy Bilirubin nagy koncentrációja nem befolyásolja az eredményeket. 110PKSVPU/

11 7. TELJESÍTŐKÉPESSÉG Az alábbi teljesítőképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS FAJLAGOSSÁG 482, véradóktól és betegektől származó szérum mintát vizsgáltak a CMV IgMELA Test PKS medac teszttel, összehasonlítva egy a laborokban rutinban használt magas specificitású ELISA teszttel. Az eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be. CMVIgMELA Test PKS Referencia teszt negatív pozitív negatív pozitív Érzékenység = 99,40 % Fajlagosság = 99,68 % Pozitív prediktív érték: 99,40 % Negatív prediktív érték: 99,68 % 7.B. PONTOSSÁG Minta Teszten belüli szórás Minta Tesztek közötti szórás (n = 11) átlag SD CV (%) n átlag SD CV (%) OD OD NC 0,034 0, NC 0,050 0, BC 0,314 0, BC 0,230 0,021 9 PC 2,269 0, PC 1,456 0,064 4 N 1 0,049 0, N 4 0,058 0, N 2 0,317 0, N 5 0,264 0, N 3 2,673 0, N 6 0,271 0, N 7 1,788 0,073 4 NC = negatív kontroll; BC = gyenge pozitív kontroll (a kit nem tartalmazza); PC = pozitív kontroll 110PKSVPU/

12 ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK A kereszt szennyezés elkerülése érdekében ne cseréljük fel a fiolákat és kupakjaikat. A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében. Használat után a reagenseket az előírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében. Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekből, illetve gyártásból származó reagensekkel történő felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is). EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani. Az emberi eredetű reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAgra, HIV1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erősen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredetű reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertőzőként kezeljük és az összes szükséges elővigyázatossággal használjuk. MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendők. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és előírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelő cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében. A kibocsátás dátuma: PKSVPU/

13 IRODALOM Enders, G.: Infektionen und Impfungen in der Schwangerschaft. Urban und Schwarzenberg, München, 930 (1990). Flik, J.: A comparison of 2 quantitative ELISAs used to detect IgG antibodies against HCMV in transplant recipients. Poster presented at the 5th Int. Cytomegalovirus Conference (1995). Jethon, C., Doerr, H. W., Weber, B.: Serologische Diagnose der CytomegalievirusInfektion: Evaluierung von drei Enzymimmunoassays zum Nachweis von spezifischen IgMAntikörpern in Serumproben von immunkompetenten und immunsupprimierten Patienten. Lab. Med. 20 (9), (1996). Reimer, K. und Meisel, H.: Humanes Zytomegalievirus, in: Diagnostische Bibliothek Bd.1, Porstmann, T. (Hrsg.), Blackwell Wissenschaftsverlag, (1996). Schmitz, H., Doerr, H. W., Kampa, D. and Vogt, A.: Solidphase enzyme immunoassay for IgM antibodies to Cytomegalovirus. J. Clin. Microbiol. 5, (1977). Schmitz, H., Kampa, D., Doerr, H. W., Luthardt, T., Hillemanns, H. G. and Würtele, A.: IgM antibodies to Cytomegalovirus during pregnancy. Arch. Virol. 53, (1977). Schmitz, H., von Deimling, U. and Flehmig, B.: Detection of IgM antibodies to Cytomegalovirus (CMV) using an EnzymeLabelled Antigen (ELA). J. Gen. Virol. 50, 5968 (1980). Steinmann, J. and Bischoff, J.: Comparison of serological methods for the detection of Cytomegalovirus infection. Lab. Med. 15, (1991). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or longterm human Cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997). Weber, B., Prosser, F., Munkwitz, A. and Doerr, H. W.: Serological diagnosis of Cytomegalovirus infection: comparison of 8 enzyme immunoassays for the detection of HCMVspecific IgM antibody. Clin. Diagn. Virol. 2, (1994). 110PKSVPU/