Immunhisztokémia: Előhívó rendszerek, problémák és megoldások

Átírás

1 Immunhisztokémia: Előhívó rendszerek, problémák és megoldások Dr. Krenács Tibor Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Budapest

2 Patológus Klasszikus patomorfológia Klinikai adatok Molekuláris információ

3 Patológus Klasszikus patomorfológia Klinikai adatok Molekuláris információ Immunhisztokémia Biomarker molekulák in situ Kimutatása

4 Patológus Klasszikus patomorfológia Klinikai adatok Molekuláris információ Immunhisztokémia Biomarker molekulák in situ Előfordulása Kimutatása Diagnosztikus interpretálás Megbízható-e a pozitív ill. a negatív eredmény?

5 Immunhisztokémia Szöveti molekulák in situ kimutatása nagy specificitású antigén-antitest kötés segítségével

6 Immunhisztokémia Szöveti molekulák in situ kimutatása nagy specificitású antigén-antitest kötés segítségével Specifikus térszerkezetbe koncentrált Kulcs a zárba illeszkedés NEM-KOVALENS Kötőerők Ionos -CH 2 -CH 2 -NH O van der Waals -CH 2 -CH-CH 3 O Hidofób CH 3 -CH 2 -CH 2 - C-CH 2 -CH 2 - -CH 2 -OHH (+) (-) O=C-CH 2 - H - híd

7 Immunglobulinok IgG (7S) NH3 + V L Fab papain pepsin V H emésztés IgG1, G2 és G4 C H1 diszulfid híd Fc receptor kötés O zsanér hinge régió 2x Fab+Fc C H2 szénhidrát IgG3 Ig-ok/antitestek: IgG, IgM, (IgA, IgD, IgE) C H3 Fc COO (Gene Mayer) Antigenitás: fehérjék > szénhidrátok > lipoidok, nukleinsavak

8 Immunglobulinok mint reagensek Antigén-determináns: (epitóp) Az antigén molekula azon szakaszai melyekhez az antitest közvetlenül kapcsolódik Fab-fragmensének hipervariábilis régiójával. Általában 8-15 aminósav (fehérje antigén), ill. oligoszacharidok (szénhidrát antigén) határoz meg egy epitópot. Stabilitás(tárolás): - Tömény antitestek, 1% BSA+0,1% Na-azid-TBS-ben 4 o C-on. hónapokig, akár évekig igen stabil. - Munkahígítások hasonló módon tartva néhány hétig, de van amelyik antitestet csak frissen hígítva használhatunk. - Érzékeny antitestek, -20 o C-on aliquot-okban (csak egyszer) Destabilizál: 1) alacsony/magas ph; 2) hő; 3) magas sókoncentráció; 4) fény

9 Immunhiszto-/Cytokémia Dako, 1994 Shi és mtsai, 1991 Hsu és mtsai, 1981 Köhler és Milstein, 1975 Taylor és Burns, 1974 Holgate és mtsai, 1983 ABC módszer IGSS módszer Polimer konjugátum módszer Antigénfeltárás HIER Sternberger, mtsai, 1970 Monoklonális antitestek Nakane és Pierce, 1966 Coons, 1942 FITC-anti- Pneumocuccus Indirekt immunperoxidáz PAP módszer Formol-paraffin immunhisztokémia Standardizált kit-ek Atomatizálás Specifikus/Primer antitestek: Egyre több antigénre Szintetizált oligopeptidekre 1-1 antigén számtalan epitópjára (pl. intra-, extracelluláris) Foszforilált (aktivált) enzimekre Egyre több formol-paraffinos

10 IMMUNHISZTOKÉMIA Összetett Szövet kimetszés Egymásra épülő, egymást befolyásoló faktorok Pre-analitika Rögzítés módja időtartama szövettípus méret Analitika Antigénfeltárás hatékonysága Reagens eszköze minőség/ módja affinitás Jelző-/előhívórendszer Diagnosztikus riport Kontrollok A reakció értékelése értelmezése Poszt-analitika Automatizálás Immunhisztokémia eredményessége (Standard kit-ek) Inkubációs idő hőmérséklet Reagenshígítás

11 Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó

12 Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál Túlrögzítés: - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó Késleltetett/alulrögzítés: antigénkárosodás, diffúzió Sebész/Klinikus szerepe! gátolt antigénkimutatás Antigénfeltáró módszerek

