Virológia gyakorlatok

Átírás

1 Virológia gyakorlatok A virológia gyakorlatok célja, hogy a hallgatók betekintést nyerhessenek az állatorvosi virológiai diagnosztika különböző módszereibe. A hallgatók a gyakorlatokon esetfeldolgozás során különféle diagnosztikai eljárások végrehajtásával ismerkedhetnek meg az esetek hátterében lévő kórokozók (vírusok) kimutatásának és a laboratóriumi diagnózis felállításának folyamatával. A gyakorlatok menete a következő: 1. gyakorlat: mintafeldolgozás, vírusszaporítás szövettenyészeten és embrionált tyúktojásban 2. gyakorlat: citopatogén hatások, hemagglutinációs teszt 3. gyakorlat: nukleinsav izolálás, polimeráz láncreakció (PCR) 4. gyakorlat: PCR reakciók ellenőrzése, vírusneutralizációs próbák előkészítése 5. gyakorlat: vírusneutralizációs próba elbírálása, hemagglutináció-gátlási próba (HAG), az eredmények és diagnózisok megbeszélése 1. gyakorlat: Mintavétel és laboratóriumi vizsgálat Fertőző megbetegedések esetén kiegészítő laboratóriumi vizsgálatok szükségesek a fertőző ágensek beazonosításához és a pontos diagnózis felállításához. A klinikai állatorvosoknak általában nem áll rendelkezésükre az ehhez szükséges speciális felszerelés, ezért akkreditált vagy tapasztalt szaklaboratóriumokkal kell együttműködniük. Laboratóriumi vizsgálatok szükségesek lehetnek, amikor a tünetek és a kórbonctani elváltozások nem elegendőek egy diagnózis felállításához, illetve amikor az a célunk, hogy egy állományból kimutassuk az endémiásan előforduló, rendszeresen megbetegedést okozó mikrobákat. Kötelezőek a laboratóriumi vizsgálatok, ha azt a jogszabályok előírják (bejelentési kötelezettség alá tartozó betegségek esetén: pl ragadós száj-és körömfájás, afrikai sertéspestis, baromfipestis stb.), zoonózis gyanú esetén (veszettség), továbbá mentesítési eljárások során az állomány mentességének igazolásához (szarvasmarha leukózis, szarvasmarhák fertőző rhinotracheitis vírusa stb.), hivatalos tanúsítványok kiállításához, pl. állatállományok SPF (specified pathogen free, meghatározott kórokozóktól való mentesség) minősítéséhez, különféle kiállítások, versenyek előtt, illetve szállítási és utazási engedélyek kiállításához.

2 1. Mintavétel A vizsgálat célja és módja (pl. diagnózis felállítása, alkalmazott diagnosztikai eljárások) meghatározza a minta típusát, a beküldendő mennyiséget és a szállítás módját is. A mintavétel, a minta laboratóriumba szállításának időtartama és körülményei fontos tényezők a sikeres diagnózis szempontjából. A laboratóriumi munkát nagyban elősegíti a minta pontos megjelölése és a mintával együtt beküldött, megfelelően kitöltött kísérőirat. A kísérőirat olyan dokumentum, amelyben a mintát beküldő, vizsgálatot kérő állatorvos megrendeli a laboratóriumi szolgáltatást, illetve biztosítja a laboratóriumi vizsgálatokhoz szükséges vagy azt segítő információkat, a pontos kórelőzményt. Az iratnak tartalmaznia kell a következőket: - a beküldő állatorvos neve, címe és elérhetőségei (telefonszám, fax, ) - az állat tulajdonosának elérhetőségei (postai címe, telefonszáma, fax, ) - a minta (állat) adatai: o az állat azonosítási száma, illetve neve o kora o neme o rövid, releváns vakcinázási történet - esetleírást - egyedi szinten o tünetek megjelenésének ideje o a tapasztalt tünetek o betegség lefolyása - esetleírás állomány szinten: o tünetek megjelenésének ideje az állományban o a tapasztalt tünetek o betegség lefolyása - a minta típusának ismertetése: o tampon (orr, bélsár, garat, kötőhártya) o vér (alvadásban gátolt, szérum) o szervek (lép, máj, tüdő, vese, szív, bél, agyvelő, placenta: a feltételezett betegségtől függően) - feltételezett betegségek, kórokozók - kért laboratóriumi vizsgálatok

