PROGENSA PCA3 Assay. Az eljárás alapelvei

Átírás

1 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra. Csak USA-ba történõ export esetén Tervezett felhasználás... 1 A teszt összefoglalása és magyarázata... 1 Az eljárás alapelvei... 1 Reagensek... 1 Anyagok... 3 Figyelmeztetések és óvatossági rendszabályok... 3 Tárolási és kezelési elõírások... 4 Mintagyûjtés, -szállítás és -tárolás:... 4 Teszteljárás... 5 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések... 7 Minõségellenõrzési eljárások... 8 Az eredmények magyarázata... 9 Korlátozások Teljesítményjellemzõk Irodalom Tervezett felhasználás A PROGENSA PCA3 Assay egy olyan in vitro nukleinsav-amplifikációs teszt (nucleic acid amplification test (NAAT)), amellyel férfitõl származó vizeletmintában ki lehet mutatni a prosztatarák 3-as génjének (Prostate Cancer Gene 3 (PCA3)) hírvivõ ribonukleinsavát (mrns) és PCA3 pontszámot lehet generálni. A PCA3 pontszámot a standard-of-care diagnosztikai algoritmusokkal kapcsolatban a prosztatarák diagnosztizálásának elõsegítésére szándékozzák alkalmazni. A teszt összefoglalása és magyarázata A szérumeredetû prosztataspecifkus antigénen (prostate-specific antigen (PSA)) alapuló teszt alkalmazása a prosztatarák szûrésére a kisebb, elõzõleg nem kimutatott daganatok biopsziával történõ diagnosztizálását eredményezte (1), új diagnosztizálási kényszerhelyezetet teremtve ezzel. Megnövekedett szérum PSA szintû férfiak csak egy részének van kimutatható prosztatarákja. A legalább egy negatív biopsziás férfiaknál gyakran lehet tapasztalni - fõként a megnagyobbodott prosztaták és a jóindulatú prostata hiperplasia (BPH) miatti - állandóan megnövekedett szérum PSA szintet. Mégis, az enyhén megemelkedett szérum PSA-t ( µg/l) mutató férfiak egy jelentõs részében már van, vagy ki fog fejlõdni klinikailag jelentõs prosztatarák (1). Bár a biopszia továbbra is a prosztatarák kimutatásának etalonja, jobb specificitású és pontosabb tesztekre van szükség a prosztata biopsziájához vezetõ döntések elõsegítéséhez. A PCA3 (másnéven "PCA3 DD3 " vagy "DD3 PCA3 ") egy, a prosztatára specifikus, nem kódoló mrns, amely a prosztatarák sejtjeiben jelentõs mértékben - a jóindulatú szövettel szemben átlagosan 66-szorosan - túlexpresszálódik (2). Ezzel szemben, a PSA génjének expressziója hasonló a rákos és jóindulatú sejtekben; a PSA mrns-ének szintjei ezért molekuláris eljárással tesztelni kívánt minták esetében alkalmazhatók a prosztatára specifikus ribonukleinsav (RNS) mennyiségének normalizálására. A vizeletbõl származó üledékek (2) és teljes vizelet (3) esetében már bemutatták a PCA3-on alapuló molekuláris mennyiségi tesztelés alkalmazhatóságát. A PROGENSA PCA3 Assay-ben, a digitális rektális vizsgálat (DRE) után, lebenyenként három nyomással gyûjtött teljes vizelet vizsgálatára kerül sor. A DRE által felszabadított prosztatasejtek a prosztata vezetékrendszerén át a húgyútba kerülnek, ahonnan vizsgálat után elõször vett vizelettel begyûjthetõk. A vizeletet a sejtek lízisét kiváltó és az RNS-t stabilizáló vizelettranszport-tápoldat (Urine Transport Medium (UTM)) hozzáadásáva dolgozák fel. Mennyiségileg meghatározzák a PCA3 és PSA mrns szintjét, és a PCA3/PSA mrns arány alapján meghatározzák a PCA3 pontszámot. A PCA3-jel normalizálása mellett, a PSA mrns-ének mérése szolgál annak igazolására is, hogy az érvényes eredményhez elegendõ mennyiségû PROGENSA PCA3 Assay prosztataspecifikus RNS-t sikerült kinyerni. Minél magasabb PCA3 pontszáma, annál nagyobb annak valószínûsége, hogy a prosztatabiopszia eredménye pozitív lesz. Az eljárás alapelvei A PROGENSA PCA3 Assay két, kvantitatív nukleinsav-amplifikációs tesztbõl áll. Az assay a célbefogás, a transzkripcióval közvetített amplifikálás (Transcription Mediated Amplification (TMA)), és hibridizációs védõvizsgálat (Hybridization Protection Assay (HPA) eljárásokat kombinálja a vizeletminták feldolgozásának, a célbavett mrns amplifikálásának, és az amplikon kimutatásának (megfelelõen) egyszerûsítésére. Amikor a laboratóriumban PROGENSA PCA3 Assay-t végeznek, a célbavett mrns-molekulákat célbefogással izolálják a vizeletmintákból. A célszekvencia specifikus régióival komplementer oligonukleotidokat ("befogó oligonukleotidok") hibridizálnak a tesztmintában lévõ célhoz. Az egyes célokra más-más befogó oligonukleotid alkalmaznak. A hibridizált célt ekkor mágneses mikroszemcséken befogják, és mágneses mezõ alkalmazásával elkülönítik a vizeletmintából. A reakciócsõbõl mosási lépésekkel távolítják el a felesleges komponeneseket. A célbefogó rendszerrel végzett mágneses elválasztás és mosási lépések következnek ezután. A cél amplifikációja két enzimet, a Moloney egérleukémia vírus (MMLV) reverz transzkriptázt és a T7 RNS polimerázt hasznosító, transzkripción alapuló nukleinsav-amplifikációs eljárással, a TMA-val, történik. Az egyes célokra egyedi láncindító-készletet alkalmaznak. Reverz transzkriptázzal (a T7 mrns polimerázhoz promóter szekvenciát tartalmazó) dezoxiribonukleinsav (DNS) kópiát készítenek a célszekvenciáról. A T7 RNS polimeráz több RNS-amplikon másolatot készít a templátként alkalmazott DNS-kópiáról. A kimutatás egyesszálú, kemilumineszcenciával jelzett és az amplikonnal komplementer nukleinsav-próbák alkalmazásával végzett HPA-val történik. Az egyes célbavett amplikonokra más-más próbát alkalmaznak. A jelzett nukleinsav-próbák specifikusan az amplikonnal hibridizálnak. A szelekciós reagens, a nem hibridizált próbákon lévõ jelzés inaktiválásával tesz különbséget a hibridizált és nem hibridizált próbák között. A kimutatási lépés során, a hibridizált próba által adott kemilumineszcens jelet luminométerben mérik és relatív fényenységként (Relative Light Units (RLU)) feljegyzik. A PCA3 és PSA mrns-eket külön csõvekben kvantifikálják és meghatározzák a PCA3 pontszámot. Minden mérésben kalibrátorként vannak ismert mennyiségû PCA3 vagy PSA RNS-transzkriptumok is, amelyeket a standard görbe elkészítésére használnak. A mérésben PCA3 és PSA kontrolok is szerepelnek a standard görbe alapján interpolált eredmények pontosságának ellenõrzésére. Reagensek A PROGENSA PCA3 Assayhoz a PCA3/PSA Assay készlethez adott reagenseket és anyagokat az alábbiakban soroljuk fel. Az egyes reagenseket azonosító szimbólumok a kérdéses reagens neve mellett vannak feltüntetve HU Rev. C

2 Reagensek PROGENSA PCA3/PSA Molekuláris Vizeletvisgálati Készlet, 2 x 100 reakció, kat. sz (8 doboz) PROGENSA PCA3 100-reakciókészlet (2 doboz) PROGENSA PCA3 Hűtött doboz 2 C és 8 C közötti hőmérsékleten tárolni Szimbólum Komponens Menny. Leírás A E P PCA3 amplifikációs reagens PCA3/PSA Enzimreagens PCA3 Próba reagense 1 x 100 reakció 1 x 100 reakció 1 x 100 reakció Nem fertõzõ nukleinsav HEPES-sel pufferelt, <10% térfogatnövelõt tartalmazó oldatban szárítva Reverz transzkriptáz és RNS polimeráz HEPES-sel pufferelt, <10% térfogatnövelõt tartalmazó oldatban szárítva Nem fertõzõ, kemilumineszcens DNSpróbák szukcináttal pufferelt, <5% térfogatnövelõt és <5% litium-laurilszulfátot tartalmazó oldatban szárítva PROGENSA PCA3 Szobahőmérsékletű doboz 15 C és 30 C közötti hőmérsékleten tárolni Szimbólum Komponens Menny. Leírás AR ER PR S TCR PCA3 amplifikáció helyreállító oldat PCA3/PSA enzimhelyreállító oldat PCA3/PSA próba helyreállító oldata PCA3/PSA szelekciós reagens PCA3 Célbefogó reagens 1 x 9,3 ml 1 x 3,3 ml 1 x 12,4 ml 1 x 31 ml 1 x 22 ml Légmentessen záró kártyák 1 csomag Helyreállító bilincsek 1 csomag Tartósítószereket (<1% parabének) tartalmazó vizes oldat HEPES-sel pufferelt, felületaktív anyagot (10% Triton X-100) és 20% glicerint tartalmazó oldat Szukcináttal pufferelt, <5% litium-laurilszulfátot tartalmazó oldat. Boráttal pufferelt, felületaktív anyagot (1% Triton X-100) tartalmazó oldat Nem fertõzõ nukleinsav, szilárd fázist (<0.5 mg/ml) tartalmazó, HEPES-sel pufferelt oldatban PROGENSA PCA3 Kalibrátor és Kontrolokat tartalmazó készlet 2 C és 8 C közötti hőmérsékleten tárolni Szimbólum Komponens Menny. Leírás CAL CAL PC PCA3 Kalibrátor 1 1 x 2,0 ml PCA3 Kalibrátor x 1,7 ml PCA3 pozitív kontrolok 2 x 1,7 ml Foszfáttal pufferelt, <5% litium-laurilszulfátot tartalmazó oldat. Nem fertõzõ PCA3 nukleinsav foszfáttal pufferelt, <5% litiumlaurilszulfátot tartalmazó oldatban Nem fertõzõ PCA3 nukleinsav foszfáttal pufferelt, <5% litiumlaurilszulfátot tartalmazó oldatban PROGENSA PSA 100 Reakciókészlet (2 doboz) PROGENSA PSA Hűtött doboz 2 C és 8 C közötti hőmérsékleten tárolni Szimbólum Komponens Menny. Leírás A E P PSA Amplifikációs reagens PCA3/PSA Enzimreagens PSA próba reagense 1 x 100 reakció 1 x 100 reakció 1 x 100 reakció Nem fertõzõ nukleinsav HEPES-sel pufferelt, <10% térfogatnövelõt tartalmazó oldatban szárítva Reverz transzkriptáz és RNS polimeráz HEPES-sel pufferelt, <10% térfogatnövelõt tartalmazó oldatban szárítva Nem fertõzõ, kemilumineszcens DNSpróbák szukcináttal pufferelt, <5% térfogatnövelõt és <5% litium-laurilszulfátot tartalmazó oldatban szárítva PROGENSA PSA Szobahőmérsékletű doboz 15 C és 30 C közötti hőmérsékleten tárolni Szimbólum Komponens Menny. Leírás AR ER PR S TCR PSA amplifikáció helyreállító oldat PCA3/PSA enzimhelyreállító oldat PCA3/PSA próba helyreállító oldata PCA3/PSA szelekciós reagens PSA Célbefogó reagens 1 x 9,3 ml 1 x 3,3 ml 1 x 12,4 ml 1 x 31 ml 1 x 22 ml Tartósítószereket (<1% parabének) tartalmazó vizes oldat HEPES-sel pufferelt, felületaktív anyagot (10% Triton X-100) és 20% glicerint tartalmazó oldat Szukcináttal pufferelt, <5% litium-laurilszulfátot tartalmazó oldat. Boráttal pufferelt, felületaktív anyagot (1% Triton X-100) tartalmazó oldat Nem fertõzõ nukleinsav, szilárd fázist (<0.5 mg/ml) tartalmazó, HEPES-sel pufferelt oldatban Légmentessen záró kártyák 1 csomag Helyreállító bilincsek 1 csomag PROGENSA PSA Kalibrátor és Kontrolokat tartalmazó készlet 2 C és 8 C közötti hőmérsékleten tárolni Szimbólum Komponens Menny. Leírás CAL Foszfáttal pufferelt, <5% PSA Kalibrátor 1 x 2,0 ml litium-laurilszulfátot 1 tartalmazó oldat. CAL PC PSA Kalibrátor x 1,7 ml PSA-ra pozitív kontrolok 2 x 1,7 ml Nem fertõzõ PSA nukleinsav foszfáttal pufferelt, <5% litiumlaurilszulfátot tartalmazó oldatban Nem fertõzõ PSA nukleinsav foszfáttal pufferelt, <5% litiumlaurilszulfátot tartalmazó oldatban APTIMA Assay folyadékok 15 C és 30 C közötti hõmérsékleten tárolni (2 doboz) Szimbólum Komponens Menny. Leírás HEPES-sel pufferelt, <2% nátriumdodecilszulfátot W Mosóoldat 2 x 402 ml tartalmazó oldat DF Deaktiváló folyadék puffere 2 x 402 ml Bikarbonáttal pufferelt oldat O Olaj reagens 2 x 24,6 ml Szilikonolaj HU Rev. C