13 Szöveti pre-analitikai eljárások hibalehetőségei Szövetrögzítés: 4%-os Formaldehid denaturál Túlrögzítés: - szöveti keresztkötések - konformáció torzulás - háromdimenziós rács - gátolt antigén hozzáférés Igaz más kémiai rögzítésre is de a mértéke változó Késleltetett/alulrögzítés: antigénkárosodás, diffúzió Sebész/Klinikus szerepe! Víztelenítés: Beágyazás: Metszés: gátolt antigénkimutatás Antigénfeltáró módszerek utolsó absz. alkohol vizes gyakoribb csere/forgás orientációs hiba blokk öntés gyűrött vagy szakadozott metszet (terítési hő - idő) Pre-analitika: Egymásra épülő, egymást befolyásoló faktorok

14 Rögzítés Immunhisztokémia Szövetrögzítés BLOKKMÉRET 1 h = ~1 mm Penetráció IDŐ Rögzítés = h Ca 2+ ionok/kelátok stabilizálják Időben: Méret: <10 percen belül < 3 mm 4% formaldehid = ~ 10%-os formalin Időtartam: 16-24h Nagyméretű blokk szakszerű indítás nélkül 4 o C-on

15 Rögzítés Immunhisztokémia Szövetrögzítés BLOKKMÉRET 1 h = ~1 mm Penetráció IDŐ Rögzítés = h Ca 2+ ionok/kelátok stabilizálják Időben: Méret: 10 percen belül < 3 mm 4% formaldehid = ~ 10%-os formalin Rögzítés Egymás ellen ható követelmények Struktúra Antigenitás Kompromisszum! Időtartam: 16-24h Nagyméretű blokk szakszerű indítás nélkül 4 o C-on Antigénfeltárás

16 Metszés Metszetadhézió 3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus

17 Metszés Metszetadhézió 3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus Terítési hőmérséket - idő! - gyűrődéstől, - szakadozástól mentes Vízfürdő ~48-50 o C - Simítás nedves szűrőpapíron át - MULTIPONT ADHÉZIÓ! - HŐAKTIVÁLÁS! 60 o C-on ~2h

18 Metszés Metszetadhézió 3-5 m paraffin metszet ADHÉZIÓS TÁRGYLEMEZ pl. SuperFrost (Ultra) Plus Terítési hőmérséket - idő! - gyűrődéstől, - szakadozástól mentes Vízfürdő ~48-50 o C Terítés vízcseppen 1-2 m, műgyanta - Simítás nedves szűrőpapíron át - MULTIPONT ADHÉZIÓ! - HŐAKTIVÁLÁS! 60 o C-on ~2h

19 Antigén/epitóp feltárás CD21 (1F8) Proteáz? vagy Nedves hőhatás (főzés)? Trypsin Proteáz emésztés: Rögzítés-függő Fehérje emésztés az epitópot is pl. trypsin: lizin-arginin

20 Antigén/epitóp feltárás CD21 (1F8) Proteáz? vagy Nedves hőhatás (főzés)? Trypsin Proteáz emésztés: Rögzítés-függő Fehérje emésztés az epitópot is pl. trypsin: lizin-arginin HIER Nedves hővel (HIER = heat-induced epitope retrieval )

21 Antigénfetárás főzéssel (HIER) Széleskörű hatás: - a formaldehid keresztkötések lazítása Ca 2+ eltávolítás Pan-cytokeratin: AE1/AE3 CK5, 14 (CK1, 6, 10, 16, 17?) Nincs Proteáz HIER

22 Antigénfetárás főzéssel (HIER) Széleskörű hatás: - a formaldehid keresztkötések lazítása Ca 2+ eltávolítás Pan-cytokeratin: AE1/AE3 CK5, 14 (CK1, 6, 10, 16, 17?) Nincs Proteáz HIER Puffer: Hatékonyság ~ szövetkárosítás Ca++ Ca++ Ca++ Tris-EDTA ph9 > Citrát ph6 Kálcium kelátok eltávolítása Citrát ph 6 ++ EDTA ph 6 (+) EDTA ph Tris/EDTA ph 9* Morgan et al. J. Pathol *Vyberg M és Nielsen S. NORDIQC Javasolt!

23 Vimentin Tonzilla Flex nincs feltárás Flex feltárás után

24 Immunhisztokémia Antigénfetárás beállítása Sorozatmetszetek napi reprezentatív/túlrögzített anyagból Vimentin (V9): - HIER sorozat eltérő időkkel - Standard immunhisztokémia Elvárás: Minden lymphocyta pozitív! 30 citrát ph6,0 40 citrát ph6,0 elégtelen optimális HIER hatékonyság = hőmennyiség (idő+hőmérséklet) + puffer/ph

25 Antigénfeltárás (Hígítás!) Jelentősége Normál citrát, ph 6.0 Erős citrát, ph 6,0 Normál Tris-EDTA, ph9,0 HER2 2+ emlőrák