3 A diagnosztikai szolgáltatást biztosító laboratóriumok elérhetővé teszik az általuk végzett vizsgálatok, vizsgálati módszerek, és áraik listáját, segítséget nyújtanak abban, hogy milyen minták szükségesek a vizsgálatokhoz és hogyan szükséges azokat eljuttatni a laborba, illetve a vizsgálatok elvégzésének várható határidejét is jelzik. Az általuk kibocsátott eredményközlő dokumentum az eredmények megfelelő magyarázatát is tartalmazza. Mind a vizsgálat módjától, mind pedig a feltételezett betegségtől is függ, hogy milyen minta a legalkalmasabb a laboratóriumi vizsgálatra, ezért a pontos kórtörténet nélkülözhetetlen. A vizsgálat módja alapján megkülönböztetünk direkt és indirekt eljárásokat. Direkt víruskimutatásra irányuló vizsgálat általában a fertőzés korai szakaszában végezhető, ekkor magát a kórokozót vagy annak valamely komponensét (antigén, nukleinsav) mutatjuk ki a mintából. A direkt víruskimutató módszerek elvégezhetőek elhullott állat szervmintáiból, különböző testváladékokból (tej, vizelet, bélsár, liquor, testüregi folyadék), illetve alvadásban gátolt vérből szeparált leukocitákból. Indirekt víruskimutatás általában a fertőzés késői fázisában végezhető, ekkor a kórokozó ellen termelődött ellenanyagokra irányulnak a vizsgálatok. Ezek a módszerek elvégezhetőek alvadásban gátolt vérből, vagy savóból, tejből, liquorból, testüregi folyadékokból. A vizsgálatok egyedi- és állomány-szinten is végezhetők. Egyedi vizsgálat esetén savópár vizsgálatot végeznek, a betegség korai és késői szakaszából származó savók vizsgálatával. Állományok vizsgálatakor reprezentatív mintavétel szükséges, hogy az eredményekből egész állományra érvényes statisztikai következtetéseket lehessen levonni. A direkt víruskimutató vizsgálatokra alkalmas minták a tünetek/feltételezett betegség alapján jellemzőek és csoportosíthatók: Légzőszervi tünetek Emésztőszervi tünetek Idegrendszeri tünetek Élő állat Elhullott állat -tamponminta: orr-, kötőhártya-, garat; alvadásban gátolt vér (EDTA, citrát, heparin) tüdő és nyirokcsomók, lép, máj, vese bélsár (tampon); alvadásban gátolt vér (EDTA, citrát, heparin) bélszakaszok és bélfodri nyirokcsomók; (lép, máj, vese, tüdő) alvadásban gátolt vér (EDTA, citrát, heparin); tampon (kötőhártya-, orr- ); (cerebrospinalis liquor) agy- és gerincvelő különböző részei; (lép, máj, vese, tüdő) Vetélés esetén a magzatot, vagy a szerveit, a placentát, magzatburkot és minden esetben az anyaállatból vett vérmintát is a laborba kell küldeni.