3 Anyagok Megjegyzés: A PROGENSA PCA3/PSA Assay Készlet részét képező minden anyag külön-külön is beszerezhető (részletesen ld. az "Anyagok" című részt). Anyagok Megjegyzés: A Gen-Probe-től beszerezhető anyagoknál feltüntettük a vonatkozó katalógusszámokat. Szükséges, de a készlet részét nem képző anyagok PROGENSA PCA3 Vizeletminta-készlet (kat. sz ) GEN-PROBE LEADER HC+ Luminométer (kat. sz ) GEN-PROBE Célbefogó-rendszer (Target Capture System (TCS)) (kat. sz ) APTIMA Automata kimutatási készlet (kat. sz ) 2 db. eppendorf Repeater Plus pipettor (kat. sz ) Hegyek az ismétlõ pipettorhoz (2,5 ml, 5,0 ml, 25,0 ml) Vagy: 2 db. Többcsöves vortexkeverõ (kat. sz F) 3 db. keringetõ vízfürdõ (62 C ± 1 C, 42 C ± 1 C, 62 C ± 1 C) (kat. sz F) 3 db. vízfürdőbetét (kat. sz ) Vagy: 2 db. SB100 Dry Heat Bath/Vortexer (kat. sz F) (További SB100 berendezések igényelhetõk a kívánt átbocsátó képesség függvényében) Mikropipettor, 1000 µl RAININ P1000 (kat. sz ) Hegyek, 1000 µl RAININ P1000 (kat. sz ) Pipettor, eppendorf µl (kat. sz ) Pipettahegyek, µl Fehérítő (minimum 5,25%-os vagy 0,7 M-os nátrium-hipoklorit oldat) Nagyfedelű műanyagtartály Standard vizeletgyűjtő-edények, tartósítószer nélkül Tízcsöves egységek (Ten Tube Units (TTU)) (kat. sz. TU0022) Tízhegyes kazetták (Ten Tip Cassettes (TTC)) (kat. sz ) SysCheck tipus kalibrálás (kat. sz ) Választható anyagok PROGENSA PCA3 100-Reakciókészlet (kat. sz ) PROGENSA PSA 100-Reakciókészlet (kat. sz ) PROGENSA PCA3 Kalibrátorok és kontrolkészlet (kat. sz ) PROGENSA PSA Kalibrátorok és kontrolkészlet (kat. sz ) PROGENSA PCA3/PSA Proficiency Panels készlet (kat. sz ) PROGENSA PCA3/ Mintahígító-készlet (kat. sz ) APTIMA Vizsgálati folyadékkészlet (kat. sz C) TECAN Freedom EVO 100/4 (Kat. sz ) PCA3 Deck Plate szerelvény, DTS 800 (Kat. sz ) Reagensgyűjtő (40 ml, negyed modul) (Kat. sz. : ) Kiömlött reagensek gyűjtője (19 ml x 2 negyed modul) (Kat. sz. : ) Szállítócsövek (Kat. sz ) Szűrővel ellátott, eldobható pipettahegyek (1 ml) (Tecan sz ) Csere átszúrható kupakok (Kat. sz ) Csere, nem átszúrhatatlan kupakok (Kat. sz A) Figyelmeztetések és óvatossági rendszabályok A. In Vitro diagnosztikai alkalmazásra. B. Csak US-ba történő export esetén. A laboratórium C. Csak a mellékelt vagy részletesen meghatározott eldobható laboratóriumi felszerelés alkalmazható. D. A szokásos laboratóriumi elővigyázat szükséges. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a kijelölt munkaterületeken. A vizeletminták, és a készlet reagenseinek kezelésekor viseljen eldobható, pormentes kesztyűt, védőszemüveget és laboratóriumi köpenyt. A vizeletminták, és a készlet reagenseinek kezelése után gondosan mosson kezet. E. Figyelem: Irritáló- és maró hatású anyagok. Az 1. és 2. Auto Detect reagens lehetőleg ne ne jusson a bőrre, szembe vagy nyálkahártyára. Amennyiben e folyadékok érintekezésbe kerülnének az Ön bőrével vagy szemeivel, az érintett területet mossa le vízzel. Ha ezek a folyadékok lecseppennének, szárazra törlés előtt vízzel kell hígítani. F. A munkafelületeket, pipettorokat és más berendezést 2,5% - 3,5%- os (0,35 M - 0,5 M-os) nátrium-hipoklorittal (fehérítőoldat) rendszeresen dekontaminálni kell (ld. Eljárásokkal kapcsolatos megjegyzések). G. Az amplifikáció utáni munkaszakaszokhoz egy elkülönült terület kialakítása javallott a vizsgálatban fennálló amplikon-kontamináció veszélyének minimalizálása céljából. Ennek a területnek távol kell esnie az amplifikációt megelőző munkszakaszokhoz kijelölt területtől, ahol a reagensek előkészítése, célbefogás és az amplifikáció történik. H. A laboratóriumi területek amplikonnal való kontaminálódásának elkerülése céljából, a laboratóriumi területetre a reagensek előkészítésétől az amplifikáció után tartó, egyirányú munkafolyamatot kell szervezni. Vizeletmintákat, felszerelést és reagenseket nem szabad visszavinni az előző lépés elvégzésének területére. Továbbá, a személyzet a megfelelő kontaminációs biztonsági intézkedések nélkül ne mozogjon vissza a megelőző munkaterületekre. A minták I. A vizelet hozzáadása után, a vizeletminta szállítócsövében a folyadék szintjének a csövön feltüntetett két fekete indikátorvonal közé kell esnie. Máskülönben, a mintát ki kell zárni. J. A vizeletminta integritásának megőrzése céljából a szállítás során megfelelő tárolási körülményeket kell fenntartani. A vizeletminta stabilitását nem értékeltük a javasolttól eltérő szállítási körülmények között. K. A gyűjtőkészleten feltüntetett lejárati idők a gyűjtőhelyre és nem a tesztelőhelyre vonatkoznak. A gyűjtőkészlet lejárati ideje előtt, a csomagolási mellékletben leírtak szerint gyűjtött, szállított és tárolt minták tesztelésre alkalmasak, még akkor is, ha a gyűjtőcső lejárati ideje már letelt. L. Az összes vizeletmintát a megadott hőmérsékleten kell tárolni. A nem kielégítően tárolt vizeletminta használata befolyásolhatja vizsgálat kimenetelét. A vonatkozó speciális utasítások a "Mintagyűjtés, -szállítás és -tárolás" című részben vannak leírva. M. A vizeletminták fertőzőek lehetnek. A vizsgálat végrehajtására az általános elővigyázatossági szabályok vonatkoznak. A helyes kezelési és elhelyezési eljárásokat a laboratórium vezetőjének kell kialakítania. Csak a PROGENSA PCA3 Assay alkalmazásában megfelelően jártas és fertőző anyagok kezelésére kiképzett személyzet végezheti ezt az eljárást. N. A vizeletminták kezelésekor el kell kerülni a kerersztkontaminációt. A vizeletminták nagy mennyiségű célbavett mrns-t tartalmazhatnak. Győződjön meg arról, hogy a vizeletminták nem érintkeznek-e egymással, és a használt anyagokat úgy dobja ki, hogy azok ne jussanak nyitott tartályok fölé. Amennyiben kesztyűje érintkezésbe lépne valamelyik vizeletmintával, a keresztkontamináció elkerülése végett vegyen fel egy másik kesztyűt. A vizsgálatra vonatkozóan O. Lejárati idõ után tilos a készletet használni. P. A PROGENSA PCA3 Assay készlet esetében ne cserélje fel, ne keverje és ne kombinálja a különböző tételszámú PCA3 vizsgálati reagenseket (pl. az egyes analitok esetében a vizsgálati reagensek a hűtött dobozban és a szoba-hőmérsékletű dobozban ugyanabból a tételből kell, hogy származzanak). A vizsgálati reagensek használhatók a különböző tételszámú kalibrátor- és kontrollkészletekkel. Az APTIMA Assay folyadékok készletei felcserélhetők. Nem szükséges, hogy a PCA3 és PSA reagenskészletek összeillőek legyenek. Q. Az összes vizsgálati reagenst a megadott hõmérsékleten kell tárolni. A nem kielégítõen tárolt vizsgálati reagensek használata befolyásolhatja vizsgálat kimenetelét. Részletes információk a "Tárolási és kezelési elõírások" és az "Eljárással kapcsolatos megjegyzések" címû részben vannak leírva. R. A vizsgálat deaktiválásához (ld. Teszteljárás) a fehérítõ minimális koncentrációja - a deaktivációs pufferrel történt 1:1 arányú hígítás után - 2,6% (0,35 M) nátrium-hipoklorit. Ennélfogva, a kiindulási fehérítõben minimum 5,25% (0,7 M) nátrium-hipokloritnak kell lennie a deaktiváláshoz elõírt végsõ koncentráció eléréséhez. S. Hidrofób filterrel ellátott hegyeket kell használni. Ehhez a vizsgálathoz legalább két pipettort kell kijelölni: az egyiket az amplifikációt megelõzõ lépésekhez, a másikat pedig az amplifikációt követõ lépésekhez. Egy mikropipettort kell kijelölni a HU Rev. C

