QualiCont - Tapasztalatok

Átírás

1 QualiCont - Tapasztalatok Dr. Krenács Tibor Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest Magyar-Osztrák Patológus Kongresszus octóber 1-3

2 EQALM-tag (European Committee for External Quality Assurance Programmes in Laboratory Medicine) EN :2004 European Standard ISO Guide 43-1:1997 ALAPÍTVA: diagnosztikus szakma Hisztotechnológia Labor Immunhisztokémia Labor 2009-ben: 46 Labor HT 36 Labor IHC 2009: 72-féle program 2009 szeptember: 48. Forduló

3 Patológiai Program Továbbképzés - értékelés Szeged: Diagnosztikus patológia - Minőségbiztosítás Szombathely: Hisztotechnológia Minőségbiztosítás 3x Marosvásárhely: április Pávai Zoltán prof. Diagnosztikus patológiai továbbképzés Minőségbiztosítási fórum UK NEQAS, dán, norvég, lengyel, magyar, román előadók Romániai pathológusok első kísérleti QC forduló

4 Patológiai Program Szövetpatológia eszközei: morfológia/hisztokémia A normális és megváltozott morfológia ill. molekula-expresszió ANALITIKAI TESZT in situ analízise Az analit - kémiailag rögzített, beágyazott, festett - szöveti metszet előny: - konzisztens minta - nem bomlik/fertőz Pre-analitika hátrány: - fiziko-kémiai változások Formaldehid keresztkötések - sztérikus gátlás - konformáció módosulás - RÖGZÍTÉS - Víztelenítés - Beágyazás - Metszés Szövetelőkészítés Nehezen standardizálható!

5 ~700 laboratórium - 7 modul évente 4 forduló 4 metszet/forduló Az akkreditáció (CPA) feltétele 3x 10/20 figyelmeztető levél 4x 10/20 gyenge teljesítmény NQAAP értesítése

6 ~ 150 labor Általános modul: 3 forduló/6 antigén/év Emlő modul: 2 forduló/4 metszet/év optimális - jó - határérték - rossz

7 Patológiai Program Gynecocytologia LabQuality - virtuális Hisztotechnológia Immunhisztokémia QualiCont metszet 2 féle Saját metszet 2 féle Értékelés festett metszetek 4 értékelő 1-5-ig kommentárok

8 Patológiai Program Farmakodiagnosztikumok - terápia Immunhisztokémia Mintaválasztás Her2 + + ER Her2 ER Melanoma Hám-Carcinoma LCA Izom Endotel Proliferáció 3+/FISH+ 0 2+/FISH- Lép 45. Ford

9 A leggyakoribb hibalehetőségek Resons for failure NORDIQC (Skandináv országok) Fals negatív: 2559 (Slides) metszetből 740 ( 29 %) Túlhígított primer antitest Overdiluted primary antibody 247 ( 33 %) Elégtelen HIER Insuffiecient HIER 243 ( 33 %) Nem megfelelő primer antitest 107 ( 14 %) Nem értelmezhető ok 41 ( 6 %) Fals pozitív: 102 ( 4%) Túl tömény primer antitest Concentrated primary antibody 51 ( 50 %) Nem megfelelő minőségű primer antitest 16 (16 %) Túlzott antiténfeltárás 13 (13 %) A detektáló rendszer nemspecifikus reakciója 19 (19 %) Nem értelmezhető ok 3 ( 2 %)

10 Patológiai Program PROBLÉMÁK Saját speciális festést nem értékelünk Túlrögzült szövet igen, meg kell oldani Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk Pokilonális Her2 nem szerencsés kivéve Herceptest! Túlhígított primer antitest (RTU)

11 Patológiai Program PROBLÉMÁK Saját speciális festést nem értékelünk Túlrögzült szövet igen, meg kell oldani Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk Pokilonális Her2 nem szerencsés kivéve Herceptest! Túlhígított primer antitest (RTU)

12 Patológiai Program PROBLÉMÁK Saját speciális festést nem értékelünk Túlrögzült szövet igen, meg kell oldani Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk Pokilonális Her2 nem szerencsés kivéve Herceptest! Túlhígított primer antitest (RTU)