4 Indirekt víruskimutatáshoz szükséges minták: savópár vizsgálat szükséges az ellenanyagszintnövekedés kimutatásához, legalább 4 titernyi szignifikáns emelkedéssel lehet igazolni a fertőzést. Az első vérminta vétele az akut fázisban, a tünetek megjelenésekor, míg a második mintavétel 2-4 héttel később, a gyógyulási szakaszban történik A mintákat a lehető legrövidebb időn belül, futárral vagy személyesen kell eljuttatni a laboratóriumba. A határidő általában 24 óra, de ez függ a minta típusától is (pl: a leukocitaszeparálást az alvadásban gátolt vérből, a vérvételt követő 6 órán belül el kell végezni). A mintákat különösen nyári melegben - jégakkukkal hűtve, 4 C-on kell szállítani. A csomagolásnak olyannak kell lennie, amivel a minta szivárgása, illetve a minta és a környezet szennyezése elkerülhető. Különösen fontos a csomag pontos címzése, mellyel elkerülhetjük a minták elkeveredését, ezáltal késedelmes, vizsgálatra alkalmatlan állapotban laboratóriumba érkezését. A hatékonyabb együttműködés (rövidebb vizsgálati határidő) érdekében érdemes a laboratóriumot előre tájékoztatni a kért vizsgálatokról, illetve a minták laboratóriumba érkezésének időpontjáról. 2. Laboratóriumi vizsgálatok A víruskimutató módszerek között direkt- és indirekt eljárásokat különböztetünk meg. Direkt víruskimutatáskor a komplett vírust, vagy pedig komponenseit (fehérjék, nukleinsav) tudjuk azonosítani. A teljes vírust szövettenyészeten történő elszaporítással, azaz vírusizolálással lehet kimutatni. Az antigént- (pl. Enzyme Linked Immunosorbent Assay [ELISA], hemagglutináció, peroxidáz- vagy immunfluoreszcens teszt), a vírusfehérjéket (Western blot), illetve a vírus nukleinsavát (pl. nukleinsav hibridizáció, polimeráz láncreakció [PCR]) speciális vizsgáló módszerekkel mutatjuk ki a mintából. Indirekt eljárások közé a különböző szerológiai módszerek tartoznak (ELISA, vírusneutralizáció, indirekt IF, hemagglutináció gátlás [HAI]), amelyek során a fertőzésen átesett állatok savójában az ellenanyagok jelenlétét detektáljuk Direkt víruskimutatás - vírusizolálás Célja: - Vírusok kimutatása- virológiai diagnosztika - Vírusok nagy mennyiségben történő elszaporítása vírusanalitikai vizsgálatokhoz, vakcinagyártáshoz

5 A vírusok obligát sejtparaziták, ezért in vitro szaporításukhoz, izolálásukhoz élő sejtek szükségesek. Módszerek: - vírusok szaporítása sejt- és szövettenyészeten - embrionált tojásoltás - kísérleti állat fertőzése Vírusizolálás szövettenyészeten Elméleti háttér: A sejtek in vitro szaporítása és fenntartása Primer szövettenyészet készítése Azok a szervek a legalkalmasabbak vírusszaporításra, amelyekben a vírusok in vivo körülmények között is szaporodnak. Az aktív sejtosztódás szempontjából fiatal állatok (embrió, újszülött, vagy pár napos állat) hámsejtekben gazdag szerveiből célszerű szövettenyészetet készíteni (vese, here, thymus). A szervet steril körülmények között kell az állatból kivenni és a feldolgozását néhány órán belül meg kell kezdeni, mielőtt az önemésztés folyamata elkezdődne. A szerv feldolgozása során az első lépés a kötőszöveti burkok eltávolítása, melyet a szerv állományának apró darabokra felvágása követ. Ezután a szerv apróra vágott darabjait tripszin-verzén (EDTA) oldatban emésztjük. Az emésztés során sejtszuszpenziót kapunk, amelyet a tripszinhatás felfüggesztéséhez jéggel hűtött edényben gyűjtünk össze. A szuszpenzió centrifugálásával leülepítjük a sejteket, majd a tripszin-tartalmú felülúszót leöntjük, a sejteket pedig tápfolyadékban reszuszpendáljuk. A tápfolyadék pl. Minimal Essential Medium (MEM) komponensei révén izoionikus, izoozmotikus, és izotónikus környezetet biztosít a sejteknek. A tápfolyadék különfélek sók pufferolt, illetve aminosavakkal és szénhidrátokkal gazdagított oldatából áll, fehérjeforrásként és mediátorként pedig foetális (neonatális) borjúsavót (foetal calf serum [FCS]) tartalmaz, ami a sejtek osztódásához nélkülözhetetlen. A borjúsavót kolosztrumot nem fogyasztott borjakból nyerik (ezáltal ellenanyagokat nem tartalmaz), és a tápfolyadék típusától, felhasználásától függően különböző mennyiségben adjuk a tápfolyadékhoz: az 5-10 % FCS-t tartalmazó tápfolyadék az úgynevezett szaporító közeg, a 2 % FCS-t tartalmazó tápfolyadék pedig a fenntartó közeg a sejtek számára. A tápfolyadék tartalmaz antibiotikumot és antimycotikumot,