4 Mintagyûjtés, -szállítás és -tárolás: mintaátvitelhez. Mindegyik pipettort rendszeresen tisztítani kell az "Eljárással kapcsolatos megjegyzések" címû részben leírtak szerint. T. Amennyiben a reagensek hozzáadásához ismétlõ pipettort alkalmaz, ne érintse meg a reakciócsövet a pipettor hegyével az egyik csõbõl a másikra való átvitel megelõzése végett. U. A pontos vizsgálati eredményekhez megfelelõ keverés szükséges. Részletesen ld. az "Eljárással kapcsolatos megjegyzések" címû részt. V. Külön-külön vízfürdõt kell kijelölni a vizsgálat amplifikációt megelõzõ, amplifikációs és amplifikáció utáni lépéseihez. W. A készlet néhány reagense az 1999/45/EC Európai Direktíva szerinti biztonsági jelzésekkel van jelölve, és ezeket ennek megfelelõen kell kezelni. A biztonsági adalapok a honlapon megtekinthetõk és igény esetén elérhetõk. Tárolási és kezelési elõírások A. A reagensek tárolásával kapcsolatos információk az 1. táblázatban találhatók. 1. Táblázat: Reagensek tárolása Reagens/Folyadék Amplifikációs reagensek Próba reagensei Enzimreagens Célbefogó-reagens Amplifikációs oldat Oldat a próba helyreállításához Oldat az enzim feloldásához Szelekciós reagens Kalibrátorok Kontrolok Olaj reagens Mosóoldat Deaktiváló folyadék puffere Fel nem nyitott állapotban való tárolás 2 C - 8 C, a lejárati dátumig 2 C - 8 C, a lejárati dátumig 2 C - 8 C, a lejárati dátumig 15 C - 30 C, a lejárati dátumig 2 C - 30 C, a lejárati dátumig 2 C - 30 C, a lejárati dátumig 2 C - 30 C, a lejárati dátumig 2 C - 30 C, a lejárati dátumig 2 C - 8 C, a lejárati dátumig 2 C - 8 C, a lejárati dátumig 15 C - 30 C, a lejárati dátumig 15 C - 30 C, a lejárati dátumig 15 C - 30 C, a lejárati dátumig Nyitott/oldott anyagok stabilitása (a lejárati dátumig) 2 C - 8 C-on 30 nap* 2 C - 8 C-on 30 nap* 2 C - 8 C-on 30 nap* 15 C - 30 C-on 30 nap N/A (egyszeri használatra) N/A (egyszeri használatra) N/A (egyszeri használatra) 15 C - 30 C-on 30 nap N/A (egyszeri futtatásra) N/A (egyszeri futtatásra) 15 C - 30 C-on 30 nap 15 C - 30 C-on 30 nap 15 C - 30 C-on 28 nap * További vizsgálatokhoz maximum négyszer használható fel újra, amennyiben nem volt négy órát meghaladó ideig szobahõmérsékleten. B. A célbefogó-reagenst nem szabad 15 C alatti hõmérsékleten tárolni. C. A próbareagens és a feloldott próbareagens fényérzékeny. Ezeket a reagenseket a tárolás és a felhasználásra való elõkészítés során nem szabad hosszabb ideig fénynek kitenni. D. A reagenseket nem szabad lefagyasztani. E. Ne alkalmazzon lejárt szavatossági idejû reagenseket vagy folyadékokat. F. ía PROGENSA PCA3 és PSA kalibrátorok és kontrolok egyszerhasználatos fiolákban vannak és ezeket a felhasználás után ki kell dobni. G. A leszállított reagens fizikai megjelenésében bekövetkezett változások az abban lévõ anyagok instabilitására vagy lebomlására utalhatnak. Amennyiben a reagensek fizikai megjelenésében bekövetkezett változások a felszuszpendálás után figyelhetõk meg (például, a reagens színében bekövetkezõ egyértelmû változás vagy mikrobiális kontaminációt jelzõ felhõsödés), a felhasználás elõtt lépjen érintkezésbe a Gen-Probe Mûszaki Tanácsadószolgálatával. H. Felnyitott vagy feloldott reagensek visszamaradt része alkalmazható a további vizsgálatokban, amennyiben azokat a kezdeti felhasználás után megfelelõképpen tárolták. A visszamaradt reagens csak akkor önthetõ össze a frissen készítettel vagy más visszamaradt reagenssel, ha azok ugyanabból a tételbõl származnak. Ne cserélje, keverje vagy kombinálja a különbözõ tételszámú készletekbõl származó reagenseket. Az összeöntött reagensek egyikének szavatossági ideje sem haladhatja meg a felnyitott vagy feloldott tárolásra megadott lejárati idõt. Gyõzõdjön meg arról, hogy gondosan összekeverte-e az összeöntött reagenseket, és hogy a teljes vizsgálat lefuttatására elegendõ mennyiséget készített-e. Mintagyûjtés, -szállítás és -tárolás: A PROGENSA PCA3 Assay-t a DRE után, lebenyenként három nyomással gyűjtött első vizeletben a PCA3 és PSA mrns mennyiségi vizsgálatára tervezték. A vizeletet a PROGENSA PCA3 Vizeletminta készlet alkalmazásával kerül feldolgozásra. A PCA3 és PSA mrns vizeletben és feldolgozott vizeletben való stabilitásának megállapítása a mrns-kópiák szintjének az alábbi utasítások szerint gyűjtött vizletmintákban nyomonkövetésével történik. A. Utasítások a vizeletminta-gyûjtésére és feldolgozására: 1. A gyûjtésre elegendõ vizeletmennyiség biztosítását elõsegítheti, ha a beteget nagy mennyiségû (körülbelül 500 ml) víz fogyasztására kéri fel. 2. Közvetlenül a vizeletgyûjtés elõtt végezze el a DRE-t az alábbiak szerint: Nyomja meg a prosztatát annyira, hogy az egyes lebenyek felszínét körülbelül 1 cm-re benyomja az alaptól az apexig és oldalról a középvonalig (ld. 1. ábra). Az egyes lebenyeket pontosan háromszor nyomja meg. Ez nem prosztatamasszírozás. Bal lebeny Alap Jobb lebeny Apex 1. Ábra. A prosztata helyes nyomási iránya 3. A DRE után, a beteget fel kell szólítani az elsõ vizelet (a meginduló vizelet elsõ, körülbelül ml-e) ürítésére egy megfelelõen jelzett vizeletgyûjtõ-pohárba. Ennek feltétlenül a DRE-t követõ elsõ ürített vizeletmintának kell lennie. Tartósítószert nem tartalmazó gyûjtõpoharat kell alkalmazni. Amennyiben a beteg nem tudná abbahagyni a vizelés és a szükséges elsõ ml-nél többt ürít, akkor a teljes mennyiséget meg kell tartani. Elõfordulhat, hogy a beteg nem tudja az elõírt mennyiségû vizeletet üríteni. Ilyenkor azt kell figyelembe venni, hogy PROGENSA PCA3 Assay-hez legalább 2,5 ml-re van szükség, és ennyit azért mindenképpen gyűjteni kell. 4. Az eljárásnak alá nem vetett vizeletmintát - ha nem kerül azonnal feldolgozásra - 2 C - 8 C között kell kezelni, vagy jégen kell tartani. A hûtött, fel nem dolgozott vizeletmintát a gyûjtéstõl számított négy órán belül a vizeletmintaszállítócsõbe kell transzferálni. A fel nem dolgozott vizeletmintát tilos lefagyasztani. 5. A vizeletminták feldolgozásához, zárja le szorosan a kupakot és csövet ötször le és fel fordítva szuszpendálja fel a sejteket. Vegye le a kupakot a vizeletminta-szállítócsőről és a begyűjtött vizeletmintából a mellékelt eldobható transzferpipetta alkalmazásával mérjen be 2,5 ml-t a csőbe. Akkor van elegendõ mennyiségû vizelet a csõben, ha a folyadék szintje a vizeletminta-szállítócsövön feltüntetett fekete töltõvonalak közé esik. 6. Ismét zárja le szorosan a vizeletminta-szállítócsövet és vizeletmintát ötször le és fel fordítva keverje össze. Ez az, amit feldolgozott vizeletmintának nevezünk HU Rev. C

5 Teszteljárás B. Tesztelés elõtti mintaszállítás és -tárolás: 1. A feldolgozott vizeletmintákat a vizeletminta-szállítócsõben, vagy 30 C alatti hõmérsékleten (esetleg lefagyasztva) kell a laboratóriumba szállítani. A szállítást úgy kell idõzíteni, hogy a feldolgozott vizeletminták a gyûjtéstõl számított öt napon belül mindenképpen beérkezzenek a tesztelés helyére. A szállítmány beérkezésekor, a laboratórium a mintát 2 C-8 C hõmérsékleten akár 14 napig is tárolhatja (a megsemmisítésig). Amennyiben hosszab idõre van szükség, a vizletmintákat -20 C-os vagy az alatti hõmérsékleten maximum 90 napig lehet tárolni. A 2. táblázat megadja a különféle hõmérsékletre vonatkozó tárolási idõtartamokat Peel He re Tábláza\t: A feldolgozott vizeletminta tárolhatósága 45 Tárolási hõmérséklet Feldolgozott minta tárolása és szállítása Idõ 8 C - 30 C maximum 5 nap* A tesztelési helyre való megérkezés után 2 C - 8 C maximum 14 nap -20 C vagy az alatti *Szállítmányok esetében a 30 C-nál vagy az alatti hõmérsékleten engedélyezett idõtartam. maximum 90 nap 2. A feldolgozott vizeletmintákat maximum ötször lehet lefagyasztani és kiolvasztani. C. Tesztelés utáni mintatárolás 1. A vizsgált vizeletmintákat függõleges helyzetben kell egy csõtartóban tárolni. 2. Intakt kupakkal vissza nem zárt vizeletminta-szállítócsöveket új, tiszta mûanyagfóliával kell lefedni. 3. Amennyiben a vizsgált mintákat fagyasztani vagy szállítani kell, távolítsa el az átszúrható kupakot és tegyen fel új, nem átszúrható kupakokat a vizeletminta-szállítócsövekre. Amennyiben a vizeletmintákat a teszteléshez át kell szállítani egy másik létesítménybe, a javasolt hõmérsékleteket fenn kell tartani. Kerülje el a lecsepegést és a keresztkontaminációt. Megjegyzés: Az vizeletminták szokásos földi vagy légi szállítása esetén a Nemzetközi Légifuvarozási Szövetség (International Air Transportation Association (IATA)) P1650 sz. elõirásai az irányadók. Teszteljárás A. A munkaterület elõkészítése 1. Állítsa be az egyik vízfürdõt 62 C ± 1 C-ra a preamplifikáláshoz, egy másikat 42 C ± 1 C-ra az amplifikáláshoz és a haramdikat pedig 62 C ± 1 C-ra a posztamplifikáláshoz. Gyõzõdjön meg arról, hogy elegendõ víz vane a vízfürdõkben (ld. az "Eljárással kapcsolatos megjegyzések" címû részt). SB100 Dry Heat Bath/Vortexer használata esetén tekintse át az SB100 Dry Heat Bath/Vortexer PROGENSA PCA3 Assay-ben történõ alkalmazásával kapcsolatos használati utasítást. 2. A vizsgálat megkezdése elõtt, 2,5%-3,5%-os (0,35 M - 0,5 M) nátriumhipoklorit-oldattal (fehérítõoldat) törölje le a munkafelületeket és a pipettorokat. A fehérítõoldatot legalább egy percig hagyja rajta a felületeken és a pipettorokon, majd vízzel öblítse le. Ne hagyja a fehérítõoldatot megszáradni. A teszt elvégzésére biztosított felületet fedje le mûanyag hátlapos laboratóriumi fedõpapírral. 3. Helyezzen elegendõ számú tízhegyes kazettát a célbefogórendszerbe (Target Capture System (TCS)). Gyõzõdjön meg arról, hogy a TCS mosóüvege meg van-e töltve mosóoldattal és az aspirátor rá van-e csatlakoztatva a vákuumpumpára. (ld. a Célbefogó-rendszer Mûködtetési Kézikönyvét). B. A reagensek feloldása és elõkészítése A reagenseket a mintatranszfer megkezdése elõtt kell feloldani. 1. Az amplifikációs-, enzim- és próbareagensek feloldásához csatlakoztassa a liofilizált reagens üvegét a feloldásra használt oldathoz. Amennyiben a helyreállító-oldat elõzõleg hûtve volt, hagyni kell azt szobahõmérsékletre felmelegedni. 2. Ábra: A helyreállítási folyamat a. Párosítsa a megfelelõ helyreállító-oldatot az ahhoz tartozó szárított reagenssel. Ellenõrizze, hogy a fiolákon a helyes párosítást biztosító azonos jelzõszín van-e. b. Nyissa ki a szárított reagenst tartalmazó fiolát és óvatosan illessze a helyreállító gallér hornyolt véget a fiola nyílásához (2. ábra, 1. lépés) c. Nyissa ki az ahhoz tartozó helyreállító-oldatot és tegye a kupakot egy tiszta, letakart felületre. Tartsa az oldat üvegét az asztalon, és óvatosan illessze be a helyreállító gallér másik végét az üvegbe (2. ábra, 2. lépés). d. Lassan fordítsa fel az összeállított üvegeket. Hagyja az oldatot lecsepegni az üvegbõl az üvegfiolába (2. ábra, 3. lépés). Várjon addig, amig a liofilizált reagens feloldódik, majd óvatos körkörös mozdulatokkal keverje össze az üvegfiolában lévõ oldatot. Az üveg körkörös mozgatása közben a habképzõdést el kell kerülni (2. ábra, 4. lépés). e. Fordítsa fel az összeállított üvegeket és a habképzõdés minimílizálása céljából tartsa 45 -os szögben (2. ábra, 5. lépés). Hagyja, hogy az összes folyadék visszacsepegjen a mûanyagpalackba. f. Távolítsa el a helyreállító gallért és az üvegfiolát (2. ábra, 6. lépés). g. Tegye vissza a kupakot a mûanyagpalackra, majd húzza le és dobja ki a palack tetején lévõ jelzést (2. ábra, 7. lépés). A palackon lévõ maradék címkén tüntesse fel az operátor nevének kezdõbetûit, a helyreállítás idõpontját, a liofilizált reagens tételszámát, az amplifikációra szánt analitkumot és próbareagenseket. h. Dobja ki a helyreállító gallért és az üvegfiolát (2. ábra, 8. lépés). i. a helyreállított reagens 30 nap elteltével vagy a szavatossági idõ lejártakor (attól függõen, hogy melyik van elõbb) ki kell dobni. 2. A korábban helyreállított próba-, amplifikációs- és enzimreagenseknek a vizsgálat megkezdésekor szobahőmérsékletűnek (15 C - 30 C) kell lennie. A visszamaradt reagensek összeöntésére vonatkozóan ld. a "Tárolási és kezelési előírások" című részt. Amennyiben a helyreállított amplifikációs reagens szobahőmérsékleten fel nem oldódó csapadékot tartalmaz, melegítse fel a reagenst 62±1 C-ra 1-2 percre a pre-amplifikációs területen. Amennyiben a helyreállított próbareagens szobahőmérsékleten fel nem oldódó csapadékot tartalmaz, melegítse fel a reagenst 62±1 C-ra 1-2 percre a posztamplifikációs területen. A melegítési lépés után, a helyreállított reagensek még akkor is használható, ha maradt benne csapadék. Ismételt szuszpendálás után, a fiola tartalmát óvatos fel-le fordítással keverje össze. C. A tartóállvány elrendezése A célbefogásra, mintaátvitelre és amplifikációra használt ismétlõ pipettorral más mûveletet nem szabad végezni (ld. a "Figyelmeztetések és óvatossági rendszabályok" címû részt). 1. Állítson be egy állványt a PCA3-vizsgálatnak és egy másikat a PSA-vizsgálatnak. Megjegyzés: Kevésszámú tesztminta esetén, mindkét vizsgálat egyetlen álványon futtatható. TECAN Freedom EVO 100/4 berendezés alkalmazása esetén, minden egyes analitikumnak külön állványt kell fenntartani. Egyidejűleg maximum két teli állványt (20 TTU-t) szabad tesztelni HU Rev. C