26 HÍGÍTÁS - primer antitest (detektáló rendszer) Optimális hígítás: Maximális jel/háttér arány Jó FP FN

27 Primer Antitest Specificitás - Érzékenység Melanoma markerek HMB-45 S-100 Érzékenység: Az adott entitás hány %-ában pozitív Specificitás/Szelektivitás: Az adott entitáson kívül nem vagy csak kismértékben fordul elő Tyrosinase Melan-A

28 Epitóp specificitás - érzékenység EGFR: intra-, extracleluláris

29 Optimalizás Immunhisztokémia Primer antitest Inkubáció Antigénfeltárás Detektáló rendszer

30 Immunhisztokémia Detektáló rendszer Típusa (biotin v. polimer) Érzékenysége Stabilitása Gazdaságossága Kiegészítők (Kit) - reprodukálhatóság - érzékenység - háttércsökkentés - takarékosság

31 ABC módszer - Hsu és mtsai, 1981 (Strept)Avidin-Biotin peroxidáz (ABC) komplex Biotin (H vitamin) Primer antitest Biotinnal jelölt kapcsoló antitest (Strept)avidin PO, AP enzim FITC, TRITC Au kolloid

32 Jelző/Detektáló rendszer ABC módszer pcd3 1:200 Citrát ph6 Tris-EDTA ph9

33 Jelző/Detektáló rendszer ABC módszer pcd3 1:200 Citrát ph6 Tris-EDTA ph9 Hatékony HIER (Tris-EDTA; EDTA stb ) Endogén biotin! Metabolikusan erősen aktív sejtekben: FALS POZITIVITÁS! máj, vese, mellékvese, emlő gasztointesztinális hám

34 Polimer konjugátum EnVision TM + módszer (Dako) BIOTIN-MENTES! EnVision Flex 3. generációs 2 lépcsős polimer: Primer egér antitest Anti-nyúl+ anti-egér Polimer-PO -DAB/H 2 O 2 ~10 perc

35 Detektáló rendszer Standardizált kit-ek Polimer-enzim-antitest BIOTIN-MENTES! EnVision Flex Mini High ph K8023 Anti-nyúl+ anti-egér Polimer-PO EnVision FLEX Endogén peroxidáz blokkoló Foszfát pufferelt H2O2+NaN3+detergens EnVision FLEX /HRP Dextrán-PO és kecske anti-nyúl, -egér IgG; BSA, azid EnVision FLEX DAB+ Kromogén 3,3 -diaminobenzidin HCl4 szerves oldószerben EnVision FLEX Subsztrát puffer Pufferelt hidrogén peroxid oldat tartósítva. EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) Tris/EDTA buffer, ph 9-es puffer. 3-in-1 módszer EnVision FLEX Mosó puffer (20x) TBS + detergens, Tween 20, ph előmelegítés 65 o C-ra, - paraffin metszet o C - lehülés 65 o C-ra

36 Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! 3-lépéses módszer 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) Egér IgG 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum

37 Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! 3-lépéses módszer Nyúl anti-egér IgG Egér IgG 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum

38 Polimer konjugátum módszer BIOTIN-MENTES! Jelerősítés! Anti-egér 3-lépéses módszer Anti-nyúl Nyúl anti-egér IgG Egér IgG 1. Primer antitest (pl. - egér IgG) 2. Nyúl anti-egér IgG (vagy egér anti-nyúl IgG) 3. Anti-egér/anti nyúl IgG Peroxidáz polimer konjugátum 3-5 x érzékenyebb! Mint a 2 lépéses

39 Antigénfeltárás Jelzőrendszer mérete ABC komplex Anti-IgG-PO Penetráció

40 Antigénfeltárás Jelzőrendszer mérete Polimer-konjugátum ABC komplex Anti-IgG-PO Penetráció Nagyobb méret hosszabb antigénfeltárás!

41 CD3 Ig szupercsalád Legkorábban megjelenő T-sejt marker (ALL) Dako-Flex Dako Flex+ ABC 1:200 1:400 1:200

42 EGFR Óriássejtes csonttumor (GCTB) ABC- endogén biotin Dako-Flex

43 HER2 3+ emlőrák Dako Flex + ABC Dako-Flex Polimer

44 HER2 1+ emlőrák Polimer 1 ABC Dako-Flex Polimer 2

45 HER2 3+ emlőrák Flex feltáró-deparaffinálás után

46 Kollagén XVII Melanoma Flex feltáró-dep. után Polimer

47 Immunhisztokémia Inkubációs idő Szobahő 120 Szobahő 30 EGFR Oesophagus SSC

48 Immunhisztokémia Mosó puffer ph-ja CK 20 vastagbélrák TBS ph 7,4

49 Immunhisztokémia Mosó puffer ph-ja CK 20 vastagbélrák TBS ph 8,0 TBS ph 7,4

50 Immunhisztokémia Jellemző hibák -Technológiai CD79a HIER CD3 Széli intenzitás különbség Kiszáradási gyűrű Drasztikus antigénfeltárás alulrögzültség