6 mely megakadályozza a baktériumok és gombák szaporodását a szövettenyészetben, illetve indikátort is, melynek elszíneződése jelzi a sejtek anyagcseréjét. A sejtszuszpenzió sűrűségét Bürker-kamrában határozzuk meg, és sejt/ml értékre állítjuk be. Ezután a szuszpenziót steril sejttenyésztő palackokba adagoljuk. A szövettenyészeteket általában 37 C-os termosztátban, 5 % CO 2 koncentrációjú környezetben inkubáljuk. A sejtek néhány órán belül letapadnak a sejttenyésztő palackok aljára és osztódásnak indulnak. Az összefüggő sejttenyészetet 3-5 nap elteltével alakul ki. Az osztódás során a szomszédos sejtek hártyájának érintkezése kiváltja az ún. kontakt gátlás -t, mely a sejtosztódás leállásához vezet. Végeredményben a sejtek egyrétegű szövettenyészetet alkotnak, mely egyenletesen bevonja az edény alját. Ezt hívjuk primer szövettenyészetnek. A sejtek növekedési állapotát mikroszkóp segítségével naponta ellenőrizzük. Miután kialakul az egybefüggő sejttenyészet, a szaporító tápfolyadékot fenntartó tápfolyadékra cseréljük, mely kevesebb foetálsavót tartalmaz, és ezáltal lassítja a sejtek öregedését. A primer szövettenyészetek 2-3 hétig is életképesek maradnak a fenntartó tápfolyadékban, ez idő alatt fertőzhetjük, illetve szükség esetén passzálhatjuk is őket Szubkultúrák előállítása (passzálás) A primer sejttenyészetet az edény faláról tripszinnel leemésztjük, centrifugáljuk, majd a sejteket friss tápfolyadékkal reszuszpendáljuk és új, steril sejttenyésztő edényekbe adagoljuk, ahol ismét elegendő hely van számukra az osztódáshoz. A palackokat inkubátorba helyezzük; a sejtek leülepednek és osztódnak a kontakt gátlás kialakulásáig. Ezeket a sejtkultúrákat már másodlagos szövettenyészetnek hívjuk. A másodlagos tenyészetnek több előnye is van: homogénebb, minőségileg jobb sejtekből állnak. Hátrányuk viszont, hogy vírusfertőzésre kevésbé fogékonyak. További passzálások révén harmadlagos, negyedleges sejtkultúrákat készíthetünk, de néhány passzálás után már csökken a sejtek osztódó képessége, vagy a fibroblaszt jellegű sejtek túlnövik a hámjellegű sejteket, ezért a tercier, kvaterner szövettenyészetek vírusok szaporítására kevésbé alkalmasak.

7 Sejtvonalak Diploid sejtvonalakat sejtklónozással állíthatunk elő: egyetlen sejt utódait izoláljuk, amelynek révén genetikailag homogén sejtpopulációt lehet előállítani. A szöveteket szabályos időközönként mikroszkóppal ellenőrizzük (morfológia, mitotikus aktivitás, kolónia-formáló képesség figyelembe vétele), és sorozatos passzálások révén azokat a sejteket választjuk ki, amelyek szaporodóképessége megfelelő. -Sejtvonalak előnyei: - homogén sejtek - sejteket fagyasztva lehet tárolni (-80 C-on, vagy -196 C-on folyékony nitrogénben), és évek múlva is ugyanúgy lehet használni őket - Sejtvonalak hátrányai: - némelyik vírusra kevésbé fogékonyak - csak egyféle sejt áll rendelkezésre a vírusok szaporodásához A legáltalánosabban használt sejtvonalak kereskedelmi forgalomban kaphatók, több száz passzázson mentek keresztül. A sejtvonalakat különféle betűkkel és számokkal jelzik (pl. PK- 15: sertésvese sejtvonal, MDBK: Madin-Darby-féle borjúvese sejtvonal). Az aneuploid sejtkultúrák tumor eredetű sejtvonalak, amelyeknek igen nagy az osztódási képességük és általában primordiális (ős-) sejttípusok. A celluláris vagy virális onc gén jelenléte veszélyes lehet, ezért csak inaktivált vakcinák készíthetőek a tumorsejt-vonalakon szaporított vírusokból. Ezek a sejtvonalak kevésbé fogékonyak néhány vírusfertőzésre. A diploid sejtvonalakhoz hasonlóan ezeket is betűkkel és számokkal jelölik (pl. HeLa: humán méhtumor sejtek, BHK-21: hörcsög vesetumor sejtek, VERO, GMK: sárgahasú szavannacerkóf vesesejtek). A vírusok szaporítása szövettenyészeten a minta feldolgozás után szövettenyészetre való oltásával történik: a vírustartalmú minta-felülúszót a szövettenyészetet borító tápfolyadékhoz keverjük.