6 Teszteljárás 2. A tizcsöves egység (Ten Tube Unit (TTU)) állványába tegyen az egyes vizsgálatoknál használt kalibrátorok, kontrolok és tminták számának megfelelõ mennyiségû TTU-t. 3. A TTU-kat a minta/fajta azonosítóknak megfelelõ jelzéssel lássa el. A 3. táblázat leírja a kalibrátorok, kontrolok és tminták hozzáadását. A PSA kalibrátorokat új TTU-n indítsa el. Megjegyzés: A kalibrátorokat háromszoros, a kontrolokat pedig kétszeres ismétlésben szokás futtatni, és a futtatást a tesztmintákkal együtt, ugyanazon az állványon kell végezni. A tmintákat kétszeres ismétlésben kell futtatni. Ne tegyen üres csöveket a kalibrátorok, kontrolok és vizeletminták közé. TECAN Freedom EVO 100/4 berendezés esetén, további információkért nézze át a TECAN Freedom EVO 100/4 PROGENSA PCA3 Assay-ben való alkalmazásának leírását (TECAN Freedom EVO alkalmazási leírás). 3. Táblázat: Példa az állvány összeállítására Hely az állványban Minta leírása *Cél PCA3 koncentrációja (c/ml) kalibrátor kalibrátor kalibrátor *Cél PSA koncentrációja (c/ml) kalibrátor kalibrátor "A" kontrol "B" kontrol n Tesztminta ismeretlen ismeretlen *Az "A" és "B" PCA3- és PSA-pozitív standardok és kontrolok adott értékûek, így a 2-5. kalibrátorok és az "A" illetve "B" kontrolok aktuális c/ml értékei a táblázatban felsorolt célkoncentrációktól kissé eltérhetnek és tételenként változhatnak. A megadott értékek a kalibrátor- és kontrol fiolákat tartalmazó csomagban lévõ kártyán vannak feltüntetve, és ezeket a fiolákat a kalibrációra és a futtatás érvényességének meghatározására alkalmazzuk. D. A koncentrációra vonatkozó adatok ellenõrzése Minden PROGENSA PCA3 és PSA kalibrátor- és kontrol készlethez mellékelt adatlapon megadott koncentrációadatok alkalmazásával a rendszer adminisztrátorának a vizsgálat megkezdése elõtt be kell léptetnie és ellenõriznie kell az egyes tételek koncentrációira vonatkozó adatokat a PROGENSA PCA3 Assay szoftverébe. További információk a PCA3 Assay szoftverrendszerének kézikönyvében találhatók. Megjegyzés: A koncentrációk ellenõrzésére az egyes új kalibrátor- és kontrolkészlet tételek elsõ alkalmazása elõtt kell sort keríteni. Ugyanabból a készlettételbõl származó kalibrátorok és kontrolok alkalmazásával végzett rákövetkezõ futtatásoknál nincs szükség további ellenõrzésre. E. Worklist Editor (Munkalista-szerkesztõ) beállítása Az amplifikáció elõtti (=preamplifikációs) területen elhelyezett számítógépre installált GEN-PROBE Worklist Editor programmal készítsen egy, a vizsgálat futtatásához szükséges munkalistát (worklist). A Worklist Editor használata a "GEN-PROBE Worklist Editor kezelõi kézikönyvében" van leírva. TECAN Freedom EVO 100/4 berendezés alkalmazása esetén a további információkért ld. a TECAN Freedom EVO alkalmazási leírását. F. A minta előkészítése 1. A tesztelés elõtt a kalibrátoroknak és a kontroloknak szobahõmérsékletûre kell felmelegedniük. A fiola tartalmát keverje össze óvatos le-felfordítással. 2. A tesztelés elõtt a feldolgozott vizeletmintáknak szobahõmérsékletûre kell felmelegedniük. Tilos a vizeletmintákat vortexelni. A melegítés alatt a mintákat keverje össze alkalmankénti óvatos le-felrázással. A nem oldódó csapadékokkal és a fagyasztott minták kezelésével kapcsolatban lásd Az eljárással kapcsolatos megjegyzéseket. G. Preamplifikáció A preamplifikációs környezet hõmérsékletének 15 C és 30 C közöttinek kell lennie. Mindkét tartóállványt párhuzamosan kell futtatni. SB100 Dry Heat Bath/Vortexer használata esetén tekintse át az SB100 Dry Heat Bath/Vortexer PCA3 Assay-ben történõ alkalmazásával kapcsolatos használati utasítást. 1. Körkörös mozgatással vagy fel-le fordítással alaposan keverje össze a célbefogó-reagenst (TCR). Az ismétlõ pipettor használatával mérjen be 100 μl, analitikumra specifikus TCRt a megfelelõ reakciócsõbe. 2. A mikropipettorral szúrja át a kalibrátor üvegét lezáró kupakot és mérjen be 400 µl kalibrátort a megfelelõen jelzett reakciócsõbe. Ugyanezzel a pipettaheggyel a kiszúrt kupakon át vegye ki az üvegbõl az ismétléshez szükséges mennyiségeket. Minden egyes kalibrátor fiolához új pipettahegyet kell használni. A kontrolok és vizeletminták hozzáadásakor is ugyanígy kell eljárni. Takarja le és örizze meg a megmaradt vizeletmintát, és tárolja 8 C alatti hõmérsékleten (ld. a "Mintagyûjtés, -szállítás és -tárolás" címû rész) arra az esetre, ha netalán a tesztet meg kellene ismételni. 3. Fedje le a TTU-kat a légmentesen záró kártyával(kkal) és a tartóállványt finoman rázza meg. Ne vortexelje. Inkubálja a tartóállványt 62 C ± 1 C-os vízfürdõben 30 ± 5 percig. 4. Vegye ki a tartóállványt a vízfürdõbõl és és a csövek aljáról itassa le a vizet valamilyen abszorbeáló anyaggal. 5. Gyõzõdjön meg arról, hogy a zárókártyák szilárdan vannak-e a helyükön. Amennyiben szükséges, a zárókártyákat cserélje újra és a TTU-kat szorosan zárja le. 6 Vortexelje az állványt 60 másodpercig a sokcsöves vortexeren. Ld. az "Eljárással kapcsolatos megjegyzések" címû részt. Miután az állványt kivette a vízfürdõbõl, a vortexelést két percen belül meg kell kezdeni. 7 Hagyja a helyükön zárókártyákat és inkubálja az állványt szobahõmérsékleten 30 ± 5 percig. 8 Öt-tíz percre helyezze az állványt a TCS mágneses alapjára. 9. Indítsa el az elosztóállomás pumpacsövét úgy, hogy mosófolyadékot pumpál az elosztócsövön keresztül. Annyi folyadékot pumpáljun át a rendszeren, hogy a csõvezetékben nem maradjon légbuborék és mind a tíz fúvókán állandó folyadékáramlás legyen. 10. Kapcsolja be a vákuumpumpát és csatlakoztassa le az aspirátor elosztóját az aspirtáor elosztója és a folyadékcsapda üvege közötti elsõ csatlakozónál. Gyõzõdjön meg arról, hogy a vákuumpumpa átment-e a szivárgási teszten. Ez erre vonatkozó leolvasás 15 másodpercet vesz igénybe.csatlakoztassa vissza az elosztót, és gyõzõdjön meg arról, hogy a vákuum mérõórája az elõírt vákuumszintet jelzi. Hagyja bekapcsolva a vákuumpumpát az összes befogási lépés befejezéséig és az aspirátor csőrendszere meg nem szárad. Ld. a "Célbefogó-rendszer kezelõi kézikönyvének" hátulján lévõ "Célbefogó-rendszer vákuumspecifikációs adatlapját" vagy további információkért lépjen érintkezésbe a Gen-Probe Mûszaki Tanácsadószolgálatával. 11. Határozottan csatlakoztassa az aspirátor elosztóját az első sorozat hegyhez. Engedje le a hegyeket az első TTU-ba, egészen addig, amíg a hegyek a folyadék felszínéhez nem érnek. Biztosítsa, hogy a hegyek mindvégig érintkezzenek a folyadék tetejével, miközben a hegyek lefelé mozognak, egészen addig, amíg a hegyek röviden hozzá nem érnek a csövek aljához. Finoman kocogtassa a hegyeket a csövek aljához, amíg az összes folyadék nem távozik. Ügyeljen rá, hogy a hegyek ne érintkezzenek hosszabb ideig a csövek aljával, illetve ne üsse nagy sebességgel nekik a hegyeket, máskülönben túlzottan nagy mennyiségű hab keletkezhet a vákuumcsapdában. 12. A leszívás befejezésekor tolja visza a hegyeket azok eredeti tartókazettájába. Ismételje meg a leszívási lépéseket a maradék TTU-val úgy, hogy minden egyes reakciócsõhöz msmás hegyet használ. 13. Helyezze az elosztót az egyes TTU-k fölé, és az elosztóállomás pumpájával mérjen be 1 ml mosófolyadékot a TTU mindegyik csövébe HU Rev. C