13 Patológiai Program PROBLÉMÁK Saját speciális festést nem értékelünk Túlrögzült szövet igen, meg kell oldani Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk Pokilonális Her2 nem szerencsés kivéve Herceptest! Túlhígított primer antitest (RTU)

14 Patológiai Program PROBLÉMÁK Saját speciális festést nem értékelünk Túlrögzült szövet igen, meg kell oldani Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk Poliklonális Her2 nem szerencsés kivéve Herceptest! Túlhígított primer antitest (RTU)

15 Patológiai Program PROBLÉMÁK Saját speciális festést nem értékelünk Túlrögzült szövet igen, meg kell oldani Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk Pokilonális Her2 nem szerencsés kivéve Herceptest! Túlhígított primer antitest (RTU) 10 mm Tris-1 mm EDTA, ph 9.0 (10x) Javaslat: Antigénfeltárás (metszetadhézió) Tris bázis 12,1 g Na 2 EDTA 3,72g Deszt.víz ad 1000 ml ph 9-re állítás: kb. 4,5 ml 1N HCl (+ 0.1% Tween 20)

16 CD20 B-sejt marker - QC CD79a

17 IHC HIER - Műtermékek -Technológiai HIER CD3 CD79a

18 c-erbb2, saját Endogén biotin 3+ Alul/elkésett rögzítés

19 Adatbázis-kezelő program Dr. Ocsovszki Imre Technika és az eredményesség összevetése Teljesítmény megoszlása fordulónként festésenként Grafikus ábrázolás Egyedi szöveges értékelés Új fejlesztés Paraméteres összesítés adott festés akár összes körére Várható fejlesztések Technikai adatbevitel - közvetlenül interneten Értékelés laptop-okkal közvetlen adatbevitellel

20 Eredményösszesítés

21 Paraméteres összesítés Antigénfeltárás

22 Paraméteres összesítés Antigénfeltárás

23 Paraméteres összesítés Primer antitest

24 Módszer Paraméteres összesítés Inkubáció

25 Paraméteres összesítés Automatizálás

26 Patológiai Program Digitális mikroszkópia Hematológiai program Dr. Horváth Katalin QualiCont EQA Run42 ER + + Kiváló proliferációs marker (Ki67) immunhisztokémiai reakció. Erős nukleáris festődés a tonzilla csíracentrumai B-lymphocytáinak nagyrészében (és a tonzilla hám bazális és suprabazális sejtjeiben, valamint elszórtan a perifollikuláris régióban.

27 Köszönet Lábdy Mária, Sarró Anikó, Dudás Ágnes Danyiné Szekeres Katalin Dr. Sárkány Erika, Dr. Horváth Katalin, Dr. Juhász Péter Dr. Ocsovszki Imre QualiCont Iroda munkatársai

28 4% formaldehyde 2-48 h, 24-sample miroarray Antigen retrieval 0,01 M Citrate ph 6 120oC 1 min 120oC 2.5 min 02h 28h 48h 28h 48h 04h 14h 48h 14h 28h 44h 04h CD79a IHC EnVision+ 0,01 M TRIS-EDTA, ph 9 120oC 1 min 120oC 2,5 min 04h

29 Felelősségi körök Szakasszisztens (asszisztens) Pre-analitika Rögzítés módja időtartama Analitikai fázis Antigénfeltárás Reagensek hatékonysága minősége/ affinitása Jelző-/előhívórendszer Patológus Kontrollok A reakció értékelése értelmezése Post-analitika Immunhisztokémia eredményessége Inkubációs idő hőmérséklet Reagensek hígítása

30 Szövetpatológia Külső minőségértékelés - EQA 1984 Gerry Reynolds London Histology Discussion Group 1993 EAP Kongreszus Innsbruck 1996 AFACAP - francia holland, spanyol ICC 7 modul ~700 laboratórium 1992 Keith Miller, UCL Tony Rhodes Első próba itthon ICC 1995 Továbbképzés M.-on Keith Miller-rel Patológiai Program 46 Hisztotechnológia 36 Immunhisztokémia (17gynec. cytol. LabQuality) EU TEMPUS: Brit értékelők, továbbképzések KT: Részvétel a UK NEQAS ICC értékeléseiben évente 2x 1996-tól