8 Mintafeldolgozás részletei (ahogy a gyakorlaton végezzük) Szervminta: 1. Olló és csipesz sterilizálása (a gyakorlat kezdete előtt megtörténik). 2. Kb. 1 g szervminta felaprítása 1-2 mm-es darabokra. 3. A szervdarabok dörzsmozsárba helyezése, és kb. 0,5 g steril kvarchomok hozzáadása. 4. A minta eldörzsölése ml steril antibiotikumos PBS hozzáöntése. 6. Összekeverés, kb. 1,2 ml szuszpenzió mikrocentrifuga csőbe töltése. 7. A minta baktérium-mentesítő centrifugálása (5000 g [7000 U/min], 5 perc). Tamponminta: 1. Csipesz sterilizálása (a gyakorlat kezdete előtt megtörténik). 2. A minta összekeverése vortex segítségével. 3. A tampon kicsavarása a csőbe csipesszel. 4. A folyadék mikrocentrifuga csőbe töltése. 5. A minta baktérium-mentesítő centrifugálása (5000 g [7000 U/min], 5 perc). Bélsárminta: 1. 1 g minta felhígítása 9 ml steril antibiotikumos PBS segítségével. 2. Összekeverés. 3. A szuszpenzió mikrocentrifuga csőbe töltése. 4. A minta baktérium-mentesítő centrifugálása (5000 g [7000 U/min], 5 perc) Szövettenyészet fertőzése vírustartalmú mintával A vírustartalmú minta (felülúszó) szövettenyészetre oltását többféleképpen is végezhetjük, ezek közül az adszorpciós és szuszpenziós technikák a legáltalánosabban használtak. Néhány különleges esetben, pl. látens fertőzés vagy érzékeny vírus kimutatása esetén, fertőzött és egészséges sejtek összekeverése révén (kokultiváció) lehet növelni a vírusizolálás esélyeit. Az adszorpciós technikát akkor alkalmazzuk, ha a minta toxikus a sejtekre nézve. Elhullott állatból származó szervminták toxikus anyagokat tartalmaznak (a szervek autolízise miatt), melyek a szövettenyészeten aspecifikus sejtkárosító hatást (non-specific cytophatic effect [CPE]) okoznak. A toxinok sejtkárosító hatásának elkerülésre a minta felülúszót a szövettenyészethez adjuk, majd rövid (kb. 30 perc) inkubációs idő után (eközben a vírusok adszorbeálódnak a sejtek felszínéhez, de a toxinok még nem károsítják a sejteket) a minta felülúszót eltávolítjuk a sejtek felszínéről.