7 Az eljárással kapcsolatos megjegyzések 14. Takarja le a csöveket a zárókártyával és vegye ki az állványt a TCS-bõl. Az állvány vortexelje egyszer a sokcsöves vortexelõn. További információk az "Eljárássl kapcsolatos megjegyzések" címû részben olvashatók. 15. Öt-tíz percre helyezze az állványt a TCS mágneses alapjára. 16. A 11. és 12. lépésekben leírtak szerint szívja le az összes folyadékot. 17. Az utolsó leszívás után, vegye le az állványt a TCS alapjáról és nézze meg, hogy a csövekbõl minden folyadékot sikerült-e kiszívni, és hogy láthatók-e mágneses részecskéket tartalmazó csapadékok a csövekben. Ha a csövekben még mindig lát folyadékot, helyezze vissza az állványt a TCS alapra további két percre, és a kérdéses TTU-ra ismételje meg a leszívást azokkal a hegyekkel, amelyeket elõzõleg az egyes reakciócsövekre használt. Ha a leszívás után látszik bármennyi, mágneses részecskét tartalmazó csapadék, a csövet elfogadhatónak lehet tekinteni. Ha nincs látható csapadék, akkor a mintát újra kell tesztelni. Ha ugyanaz a minta a megismételt futtatás után sem tartalmaz mágneses részecskét tartalmazó csapadékot, akkor valamilyen probléma lehet a mintával. Ilyen esetben, újabb vizeletminta-vétel javallott. H. Amplifikáció Megjegyzés: A reakciócsövekhez 90 másodpercen belül kell hozzáadni az enzimeket (ld. az alábbi 6. és 7. lépéseket). Mielõtt hozzákezdene a második állványhoz, elõször az elsõ állványon végezze el ezeket a lépéseket. SB100 Dry Heat Bath/Vortexer használata esetén tekintse át az SB100 Dry Heat Bath/Vortexer PCA3 Assay-ben történõ alkalmazásával kapcsolatos használati utasítást. 1. Az ismétlõ pipettor használatával mérjen be a reakciócsövekbe 75 μl, helyreállított, analitikumra specifikus amplifikációs reagenst. Az állványon lévõ minden reakciókeveréknek vörös színûnek kell lennie. 2. Az ismétlõ pipettor használatával mérjen be 200 µl olajreagenst. 3. Fedje le a csöveket a zárókártyával és vortexelje a sokcsöves vortexelõn. 4. Inkubálja az állványt a 62 C ± 1 C hõmérsékletû preamplifikációs vízfürdõben 10 ± 5 percig. 5. Tegye át az állványt 5 ± 2 percre a 42 C ± 1 C hõmérsékletû vízfürdõbe. 6. Miközben az állvány még a vízfürdõben van, óvatosan távolítsa el a zárókártyát és az ismétlõ pipettorral adjon a helyreállított enzimreagensbõl µl-t minden reakciókeverékhez. Minden reakciónak ekkor narancsszínûnek kell lennie. 7. Haladéktalanul takarja le a csöveket egy friss zárókártyával, vegye ki az állványt a vízfürdõbõl és óvatos rázással gyorsan keverje össze a reakcióelegyeket. Megjegyzés: A csövek lehülésének megakadályozása véget csak minimális ideig legyen kinn az állvány a vízfürdõbõl. 8. Inkubálja az állványt 60 ± 5 percig 42 C ± 1 C hõmérsékleten. I. Posztamplifikáció A hibridizációban és szelekcióban használt ismétlõ pipettorral más mûveleteket nem szabad végezni (ld. a "Figyelmeztetések és óvatossági rendszabályok" címû részt). A posztamplifikációs környezet, ideértve a kimutatást is, hõmérsékletének 15 C és 30 C közöttinek kell lennie. SB100 Dry Heat Bath/Vortexer használata esetén tekintse át az SB100 Dry Heat Bath/Vortexer PCA3 Assayben történõ alkalmazásával kapcsolatos használati utasítást. 1. Hibridizáció a. Vegye ki az állványt a preamplifikációs vízfürdõbõl és vigye át a posztamplifikációs területre. Az ismétlõ pipettor használatával mérjen be a reakciócsövekbe 100 μl, helyreállított, analitikumra specifikus próbareagenst. Minden reakciónak ekor sárgaszínûnek kell lennie. b. Fedje le a csöveket a zárókártyával és a sokcsöves vortexeren vortexelje 10 másodpercig, vagy addig, amíg a szín egységes nem lesz. c. Inkubálja a tartóállványt 62 C ± 1 C-os vízfürdõben 20 ± 5 percig. d. Vegye ki az állványt a vízfürdõbõl és inkubálja szobahõmérsékleten 5 ± 1 percig. 2. Szelekció J. Kimutatás a. Az ismétlõ pipettor használatával minden csõbe mérjen be 250 µl szelekciós reagenst. Minden reakciónak ekor rózsaszínûnek kell lennie. b. Fedje le a csöveket a zárókártyával és a sokcsöves vortexeren vortexelje 10 másodpercig, vagy addig, amíg a szín egységes nem lesz, és inkubálja az állványt 10 ± 1 percig egy 62 C ± 1 C-os vízfürdõben. c. Vegye ki az állványt a vízfürdõbõl. Inkubálja az állványt szobahõmérsékleten 15 ± 3 percig. A LEADER HC+ Luminométer használata a LEADER HC+ Luminométer kezelõi kézikönyvében van leírva. A PROGENSA PCA3 Assay alkalmazásának szoftver leírása a PROGENSA PCA3 Assay szoftverrendszer Adminisztrátori kézikönyvében és kezelõi kézikönyvében van leírva. 1. Helyezzen egy üres TTU-t a LEADER HC+ Luminométer 1. számú helyére és végezze el a mosási (WASH) protokolt. 2. Gyõzõdjön meg arról, hogy az Auto Detect 1-bõl és 2-bõl van elegendõ mennyiség a reakciók elvégzéséhez. 3. Töltse be a TTU-kat a luminométerve. Ha mindkét analítikumot tesztelni kívánja (back-to-back futtatás), töltse be elõször az összes PCA3 TTU-t, majd közvetlenül utána az összes PSA TTU-t. 4. Jelentkezzen be (Log on) a számítógépbe. Klikkeljen az új futtatásra (NEW RUN) és válassza ki a megfelelõ vizsgálati protokolt és koncentrációkat. A futtatás elindításához klikkeljen a (NEXT)-re. Megjegyzés: A futtatást a szelekciós lépés inkubációjától számított két órán belül be kell fejezni. 5. Egy nagyméretû kupakkal ellátott mûanyagtartályban, egyenlõ térfogat 5.25%-os (0.7 M) nátrium-hipoklorit és deaktivációs folyadékhoz szükséges puffer összekeverésével készítse elõ a pufferelt fehérítõbõl álló deaktiváló oldatot. A mûanyag tartályon tüntesse fel és írja rá a lejárati idõt. Ez a pufferelt fehérítõbõl álló deaktivációs folyadék szobahõmérsékleten négy hétig stabil marad. 6. Amennyiben a futtatások back-to-back módban történtek, futtatás befejezésekor, a vizsgálati szoftver két futtatási jelentést készít, a Nyers Futtatási Jelentést (Raw Run Report) és az Arányokra vonatkozó Jelentést (Ratio Report) (ld. Minõségellenõrzési eljárások és az Eredmények értelmezése). 7. A futtatás befejezésekor, vegye ki a használt TTU-kat a luminométerbõl és tegye a TTU-kat pufferelt fehérítõoldatot tartalmazó tartályba. A kidobás elõtt, a TTU-k legalább 15 percig maradjanak a tartályban. A helyes kezelési és elhelyezési eljárásokat a laboratórium vezetõjének kell kialakítania. Az eljárással kapcsolatos megjegyzések A. A minta előkészítése 1. Amennyiben a feldolgozott vizeletminták csapadékot tartalmaznak, melegítse azokat 37 C-on maximum 5 percig, majd finoman rázza össze. Abban az esetben, ha a csapadék nem megy oldatba, győződjön meg arról, hogy a csapadék nem akadályozza a feldolgozott vizeletminta kiszabadulását. 2. A fagyasztott vizeletmintákat vízfürdővel és időnkénti rázással melegítse szobahőmérsékletűre (15-30 C), annak érdekében, hogy egy nem oldódó dugulás kialakulását megakadályozza. Ha az ampullában a jég elegendően felolvadt ahhoz, hogy szabadon mozogjon, keverje össze finom rázással. Folytassa a melegítést egészen addig, amíg a vizeletminta teljesen fel nem olvad, majd keverje ismét össze finom le- fel-rázással. a. Ha dugulás keletkezik, és a minta pipettázása a TECAN Freedom EVO 100/4 eszközzel történik, fagyassza újra a vizeletmintát, majd olvassza fel megint, és győződjön meg róla, hogy nem keletkezik dugulás. Ha a dugulást nem sikerül kiküszöbölni, pipettázza a mintát kézzel! b. Ha dugulás keletkezik, és a vizeletminta pipettázása kézzel, mikropipettával történik, további teendőre nincs HU Rev. C

8 Minõségellenõrzési eljárások szükség, de győződjön meg róla, hogy a dugulás nem akadályozza a mintához való hozzáférést. B. Kontrol, kalibrátor és vizeletminta pipettázása 1. A TTU-khoz adott kalibrátor, kontrol és vizeletminta térfogatának 400 µl-nek kell lennie. A TTU-ba pipettázott térfogat vizuális ellenõrzése javallott a helyes térfogat-átvitel biztosítása végett. A pontos eredmények biztosításához megfelelõ térfogatra van szükség. 2. Győződjön meg arról, hogy a pipettahegy megfelelően van-e felhelyezve a pipettorra és ellenőrizze azt is, hogy a térfogat helyes értékre van-e beállítva. Javasoljuk, hogy minden TTU (10 csövenként) után vizuálisan is ellenőrizze a térfogat beállítását. A habosodás és buborékok generálásának elkerülése végett, a mintavételnél lassan engedje fel a pipetta dugattyúját. C. Reagensek 1. A próba helyreállító oldatában a tárolás során csapadék képzõdhet. Tartsa az oldatot 1 ± 2 percig 62 C ± 1 C hõmérsékleten. Azután a melegítési lépés után, a próba helyreállító oldata még akkor is használható, ha maradt benne csapadék. Ismételt szuszpendálás után, a fiolát óvatos fel-le fordítással keverje össze. 2. Az enzimreagens kivételével, a többi reagens pipettázásakor a reakciócső aljának oldalát vegye célba (ahol a cső aljának íve a cső oldalával találkozik). Az enzimreagens pipettázásakor viszont közvetlenül a reakciócső közepét vegye célba. Vizuálisan ellenőrizze, hogy a reagensek megfelelően lettek-e bemérve (nincs felesleges mennyiségű reagens a csövek oldalán, és hogy bekövetkezett-e a megfelelő színváltozás). D. Hõmérséklet 1. A célbefogási, amplifikációs, hibridizációs és szelekciós lépések mindegyike hõmérsékletfüggõ. Ezért, feltétlenül szükséges, hogy a vízfürdõk hõmérsékletét a megadott tartományokon belül tartsuk. 2. A szobahõmérséklet 15 C és 30 C közötti. E. Idõ A célbefogási, amplifikációs, hibridizációs és szelekciós lépések mindegyike idõtartamfüggõ. Mindeképpen tartsa be a Teszteljárásban meghatározott idõkereteket. F. Vortexelés A PROGENSA PCA3 sikeres kivitelezéséhez elengedhetetlenül fontos a helyesen kivitelezett vortexelés. A vortexeléshez, állítsa a sokcsöves vortexer sebességét a legalacsonyabb állásba, rögzítse az állványt, és kapcsolja be a berendezést. Lassan növelje a sebességet addig, amíg a folyadék fel nem megy a csõ fele magasságáig. Vortexeljen tíz másodpercig, a jelzett idõtartamig, vagy addíg amíg az egységes színt el nem éri. A sokcsöves vortexer kikapcsolása és az állvány eltávolítása elõtt állítsa a sebességet a legalacsonyabb fokozatra. A reakciókeverék sohasem érheti el a zárókártyákat. G. Vízfürdõk 1. A vízfürdõkben a vízfürdõ alján lévõ tartó fémtálca és a víz felszíne közötti vízmélység mindig 3,8-5,0 cm ( in.) legyen. Ez biztosítja a megfelelõ hõátadást. 2. A kereszt-kontamináció elkerülése végett, a vizsgálat egyes specifikus lépéseihez más-más vízfürdõt kell kijelölni. H. Dekontamináció 1. Felszínek és pipettorok A laboratóriumi asztalfelületeket és pipettorokat 2,5% - 3,5%- os (0,35 M - 0,5 M-os) nátrium-hipoklorittal (fehérítõoldat) rendszeresen dekontaminálni kell. A fehérítõoldatot legalább egy percig hagyja rajta a felületeken és a pipettorokon, majd vízzel öblítse le. Ne hagyja a fehérítõoldatot megszáradni. A klóros oldatok kimarhatják a berendezést és a fémet. A kimaródás elkerülése végett, a fehérítõvel kezelt felszerelést gondosan öblítse le vízzel. 2. TCS aspirátor elosztócsőve Minden használat után: a. Távolítsa el az elosztót. b. Helyezze az új TTC-t a TTC-keretbe! Kapcsolja be a vákuumpumpát. Csatlakoztassa az aspirátor elosztócsövét a TTC hegyére. Szívasson ki az összes oldatot, ami az elosztóállomás töltővályújában maradt. c. Öntsön legalább 100 ml 0,5-0,7% (0,07-0,1 M) vagy sűrgős esetben, 2,5-3,5% (0,35-0,5 M) töménységű nátrium-hipoklorit oldatot a töltővályúba. Szívassa ki az összes oldatot az aspirátor elosztócsövén keresztül. d. Öntsön legalább 100 ml deionizált vizet a töltővályúba. Szívassa ki az összes vizet az aspirátor elosztócsövén keresztül. e. Vegye ki a hegyeket az eredeti TTC-be. f. Hagyja fönt a vákuumpumpát, amíg a csőrendszer meg nem szárad, hogy megelőzze a visszafolyást (Kb. 3 percig). g. Fertőtlenítse az aspirátor-elosztócső felületét a "TCS egység"-ben leírtak szerint. 3. TCS Hulladéktároló Tisztítsa meg a selejtesüveget egy héten egyszer, vagy ha a selejtesüveg 25%-ig megtelik, bármelyik történjék is előbb. a. Kapcsolja ki a vákuumpumpát, és hagyja, hogy a vákuumnyomás kiegyenlítődjék. b. Kapcsolja szét az illesztéseket a selejtesüveg és a túlfolyóüveg között valamint a selejtesüveg és az aspirátor elosztócsöve között. c. Távolítsa el a selejtesüveget a vákuumcsapdáról. d. Óvatosan távolítsa el a fedőt, és öntsön 400 ml 5-7% (0,7-1,0M) töménységű nátrium-hipoklorit oldatot a 4 literes selejtesüvegbe. Megjegyzés: Ez történhet vegyifülkeében is, annak elkerülése érdekében, hogy a laboratóriumba gáz kerüljön. e. Zárja le a selejtesüveget, és finoman keverje össze a tartalmát. f. Hagyja magára a 15 percre a selejtesüveget, majd ürítse ki a tartalmát. g. Öblítse ki a selejtesüveget vízzel, hogy eltávolítsa a maradék hulladékot. h. Zárja le az üres selejtesüveget, és helyezze vissza a vákuumcsapdára. Rögzítse az illesztésekkel a TCS eszközre. Körültekintően dobja el mindkét kesztyűt. 4. TCS Egység Törölje le a TCS egység aspirátor elosztócső felszínét és a Mosópuffer ejektrocsúcsainak felszínét 2,5% - 3,5%-os (0,35 M - 0,5 M-os) nátrium-hipoklorittal (fehérítõoldat) átitatott papírtörölközõkkel. A fehérítõoldat után öblítse le vízzel és papírtörölközõkkel törölje a felületeket teljesen szárazra. 5. Tartóállványok Merítse be az állványokat 2,5% - 3,5%-os (0,35 M - 0,5 M-os) nátrium-hipokloritba (fehérítõoldat), és gyõzõdjön meg arról is, hogy a fehérítõoldat teljesen elfedje azt. Tartsa az állványokat elmerülve 10 percig. Az ennél hosszabb ideig tartó áztatás károsítja az állványokat. Gondosan öblítse le az állványokat vízzel és papírtörölközõvél teljesen szárítsa meg. I. Teendõk a vizsgálat során bekövetkezõ kontamináció esetén 1. Szennyezõ anyagok abban az esetben szoktak a rendszerbe bekerülni, ha a vizsgálati folyamat során nem jár el kellõ óvatossággal. 2. A TTU-kat pufferelt fehérítõszerrerl kell dekontaminálni a Teszteljárásban leírtak szerint. Tilos a TTU-kat ismételten felhasználni. 3. A felszerelést és a munkafelületeket a fenti Dekontaminálás címû részben leírtak szerint rendszeresen dekontaminálni kell. 4. Minden reagensrendszernél elõfordulhat, hogy bizonyos típusú kesztyûkön feleslegben lévõ por a nyitott csövek elszennyezõdését okozza. Javasoljuk, hogy az operátor viseljen pormentes kesztyût. Minõségellenõrzési eljárások A. Validálás futtatása 1. Kalibrátorokat és kontrolokat minden vizsgálatban futtatni kell, mégpedig azon az állványon, amelyeken a tesztminták is vizsgálatra kerülnek. Érvényesnek tekinthetõk azok a futtatások, amelyek az alábbi kritériumoknak megfelelnek: 2. kalibrátor RLU-ja nagyobb, mint az RLU levágása (cutoff) Ahol az RLU levágása = 1. kalibrátor átlag RLU-jával + az 1. kalibrátor RLU ismétlése standard hibájának 1, HU Rev. C