51 Immunhisztokémia Jellemző hibák -Technológiai CD79a HIER CD3 Széli intenzitás különbség Kiszáradási gyűrű Drasztikus antigénfeltárás alulrögzültség Sejtbiológiai megfeleltetés Szubcelluláris lokalizáció TdT CD20 CD30 ALK-1

52 Immunhisztokémia Kontrollok Antigén kimerítés (negatív) Alacsony antigénszint (pozitív) Endogén beépített pozitív kontroll ER

53 Immunhisztokémia Kontrollok Antigén kimerítés (negatív) Alacsony antigénszint (pozitív) Endogén beépített pozitív kontroll Univerzális multikontroll ER Tonsilla, pancreas, máj, appendix Túlrögzült > h

54 Automatizálás STANDARDIZÁLÁS Pre-analitika (?) - rögzítést nem! Analitika - teljes Poszt-analitika (-/+) - támogathat (képanalízis)

55 Automatizált immunfestés előnyei Az inkubáció/mosás/előhívás kontrollja - standard körülményei: - NINCS: kávé/ebéd szünet, szabadság, csúszás - az eredmények reprodukálhatósága jelentősen javul Immunigények és a munkaerő ritkán van szinkronban - a vizsgálat átfutási ideje csökken és egyenletesebbé válik Érzékeny és standardizált jelző és előhívó rendszer - rövid inkubációk, az automata naponta többször indítható Az asszisztensek tapasztalatbeli különbségei kevésbé dominálnak - javulhat a hatékonyság, a minőség és a megbízhatóság is Automatizálással a munkaerő ~30-40 %-a felszabadítható - javul a munkaerő kihasználtsága egyéb fontos teendők

56 Az immunhisztokémiai asszisztensek fontos kiegészítő tevékenységei Új antitestek tesztelése Pozitív kontrollok regisztrálása, metszése Új módszerek, antigénfeltáró pufferek tesztelése A reakciók eredményének technikai monitorozása (belső minőségbiztosítás) Részvétel külső minőségbiztosításban A reagensek és módszerek gondozása (standard protokollok) Kutatási célú reakciók Tanácsadás, asszisztens oktatás Adminisztráció: ISO, immunkérések, TB elszámolás stb.

57 Automatizált kettős jelölés EnVision Doublestain System K PO/DAB AP/F-Red Ig könnyűlánc Ig könnyűlánc

58 Polimer-enzim detektálók Kettős jelölés CD1a - CD68 Reaktív nyirokcsomó

59 Az immunhisztokémia minőségbiztosítása TECHNOLÓGIAI KÜLSŐ BELSŐ ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS Standard protokoll követése Szövetfeldolgozási és festési lépések monitorozása Festett metszetek ellenőrzése Kontroll festések ellenőrzése Hibás minták kigyűjtése Hiba meghatározása Hiba javítása A folyamat rögzítése

60 Az immunhisztokémia minőségbiztosítása TECHNOLÓGIAI KÜLSŐ BELSŐ ORVOSSZAKMAI/ DIAGNOSZTIKUS Standard protokoll követése Szövetfeldolgozási és festési lépések monitorozása Festett metszetek ellenőrzése Kontroll festések ellenőrzése Hibás minták kigyűjtése Hiba meghatározása Hiba javítása A folyamat rögzítése Technikai kontrollok ellenőrzése Sejt-/patobiológiai korreláció Endogén pozitív kontrollok Panel részeként a kizáró reakciók megfelelősége Egyezés, eltérés okainak elemzése, javítása

61 Immunhisztokémia Alapszabályok ELŐHÍVÁS standard DAB kit (esetenként AEC vagy VIP) KONTROLLOK (endogén +kontroll; multiszövet kontroll) Gazdaságosság (érzékeny módszer >Ab hígítás) Automatizálás (a standardizálás preferált módja) Finomhangolás (minden új primer Ab titrálás; tárolás!) Biotin-mentes DETEKTÁLÓ (Jelerősített, 3 lépéses) ELŐHÍVÁS standard DAB kit (esetenként AEC vagy VIP) KONTROLLOK (endogén +kontroll; multiszövet kontroll) Gazdaságosság (érzékeny módszer >Ab hígítás) Automatizálás (a standardizálás preferált módja) Finomhangolás (minden új primer Ab titrálás; tárolás!)

62 Köszönet Parsch Edit Dr. Zsákovics Ivett Tamási Anna Kiss Renáta