9 A módszer lépésről lépésre: 1. A szövettenyészet ellenőrzése inverz mikroszkóppal. 2. A tápfolyadék eltávolítása mikropipetta segítségével (750 µl-es beállítással) µl inoculum (minta felülúszó) szövetre mérése. 4. Inkubáció: perc, szobahőmérséklet. 5. Mosás I: 750 µl PBS szövetre mérése, majd eltávolítása. 6. Mosás II: az 5. pont megismétlése µl (3 750 µl) fenntartó folyadék szövetre mérése. 8. A szövettenyészet inkubátorba helyezése. A szuszpenziós technikát akkor alkalmazzuk, ha a minta toxinmentes (pl. orrtampon minta), vagy ha olyan vírust gyanítunk a fertőzés hátterében, aminek nincsen virális polimeráz enzime, ezért osztódó sejteket igényel a szaporodáshoz. Az eljárás lépésről lépésre: 1. A szövettenyészet ellenőrzése inverz mikroszkóppal. 2. A tápfolyadék eltávolítása mikropipetta segítségével (750 µl-es beállítással). 3. Mosás I: 750 µl PBS szövetre mérése, majd eltávolítása. 4. Mosás II: 750 µl tripszin oldat szövetre mérése, majd eltávolítása. 5. Emésztés: 200 µl tripszin oldat szövetre mérése. 6. Inkubáció: 5 perc, szobahőmérséklet. 7. Az emésztés hatékonyságának ellenőrzése inverz mikroszkóppal µl tápfolyadék sejtekhez adása, sejtek szuszpendálása. (Pipettával felszívva-kifújva.) µl sejtszuszpenzió átmérése üres szövettenyésztő edénybe (negatív kontroll) µl (2 750 µl) tápfolyadék sejtekhez adása mindkét edénybe µl inoculum (minta felülúszó) sejtekhez adása. 12. A szövettenyészet inkubátorba helyezése Embrionált tyúktojás oltása Néhány vírus (főleg a madarakat fertőző vírusok) szaporításához embrionált tyúktojást is használhatunk. A tojásnak meghatározott kórokozóktól (pl. madárinfluenza, baromfipestis, salmonella) mentes állományból (specified pathogen free [SPF]) kell származnia. Ezek a tojások általában fehér héjúak, ami jó átvilágíthatósága révén lehetővé teszi a könnyebb lámpázást. A tojás oltása előtt mindig meg kell győződni arról, hogy az embrió él-e, megfelelő fejlettségi stádiumban van-e, illetve hol helyeződik el a tojásban. A tojás héját azon a területen, ahol oltani akarunk, jóddal, etanollal vagy formaldehiddel fertőtleníteni kell, hogy

10 a tojás felszínén előforduló baktériumok beszaporodását elkerüljük. A tojáshéj átfúrása injekciós tűvel, vagy oltólándzsával történik. A tojás oltása többféleképpen történhet, mivel a különféle vírusok az embrionált tyúktojás különböző részeiben találják meg a szaporodásukhoz legjobban megfelelő környezetet. A különböző oltásokhoz különböző fejlettségi állapotú tojásokat használunk. - Szikzsákba történő oltásra az 5-7 napos tojások alkalmasak: csirkék agy- és gerincvelő gyulladásának vírusa, madár Reovírusok, madár Adenovírusok. - Allantoisüregbe és amnionüregbe (embrióba) történő oltáshoz 9-12 napos tojásokat használunk: Orthomyxo-, Paramyxo- és Coronavírusok. - Chorioallantois hártyára (CAM) történő oltáshoz napos tojások alkalmasak: Pox-, Herpesvírusok. - Intravénás oltáshoz a napos embriók alkalmasak: Orbovírusok (pl. Bluetongue vírus). Az oltás után a héjon keletkezett lyukat parafinnal vagy ragasztóval zárjuk le a bakteriális fertőződés elkerülése érdekében, majd a tojásokat C-os inkubátorba helyezzük. Az embriókat naponta, lámpázással ellenőrizzük. Az embrió oltást követő 24 órán belüli elpusztulása nem vírusfertőzés következtében történik. Vírusokra jellemző elváltozások: nekropszia (az oltás utáni 4-5. napon), törpenövés, torzfejlődés, az embrió pusztulása. A chorioallantois hártyán a vírusok elszaporodását göbök, vérzések, és szövetelhalás jelzi. Amennyiben az egyes vírusokra jellemző elváltozások kialakulnak, vagy az embrió elpusztul, felbontjuk a tojásokat. A vírusszaporodás eredményéről az elváltozások vagy az allantoisfolyadék hemagglutinációja alapján győződhetünk meg. Az eljárás lépésről lépésre: 1. Tojáslámpázás: a légzsák, a nagy erek és az embrió helyeződésének és az oltás helyének bejelölése. 2. A tojáshéj fertőtlenítése Betadine oldatos papírvattával µl minta bemérése injekciós fecskendőbe. 4. A tojáshéj átszúrása injekciós tővel a légkamra felől. 5. A tű bevezetése az allantois üregbe (kb. 1,5-2 cm mélyen). 6. Az inoculum (minta felülúszó) allantois üregbe juttatása. 7. A tű eltávolítása, a lyuk lefedése ragasztószalaggal. 8. A tojás inkubátorba helyezése.