9 Az eredmények magyarázata + a 2. kalibrátor RLU ismétlése standard hibájának 1,645. Az átlagos interpolált 5-ös kalibrátor visszanyerése = 100 ± 30% Az átlagos interpolált A kontrol visszanyerése = 100 ± 60% Az átlagos interpolált B kontrol visszanyerése = 100 ± 35% 2. A PCA3 szoftver automatikusan értékeli az eredményeket a fenti kritériumok szerint, és közli a Futtatási állapotot (Run Status): PASS, ha az eredmények megfelelõek, és FAIL, ha az eredmények nem felelnek meg a validálási kritériumoknak. 3. Amennyiben a futtatási állapotra a szoftver a FAIL választ ad, az aktuális futtatásban kapott minden, a kérdéses analitikumra kapott teszteredmény érvénytelen és azokat tilos figyelmbe venni. 4. Ha a futtatás érvénytelen, a kérdéses analitikumra újabb futtatást kell végezni (ld. az Eredmények magyarázata). Ha futtatás a másik analitikum esetében megfelelõ, az eredményeket fel lehet használni az elsõ analitikum megismételt érvényes futtatásával. B. Mintavalidálás Egy adott érvényes futtatáson belül, egyes külön vizeletminták ereménye lehet INVALID (érvénytelen) és ez a Nyers futtatási jelentésben kijelzésre is kerül (ld. az Eredmények magyarázata). Bár a kérdéses minta egyedi ismétlése még lehet érvényes, a mintát érvénytelennek kell tekinteni, ha az ismétlések között az interpolált c/ml különbség meghaladja a 600%-ot. Ilyen esetben a kérdéses analitikummal kapcsolatos vizeletminta tesztelését meg kell ismételni. Az eredmények magyarázata A. Jelentéstípusok 1. Nyers futtatási jelentés A nyers futtatási jelentés információt ad a futtatás érvényességérõl (PASS vagy FAIL; ld. "Minõségellenõrzési eljárások") és a PROGENSA PCA3 Assay-al tesztelt egyedi reakciócsövekrõl. Amennyiben egy adott futtatás érvénytelen (FAIL) az abban szereplõ minden csövet érvénytelennek kell tekinteni. Azonban, egy érvényes (PASS) futtatás esetén bizonyos csövek akár érvénytelenek is lehetnek. Back-to-back futtatásoknál (azaz, ugyanabban a futtatásban PCA3 és PSA minták egyaránt tesztelve vannak), az egyik analitikum futtatása lehet érvénytelen, míg a másiké érvényes. A kivételek összegzése a nyers futtatási jelentés végén található. Olyan back-to-back futtatások esetén, amikor mindkét analitikum futtatása érvényes, a kívételek összegzésében felsorolt mintákat esetleg ismételten tesztelni kell. Bár a PCA3 pontszám eredménye fel van sorolva a kivételek összegzésében, ez az eredmény csak akkor tekinthetõ véglegesnek, ha manuális egyeztetés is megtörtént és az eredmény fel van sorolva az arányokra vonatkozó jelentésben. Amennyiben csak egyetlen analitikum lett tesztelve, vagy egy analitikum futtatása érvénytelen, minden tesztelt minta fel lesz sorolva a kívételek összegzésében. 2. Az arányokra vonatkozó jelentés (Ratio Report) Az olyan back-to-back futtatáskor, ahol mindkét futtatás eredménye érvényes, az arányokra vonatkozó jelentést az assay szoftvere automatikusan elkészíti. A szoftver kiszámítja és felsorolja az arányokra vonatkozó jelentésben megadott tesztminták PCA3 pontszámait. Az arányokra vonatkozó jelentésben felsorolt minták esetében vagy van, vagy pedig nincs szükség további tesztelésre, vagy esetleg mindkét analitikumra meg kell ismételni a tesztet. Az arányokra vonatkozó jelentésben nem felsorolt minták a nyers futtatási jelentés kivételek összefoglalása címû részében találhatók. Arányokra vonatkozó jelentést manuális egyeztetéssel is el lehet készíteni (további információkért ld. a "Manuális egyeztetés" címû részt) 3. Minőségellenőrzési jelentés A minőségellenőrzési jelentés felsorolja az assay érvényességének kritériumait, a megjelölt és interpolált koncentrációkat, illetve a kalibrátorok és kontrolok visszanyerését. A jelentés felsorolja még a négyparaméteres logisztikus dózis-hatás kalibrációs görbét meghatározó paramétereket is (3). További információkat a PROGENSA PCA3 Assay szoftverének kezelői kézikönyvében találhat. B. Egyeztetés 1. Automatikus egyeztetés Az olyan back-to-back futtatásoknál, ahol mindkét analitikum futtatása érvényesnek minõsül, a szoftver automatikusan egyezteti a kérdéses tesztminta egyedi PCA3- és PSAanalitikumok eredményeit és meghatározza a PCA3 pontszámot (amennyiben az kiszámítható). Az eredmények az arányokra vonatkozó jelentésben vagy a nyers futtatási jelentés kivételek összefoglalása címû részében vannak felsorolva. 2. Manuális egyeztetés Amennyiben a PCA3 és PSA analitikumok más-más futtatásban lettek tesztelve, a szoftver nem tudja automatikusan meghatározni a PCA3 pontszámot. Ilyenkor, az analitikum eredményeinek manuális egyeztetésére van szükség a PCA3 pontszám vagy PCA3 pontszám-tartomány meghatározásához (ld. PROGENSA PCA3 Assay szoftverrendszerének kezelõi kézikönyvét). A nyers futtatási jelentés kivételek összefoglalása címû részében felsorolt eredmények esetében is manuális egyeztetésre lehet szükség. A manuális egyeztetés után, az egyeztetett minta(ák) PCA3 pontszáma(i) egy újabb, arányokra vonatkozó jelentésben lesznek felsorolva. C. A jelentések értelmezése 1. PCA3 pontszám Megjegyzés: Csak az arányokra vonatkozó jelentésben felsorolt PCA3 pontszámok és PCA3 pontszámtartomány jelenthetõ. A kivételek összefoglalásában megjelent eredményeknél további lépésekre lehet szükség és így ezek nem jelenthetõk. A PCA3 pontszám a PCA3 mrns-kópiák és a PSA mrnskópiák arányának ezerszerese. Pontszámokat csak érvényes futtatásokból és mintákból származó eredmények használatával lehet számítani. Érvénytelen futtatásokat és érvénytelen mintákat a kérdéses analitikumra újra kell tesztelni (további informácéókért ld. az "Újratesztelés" címû részt.) A PCA3 pontszám a PCA3 mrns-kópiák és a PSA mrnskópiák arányának ezerszerese. Pontszámokat csak érvényes futtatásokból és mintákból származó eredmények használatával lehet számítani. Érvénytelen futtatásokat és érvénytelen mintákat a kérdéses analitikumra újra kell tesztelni (további információkért ld. az "Újratesztelés" című részt.) Amennyiben a lejelentett PCA3 pontszám nem éri el a ponthatárt (cutoff), az eredményt NEGATÍV-ként kell értelmezni. Amennyiben a PCA3 pontszám a ponthatárt meghaladja, vagy azzal egyenlő, az eredményt POZITÍV-ként kell értelmezni. A levágást a laboratórium vezetőjének kell meghatározni (további információkért ld. a Teljesítményjellemzők című részt). Bizonyos körülmények között, megad egy PCA3 pontszámtartományt (>[Calculated Score] vagy <[Calculated Score]>, >[Számított pontszám] vagy <[Számított pontszám]). Amennyiben a <[Számított pontszám] nem éri el a ponthatárt, az eredményt NEGATÍV-ként kell értelmezni. Amennyiben a >[Számított pontszám] meghaladja a ponthatárt, az eredményt POZITÍV-ként kell értelmezni. Amennyiben számmal megadott értékre van szükség, a mintahígítás és újratesztelés a PCA3 pontszámtartomány helyett PCA3 pontszámot generál (ld. "Újratesztelés - A tartományon kívül esően magas minták hígítása" című részt HU Rev. C

10 Az eredmények magyarázata 2. Status- és analíziskódok magyarázata A nyers futtatási jelentés és az arányokra vonatkozó jelentés "helyzet" (Status) oszlopa "s:a" formátumban adja meg az információkat. A futtatásra specifikus helyzetkódok ("s") az oszlop elõtt (az oszloptól balra), az analitikumra specifikus analíziskódok ("a" pedig az oszlop után (az oszloptól jobbra) vannak felsorolva. Az analitikumra specifikus kódok a PCA3 eredményeknél kisbetûvel, a PSA eredményeknél pedig nagybetûvel jelennek meg. Minden jelentés tartalmazza az abban megjelenõ helyzet- és analíziskódok leírását. Például, kódok jelezhetik, ha egy minta vagy ismétlés eredménye érvényes vagy a méréshatáron kívül esik. A helyzet- és analíziskódok teljes felsorolása és további részletek a "PROGENSA PCA3 Assay szoftverrendszerének kezelõi kézikönyvben" találhatók. Amennyiben az arányokra vonatkozó jelentésben szerepel egy adott PCA3 pontszám, és nem jelennek meg helyzet- és analíziskódok a PCA3 vagy PSA helyzet oszlopában, akkor mindkét tesztelt analitikum érvényes és a "tartományon belül" van. A mintára kapott eredmény jelenthetõ és további mûveletekre nincs szükség. Amennyiben a ívételek összefoglalásában vagy az arányokra vonatkozó jelentésben helyzet vagy analíziskód jelenik meg, a teszt megismétlésére lehet szükség (ld. A kívételek felsorolásában lévõ eredmények magyarázata és az arányokra vonatkozó jelentésben az eredmények magyarázata). Amennyiben az analitikumra vonatkozó eredmények más-más futtatásból származnak és van analíziskódju(ai)k. akkor mindkét analitikumra vonatkozó kombinációknál a 4a. vagy 4b. táblázatban ki kell keresni, hogy milyen további lépésekre van szükség. Megjegyzés: A helyzet- vagy analíziskód megjelenése még nem jelenti automatikusan azt, hogy a tesztelést meg kell ismételni. 3. A kívételek felsorolása az eredmények magyarázatában A kivételek felsorolásában nem biztos, hogy minden minta megjelenik. Ilyen esetekben további lépésekre nincs szükség. Amennyiben a kívételek felsorolás olyan, back-to-back futtatásban szereplõ mintá(ka)t sorol fel, ahol mindkét analitikum futtatása érvényes, tekintse a 4a. táblázatban lévõ utasításokat. Analitikumok egyedi futtatása esetén, ld. "A helyzet- és analíziskódok magyarázata" címû részt. Az olyan back-to-back futtatásokban, ahol az egyik analitikum futtatása érvénytelen, tesztelje le újra az érvénytelen futtatást (további információk az "Újratesztelés" címû részben vannak megadva), kezelje az eredményeket úgy, mintha egyedi analitikai futtatást végzett volna. Kézi egyeztetésre lesz szükség. Egy adott mintát még lehet érvénytelenek jelezni akkor is, ha az egyedi csövek (ismétlések) esetleg érvényesnek lettek jelezve. Az ismétlések kombinált eredményei azok, amelyek meghatározzák egy minta érvényességét, és az ismétlések közötti nagy különbség érvényteleníti a mintát (további információkért ld. a "Minõségellenõrzési eljárások" címû részt). 4a. Táblázat: PROGENSA PCA3 Assay Kivételek összefoglalása PCA3 Eredmény (analíziskód) PSA Eredmény (analíziskód) Felsorolt PCA3 pontszám További tesztelés? Teendõk/Megjegyzés Tartományon belül (nincs kód) Érvénytelen* (A, B, E, H, vagy I) -- Igen Tesztelje újra a PSA-t (ld. "Újratesztelés") és manuálisan egyeztesse az eredményeket. alacsony (g) Érvénytelen (A, B, E, H, vagy I) -- Igen Tesztelje újra a PSA-t és manuálisan egyeztesse az eredményeket. Érvénytelen (a, b, e, h, vagy i) Tartományon belül (nincs kód) -- Igen Tesztelje újra a PCA3-at és manuálisan egyeztesse az eredményeket. 1. Manuálisan egyeztessen a <[Számított pontszám]-ért, VAGY Tartományon belül (nincs kód) magas (F) <[Számított pontszám]** Választható 2. Hígítsa fel a mintát a mintahígítóban (ld. "A tartományon kívül esõen magas minták újratesztelésehígítása" címû részt), tesztelje újra a PSA-t, és szükség van PCA3 pontszámra, akkor manuálisan egyeztesse az eredményeket. 1. Manuálisan egyeztessen a >[Számított pontszám]-ért, magas (f) Tartományon belül (nincs kód) >[Számított pontszám] Választható VAGY 2. Hígítsa fel a mintát a mintahígítóban, tesztelje újra a PCA3-at, és szükség van PCA3 pontszámra, akkor manuálisan egyeztesse az eredményeket. alacsony (g) Tartományon belül (nincs kód) <[Számított pontszám] Nem Manuálisan egyeztessen a <[Számított pontszám]-ért. alacsony (g) magas (F) <[Számított pontszám] Nem Manuálisan egyeztessen a <[Számított pontszám]-ért. *Csak érvényes futtatáson belüliérvénytelen mintára vonatkozik. **A tartományon kívül esõ értékek esetében, a számítógép a legközelebbi pozitív kalibrátor kópiaszintjének alkalmazásával kiszámolja a számított pontszámot. 4. Eredmények magyarázata az arányokra vonatkozó jelentésben Amennyiben egy minta PCA3 pontszámmal van felsorolva az arányokra vonatkozó jelentésben, akkor az eredmény egy jelenthetõ PCA3 pontszám, és nincs szükség további teendõkre nincs szükség. Ha nincs PCA3 pontszám megadva ("--" jelzés a PCA3 pontszám oszlopában), akkor további utasításokat a 4b. táblázatban talál HU Rev. C

11 4b. Táblázat: PROGENSA PCA3 Assay az arányokra vonatkozó jelentés feltételei Korlátozások PCA3 Eredmény (analíziskód) Tartományon belül (nincs kód) Érvénytelen* (a, b, e, h, vagy i) Érvénytelen (a, b, e, h, vagy i) magas (f) magas (f) Érvénytelen (a, b, e, h, vagy i) Tartományon belül (nincs kód) magas (f) alacsony (g) PSA Eredmény Felsorolt PCA3 További (analíziskód) pontszám tesztelés? Teendõk/Megjegyzés Tartományon belül (nincs kód) PCA3 pontszám Nem További teendõk nincsenek, az eredmény jelenthetõ. Érvénytelen (A, B, E, H, vagy I) -- Igen Tesztelje újra mindkét analitikumot (ld. "Újratesztelés") magas (F) -- Igen Érvénytelen (A, B, E, H, vagy I) -- Igen magas (F) -- Igen alacsony (G) -- Nem alacsony (G) -- Nem alacsony (G) -- Nem alacsony (G) -- Nem Hígítsa fel a mintát a mintahígítóban (ld. "A tartományon kívül esõen magas minták hígítása" címû részt), tesztelje újra mindkét analitikumot. Hígítsa fel a mintát a mintahígítóban, és tesztelje újra mindkét analitikumot. Hígítsa fel a mintát a mintahígítóban, és tesztelje újra mindkét analitikumot. A mintában nincs elegendõ RNS a pontos analízishez. Új mintát kell gyûjteni a betegtõl. A mintában nincs elegendõ RNS a pontos analízishez. Új mintát kell gyûjteni a betegtõl. A mintában nincs elegendõ RNS a pontos analízishez. Új mintát kell gyûjteni a betegtõl. A mintában nincs elegendõ RNS a pontos analízishez. Új mintát kell gyûjteni a betegtõl. *Csak érvényes futtatáson belüli érvénytelen mintára vonatkozik. Amennyiben a minták azért voltak érvénytelenek, mert érvénytelen volt a futtatás, az eredmények a Kívételek összefoglalásában lesznek felsorolva (további információkért ld. (ld. A kívételek felsorolásában lévõ eredmények magyarázata). D. Újratesztelés 1. Útmutató az újrateszteléshez a. Az ugyan nem elõírás, hogy mindkét analitikum tesztelésére ugyanabban a futtatásban kerüljön sor, viszont egy jelenthetõ PCA3 pontszámhoz mindkét analitikum eredményének ugyanazon a mintafiola elemzésébõl kell származnia. b. Minden érvénytelen futtatást meg kell ismételni és minden érvényes futtatásban érvénytelennek bizonyult mintát újra kell tesztelni. c. A minta(ák) újratesztelésekor új kalibrátor- és kontrolsorozatot kell használni. d. Esszenciális, hogy újratesztelésig megfelelõen tárolja a visszamaradt mintát (további információkért ld. a "Mintagyûjtés, -tárolás és - szállítás" címû részt). e. A PCA3 pontszámok meghatározásához szükség lehet a PCA3 és PSA analitikumok manuális egyeztetésére (további információkért ld. a "Manuális egyeztetés" címû részt. 2. A tartományon kívül esõen magas eredményt adó minták hígítása a. Amennyiben egy érvényes futtatáson belül, egy adott minta extrapolálással számított koncentrációja az 5. kalibrátor értékét meghaladja, az eredmény tartományon kívül esõen magas ("out-of-range high") és a futtatási jelentésben az eredmény "f" vagy "F" analíziskód jelzést kap. A koncentráció a >[5. kalibrátor koncentrációja] (>[Calibrator 5 concentration]) alakban lesz megadva. b. A minta hígítása elõtt, a feldolgozott vizeletmintát fel-le fordításal keverje össze. Javasolt, de elõírás, a PROGENSA PCA3 Assay mintahígító-készlettel végztett 1:10 árnyú hígítás. Egy megfelelõ fiolában, 1800 µl mintahígítóhoz adjon 200 µl feldolgozott vizeletmintát, zárja le a kupakkal a csövet és ötszöri fel-le fordítással teljesen keverje össze. A futtatás munkalistájában a hígítási faktor "10" lesz. Amennyiben mindkét analitikumot újra kell tesztelni, duplázza meg a mennyiséget (használjon 3600 µl mintahígítót és 400 µl feldolgozott vizeletmintát). Ld. a PCA3 Assay mintahígító-készletének mellékletét. Tesztelje le a hígított vizeletmintát az assay-al. c. Amennyiben az újratesztelés esetén a minta eredménye ismét a tartományon kívül esõen magas, a további hígításra van szükség ahhoz, hogy a minta eredményének inetrpolálása a kalibrátorok tartományán belülre eesõ értéket eredményezzen. Az eredeti 1:10 arányú hígítmány további hígítása engedélyezett, amennyiben az eredet 1:10 hígítmányt megfelelõképpen tárolták (további információkért ld. a "Mintagyûjtés, -tárolás és -szállítás" címû részt). Korlátozások A. A PROGENSA PCA3 Assay nem alkalmazható olyan betegek esetében, akik a szérum PSA szinteket befolyásoló gyógyszert, például finasteride (Proscar, Propecia), dutasteride (Avodart), és androgén elleni terápiás gyógyszert (Lupron), szednek. E gyógyszerek a PCA3-at kódoló gén expressziójára gyakorolt hatását eddig még nem értékelték. B. Bizonyos terápiás és diagnosztikai eljárás, például prostatectomia, besugárzás, prosztata biopszia, és mások, hatással lehetnek a prosztata szövetének életképességére és így befolyásolni a PCA3 pontszámot. Ezen eljárásoknak a vizsgálatra gyakorolt hatását eddig még nem értékelték. Ilyen esetben a PCA3 tesztelésére akkor kell mintát gyûjteni, ha a klinikai orvos úgy gondolja, hogy a prosztata szövetállománya már helyreállt a kérdéses kezelés után. C. Ezt a vizsgálatot kizárólag az eljárásban képzett személyzet végezheti. Az itt leírt utasítások nyomonkövetésének elmulasztása vagy téves végrehajtása hibás eredményekhez vezethet. D. Minden laoratóriumnak külön kel validáltatnia a LIS transzfer eljáráshoz. E. Megbízható eredményt csak megfelelõ vizeletminta gyûjtése esetén lehet elérni. Mivel az e vizsgálatban alkalmazott transzportrendszer nem teszi lehetõvé a vizeletminta megfelelõségének mikroszkópos értékelését, ezért fontos, hogy a klinikai vizsgálóorvos megfelelőképpen ki legyen képezve a vizeletminta gyűjtésére. Ld. az utasításokat a "Mintagyűjtés, -szállítás és -tárolás" címû részben. Részletes információkért ld. a PROGENSA PCA3 vizeletgyûjtõ-készlethez mellékelt leírást HU Rev. C

12 Teljesítményjellemzõk F. A PROGENSA PCA3 Assay eredményeit az orvos rendelkezésére álló más laboratóriumi és klinikai adatokkal együtt kell magyarázni. (A teszteredményeket befolyásolhatja a vizeletminta helytelen gyûjtése, technikai hiba, vagy a minták összekeveredése). Teljesítményjellemzõk A. Klinikai eredmények 1. Diagnosztikai érzékenység és specificitás A PROGENSA PCA3 Assay teljesítményjellemzõi Észak Amerika négy, földrajzilag különféle klinikai helyein bevont férfi alanyoktól vett vizeletminták alapján lettek meghatározva. Az alanyok alkotta populáció 529, prosztatabiopsziára berendelt férfiból állt. Az alanyok demográfiai eloszlása az alábbi volt: a. Átlagos életkor ± SD = 64 ± 8 év (közép = 63, tartomány = 32-89) b. Átlagos szérum PSA szint = 7,9 ± 21,9 µg/l (5,6, 0,3-484) c. Átlagos prosztataméret (transzrektális ultrahagvizsgálattal mérve) = 44 ± 25 cc (39, 5-225) d. 34% (180/529) prosztatarákra biopszia-pozitív volt A 3. ábra mutaja be a PCA3 pontszám és a pozitív biopszia valószínûsége közötti összefüggést. A PCA3 pontszám növekedésével nõ az alanyokban a rákra pozitív biopszia elõfordulása. Pozitív biopszia (%) PCA3 pontszám: Alanyszám: 3. Ábra. A PCA3 pontszám és a pozitív biopszia valószínűsége közötti összefüggés Referencia-eljárásként prosztata-biopsziát álkalmazva, ROC (Receiver operating characteristic) analízist végeztünk a CLSI GP10-A (1995) szerint (4). A PROGENSA PCA3 Assay esetében, a görbe alattai terület (area under the curve (AUC)) 0,685-ak adódott (95%-os konfidencia-intervallum = ). Az 5. táblázat bemutatja a különböző PCA3 potszámok ponthatár-értékeinél megállapított érzékenységet és specificitást. Minden laboratóriumnak meg kell állapítania a saját diagnosztikai érzékenységi vagy specificitási ponthatárait (ld. az Eredmények magyarázata). 5. Táblázat: A PROGENSA PCA3 Assay diagnosztikai érzékenysége és specificitása különbözõponthatár-értékeknél. PCA3 pontszám határértéke Érzékenység 96% 85% 77% 63% 53% 41% 17% Specificitás 14% 33% 47% 61% 74% 84% 95% 2. Mintastabilitási vizsgálatok a. Stabilitás teljes vizeletben: Tíz alanytól elsõ (first-catch) vizeletet gyûjöttünk és a vizeletszállítási-közeg (urine transport medium (UTM)) hozzáadásával végzett feldolgozás elõtt 2 C - 8 C-on vagy 30 C-on tároltuk. 2 C - 8 C-on tárolva, 4 óra elteltével bizonyos mintákban a PCA3 és PSA mrns-ének jelentõs mértékû bomlása volt megfigyelhetõ. Eszerint, a teljes vizeletet 4 órán belül fel kell dolgozni. 30 C-on ez a folyamat gyorsabb volt, egyóránál rövidebb idõ alatt már jelentõs lebomlás volt megfigyelhetõ. Ezért, a feldolgozás elõtt a teljes vizeletet mindig hûtve vagy jégen kell tartani. b. Stabilitás a feldolgozott vizeletben: Tizenkét feldolgozott vizeletmintát 4 C, vagy 30 C hõmérsékleten inkubáltuk maximum 38 napig. A PCA3 és PSA mrns-e 4 C-on 21 napig, 30 C-on pedig 5 napig maradt stabil. A -20 C és -70 C-on tárolt mintákban a PCA3 és PSA mrns- maximum 90 napig e kimutathatóan stabil maradt. c. Fagyasztási-kiolvasztási stabilitás: Feldolgozott vizeletmintákat -70 C-ra fagyasztottuk le, majd felmelegítettük 37 C-ra. A fegyasztási-felmelegítési ciklust hatszor végeztük el. A PCA3 vagy PSA mrns-kópiaszintjeiben nem volt megfigyelhetõ csökkenés HU Rev. C

13 B. Analitikai eredmények 1. Analitikai érzékenység Teljesítményjellemzõk In vitro hígított mrns transzkriptumokból álló analitikai érzékenységi sort alkalmaztunk a vizsgálat érzékenységének megállípítására. Az egyik operátor tesztelte a sort 5 ismétléses 12 futtatásban, egyetlen reagenstételt alkalmazva. A kimutatási határ és a mennyiségi meghatározás határérték kiszámítása a CLSI EP17-A (2004) szerint (5) történt. A kimutatás és a mennyiségi meghatározás határértéke azonosnak bizonyult, a PCA3 analitikumra a mennyiségi meghatározás határértéke 80 c/ml-nek, a PSA analitikumra pedig 1438 c/ml-nek adódott. A 2. kalibrátor mindkét analitikum mennyiségi meghatározásának határértékével egybeesett. 2. Analitikai specificitás a. Nem átszabott (unspliced) transzkriptum: A vizsgálatot arra tervezték, hogy csak a prosztatarákra specifius exon 3-exon 4 spliced PCA3 mrns-t mutassa ki (2). A vizsgálat nem mutatja ki a hátteret lényeges mértékben meghaladó, nem átszabott PCA3 mrns-t (1 millió c/ml). b. PCA3 mrns prosztata-specificitása vizeletben: Radikális prostatectomián átesett alanyokból (n = 97) származó klinikai mintákat teszteltünk a PROGENSA PCA3 Assay-al, és a mért PCA3 szinteket összehasonlítottuk a biopszia elõtt álló alanyokból (n = 464) származó mintákból kapott eredményekkel. A prostatectomián átesett alanyokból gyûjtött mintáknál az átlagos PCA3 mrns c/ml a vizsgálat kimutatási határát nem érte el, míg a biopszia elõtt álló alanyokból vett mintáknál az átlagos PCA3 mrns 7243 c/ml-nek bizonyult; ezek az adatok igazolják, hogy a PCA3 mrns a prosztatából származik. c. Szövetspecificitás: Két egyedi férfi donortól szövettípusonként készített teljes RNS-kivonatot adtunk a mintahígítóhoz (10 ng/reakció) és azt a PROGENSA PCA3 Assay-al teszteltük. A prosztatszövet volt az egeytlen olyan szövettípus, amelyben a PCA3 mrns szint elérte a kimutatási határértéket (a vizsgált szövetek a 6. táblázatban vannak felsorolva). 6. Táblázat: PCA3 mrns-re tesztelt, férfiakból származó szövetek Húgyhólyag (Normális) Húgyhólyag (Daganat) Csontvelõ Ductus deferens Epididymus Szövettípus Vese Penis Prosztata Vesicula seminalis d. Zavaró vegyületek: A 7. táblázatban felsorolt vegyületeket összeöntött, feldolgozott férfivizeletbõl származó mintákhoz adtuk. A mintákat a PROGENSA PCA3 Assay-al vizsgáltuk a CLSI EP7-A2 (2005) szerint (6). A megadott koncentrációknál zavaró mértékû hatás nem volt megfigyelhetõ. Testis 7. Táblázat: A PROGENSA PCA3 Assay-ra gyakorolt zavaró hatásra tesztelt anyagok: Terápiás szerek Terápiás szerek, folytatás Anyag Tesztkoncentráció Anyag Tesztkoncentráció Acetaminophen/Kodein 5,34 µmol/l Uroxatral 30 mg/l Atorvastatin 25 mg/l Doxazosin 1,33 µmol/l Lisinopril 0,74 µmol/l Terazosin 7,8 µmol/l Amlodipin 245 µmol/l Finaszterid 15 mg/l Atenolol 37,6 µmol/l Tamsulosin 1,2 µg/l Szulfaszalazin 754 µmol/l Metformin 310 µmol/l Esomeprazol 120 mg/l Sildenafil 12,9 pmol/l Allopurinol 294 µmol/l Serenoa repens mg/l Difenhidramin 19,6 µmol/l Szelénium 0,275 mg/l Acetaminofen 1324 µmol/l Acetilszalicilsav 3,62 mmol/l Vizeletalkotók Ibuprofen 2425 µmol/l Anyag Tesztkoncentráció Furosemid 181 µmol/l Húgysav 1,4 mmol/l Ciprofloxacin 30,2 µmol/l Hemoglobin 2 g/l Levaquin 48,6 µmol/l Fehérvérsejtek 4.56 x 10 7 sejt/l Doxiciklin 67,5 µmol/l Vörösvértestek 3,06 x 10 7 sejt/l Fluoxetin hidroklorid 11,2 µmol/l Albumin 50 g/l Flutamid 1500 mg/l Bilirubin (nem konjugált) 342 g/l Dutaszterid 1,5 mg/l IgG 60 g/l HU Rev. C

14 3. Pontosság Teljesítményjellemzõk A PROGENSA PCA3 Assay pontosságát a CLSI EP15-A2 (2005) szerint állapítottuk meg (7) UV-VIS spektrofotometriával meghatározott mennyiségű PCA3 és PSA mrns transzkriptumokat adtunk feldolgozott, normális, nõi vizelethez (amelyben nincs kimutatható mennyiségű PCA3 és PSA mrns), és a koncentrációkat a PCA3 Assay-ban mértük. A százalékos (%) kitermelést úgy számítottuk ki, hogy a mért c/ml és a hozzáadott c/ml hányadosát százzal megszoroztuk. 8. Táblázat: A PROGENSA PCA3 Assayal visszanyerhető kópiák Analitikum Ismert koncentráció (c/ml) Mért koncentráció (c/ml) Kitermelés (%) PCA % % % % PSA % % % % 4. Linearitás és tartomány A PCA3 Assay lineáris tartományát a lineáris regresszióanalízisen (legkisebb négyzetek) alapuló CLSI EP6-A (2003) (8) szerint határoztuk meg. Két hígítási sorozatot készítettünk PCA3 és PSA mrns-t magas koncentrációban tartalmazó, feldolgozott vizeletmintákból. Az egyik sorozatot feldolgozott nõi vizelettel, a másikat pedig a mintahígítóval hígítottuk. A hígítások az egeyes analitikumok legalacsonyabb és legmagasabb pozitív kalibrátorainak teljes vizsgálati tartományát átfedték. Mind a PCA3- és mind pedig a PSA vizsgálattal mért eredmények közvetlen arányosságot mutattak a tesztelt hígításokkal és a jelentett analitikum c/ml-el. Nem találtunk jelentős hígítási mátrixhatást. ld. 4. ábra. PCA3 analitikum PSA analitikum PSA PSA 4. Ábra: A PCA3 Assay linearitása PCA3- és PSA analitikumokra 5. Pontosság A vizsgálát precizitását a CLSI EP5-A2 (2004) (9) szerint állapítottuk meg. A megismételhetőség a minimálisan változó körülmények közötti pontosság, míg a reprodukálhatóság nem más, mint a maximálisan változó körülmények közötti pontosság. A megismételhetõség vizsgálatára 3, in vitro hígított mrns transzkriptumot tartalmazó tesztpanelt készítettünk. Az egyik helyen az egyik operátor 20 napon át, 5 ismétlésben végzett 20 futtatásban, egyetlen kalibrátor-, kontrol-, és reagenstétel, illetve berendezéskészlet alkalmazásával tesztelte a panelt. A 9. táblázat bemutatja a PROGENSA PCA3 Assay megismételhetõségének, különbözõ tesztkoncentrációs szinteknél mért pontosságát HU Rev. C

15 Teljesítményjellemzõk 9. Táblázat: A PROGENSA PCA3 Assay megismételhetősége Analitikum Paneltag Átlag c/ml Megismételhetõség SD Megismételhetõség PCA % % % PSA % % % A reprodukálhatósághoz, összeöntött klinikai mintákból (1-3) álló és in vitro hígított mrns transzkriptumot (4-8) tartalmazó, 8-tagos tesztpanelt készítettünk. Három operátor tesztelte a panelt 3 napon át, 18 futtatásban egyetlen kalibrátor- és kontroltétel, 3 reagenstétel, és 3 berendezés beállítás alkalmazásával. A 10. és 11. táblázat foglalja össze a PCA3 Assay futtatáson belüli, futtatások közötti, operátor, berendezés és tétel precizitását az analitikum c/ml-re és a PCA3 pontszámra vonatkozóan. A futtatáson belüli, operátorok közötti, és futtatások közötti variabilitás - csökkenõ sorrendben - képezi a vizsgálat általános variabilitásának legnagyobb részét. A reagenstétel és a berendezés csak kissé vesz részt a vizsgálat általános változékonyságában. Ezek az eredmények bemutatják, hogy a vizsgálat reprodukálható, és a változékonyság elsõdleges forrása a véletlen hiba (futtatáson belül). 10. Táblázat: A PROGENSA PCA3 Assay reprodukálhatósága: Kópia/mL analízis Analitikum Paneltag n Mért c/ml Összes CV Futtatáson belüli CV Futtatások közötti CV CV, CV operátorok között CV, berendezések PCA % 24% 7% 15% 11% 0% között ,021 11% 6% 9% 9% 0% 0% ,469 8% 6% 5% 9% 0% 4% ,469 15% 13% 7% 6% 0% 1% ,844 7% 5% 2% 6% 0% 4% ,372 7% 4% 6% 0% 1% 0% % 26% 0% 11% 0% 1% ,274 13% 8% 8% 3% 0% 5% PSA ,739 9% 6% 6% 7% 4% 2% ,789 10% 6% 7% 7% 4% 0% ,073,920 11% 4% 6% 9% 8% 0% ,185 9% 5% 7% 3% 0% 1% ,504 10% 4% 8% 6% 3% 4% ,518,748 12% 5% 8% 4% 3% 7% ,007 14% 8% 9% 0% 6% 0% ,694,404 11% 7% 7% 0% 1% 6% CV, tételek között 11. Táblázat: A PROGENSA PCA3 Assay reprodukálhatósága: PCA3 pontszám analízise Átlagos Futtatáson Futtatások CV, operátorok CV, berendezések CV, tételek Paneltag* n pontszám Összes CV belüli CV közötti CV között között között % 26% 5% 23% 8% 0% % 9% 10% 12% 0% 2% % 7% 5% 17% 7% 6% % 24% 2% 8% 11% 7% % 14% 12% 0% 0% 9% *A 4-6. paneltagok csak PCA3- vagy PSA mrns transzkriptumot tartalmaztak és ezért ezek nem szerepeltek ebben az analízisben HU Rev. C

16 Irodalom Irodalom 1. Bussemakers, M.J.G., A. Van Bokhoven, G.W. Verhaegh, F.P. Smit, H.F.M. Karthaus, J.A. Schalken, F.M.J. Debruyne, N. Ru, and W.B. Isaacs DD3: A New Prostate-Specific Gene, Highly Overexpressed in Prostate Cancer. Cancer Res. 59: Hessels, D., J.Mt. Klein Gunnewiek, I. van Oort, H.F.M. Karthaus, G.J.L. van Leenders, B. van Balken, L.A. Kiemeney, J.A. Witjes, and J.A. Schalken DD3 PCA3 -based Molecular Urine Analysis for the Diagnosis of Prostate Cancer. European Urology. 44: Groskopf J., S.M. Aubin, I.L. Deras, A. Blase, S. Bodrug, C. Clark, S. Brentano, J. Mathis, J. Pham, T. Meyer, M. Cass, P. Hodge, M.L. Macai-ran, L.S. Marks, and H. Rittenhouse APTIMA PCA3 Molecular Urine Test: Development of a Method to Aid in the Diagnosis of Prostate Cancer. Clin Chem. 52: CLSI CLSI document GP10-A, Assessment of the Clinical Accuracy of Laboratory Tests Using Receiver Operating Characteristic (ROC) Plots. CLSI, Wayne, PA. 5. CLSI CLSI document EP17-A, Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation. CLSI, Wayne, PA. 6. CLSI CLSI document EP7-A2, Interference Testing in Clinical Chemistry. CLSI, Wayne, PA. 7. CLSI CLSI document EP15-A2, User Verification of Performance for Precision and Trueness. CLSI, Wayne, PA. 8. CLSI CLSI document EP6-A, Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach. CLSI, Wayne, PA. 9. CLSI CLSI document EP5-A2, Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods. CLSI, Wayne, PA. Fejlesztette és gyártja: Gen-Probe Incorporated San Diego, CA USA USA és Nemzetközi kapcsolattartás Ügyfélszolgálat: customerservice@gen-probe.com Technikai segítség: technicalsupport@gen-probe.com USA-ban és Kanadában ingyenesen hívható Ügyfélszolgálat: Technikai segítség: EMERGO EUROPE Molenstraat BH, The Hague The Netherlands A GEN-PROBE, GEN-PROBE és tervezés, APTIMA, LEADER, PROGENSA, és SB100 a Gen-Probe Incorporated védjegye; eppendorf (stilizált) az Eppendorf AG; RAININ a Rainin Instrument, LLC védjegye; TECAN és FREEDOM EVO a Tecan Group AG védjegye. E mellékletben esetleg megjelenõ bármely más márkanév a megfelelõ tulajdonosához tartozik Gen-Probe Incorporated HU Rev. C HU Rev. C