31 Her-2 IHC teszt Gyakori technikai hibalehetőségek Rögzítés - Elégtelen/késleltetett Beágyazás - Elégtelen víztelenítés Antigénfeltárás - Elégtelen/túlzott Reagensek - Tárolási hiba, hígítás Előhívás - túl hosszú (>10 ), csapadékos Felülfestés - túlzott (cytoplazma, mag)

32 IHC Detektáló rendszer Hatékony HIER (Tris-EDTA; EDTA stb ) Endogén biotin! Metabolikusan erősen aktív sejtekben: máj, vese, mellékvese, emlő gasztointesztinális hám FALS POZITIVITÁS! Anti-biotin IgG - vesehám sejtek Vese Her2 Hollinshead et al. JHC 48: , 1997

33 ER Erős expresszió % Mérsékelt expresszió >40%

34 HIER Antigen retrieval nincs Ki67 bcl2 CD35 citrate Tris EDTA 0.01M citrát, ph6 0,1 M Tris0,01MEDTA ph9 trypsin TRS (Dako) ph6 TRS

35 Szövet multiblokk - tissue microarray Mintaszelekció - TMA készítés - in situ teszt - adat és kép értékelés/feldolgozás Hatékony módszer: ( high throughput ) - nagyszámú minta - gyors sreen -elés - takarékos - standard Tumorok klinikopatológiai tulajdonságai - molekuláris változások Új próbák széleskörű tesztelése (IHC, ISH) Alapkutatás (cdns chip) - diagnosztikai/klinikai validálás In situ diagnosztikus módszerek technikai validálása

36 CD79a IHC EnVision+ (for 16h) 4% formaldehyde fixation Delayed by 2, 4, or 6h after surgery 0,01 M Citrate, ph 6 120oC 1 min 120oC 2,5 min 2h után 6h után 2h után 6h után 2h után 6h után 0,01 M TRIS-EDTA, ph 9 120oC 1 min 120oC 2,5 min 2h után 6h után

37 Fixation length (4% formaldehyde- Antigen retrieval 120 o C, 1 min 0.01M citrate, ph6 04h 48h 120 o C, 1 min 0,01 M Tris-EDTA, ph9 04h 48h

38 Delayed fixation (in 4% formaldehyde) - Antigenicity (morphology) 1 min 0.01M citrate, ph6 2h delay 6h delay 1 min 0,01 M Tris-EDTA, ph9 2h delay 6h delay

39 Work Programs ( 50.5 billion) EU 7th FRAME PROGRAM ( ) Health ( 6.05 billion) Food, Agriculture and Biotechnology Cooperation Information and Communication Technologies ( 32 billion) High throughput research Nanosciences, Nanotechnologies Ideas Biotechnology, Detection, diagnosis and monitoring generic tools and Energi People medical Prediction of suitability, safety and efficacy of technologies Environment therapies (incl climate change for human health Capacities Transport Innovative (incl Aeronautics) therapeutic approaches and intervention Nuclear Socio-economic science and Humanities research and training HEALTH : Security QUALITY STAIN Standardisation and improvement of pre-analytical Space procedures for in vitro tissue diagnostics Joint Research Centre EU FP7 -HEALTH: QUALITY STAIN

40 EU FP7 HEALTH : QUALITY STAIN Standardisation and improvement of pre-analytical procedures for in vitro tissue diagnostics. UK DK NEM TÁMOGATTÁK! ICC D Pl F I CZ HU SK R P E

41 NORVÉG ALAP Pályázat Régiós/országos tele-diagnosztikai hálózatok technológiájának kidolgozása, komplett rendszerek kifejlesztése, telepítése, tesztelése Dr Orosz Zsolt elnök Dr Kulka Janina - főtitkár Internet Intranet Általános patológus Specialista

42 1996-ban: 5 diagnosztikus szakma 1. Forduló: Forduló: 2008 május Hisztotechnológia Labor 2007-ben: 46 Labor Immunhisztokémia Labor 36 Labor Visszaesés okai: Egészségügyi reform - takarékosság - intézmény összevonások

43 Patológiai QualiCont Program Minőségi kontroll - metszetértékelés eredménye/kritika Minőségbiztosítás - információáramlás - egységes standardok közvetítése (protokollok, tapasztalatok terjesztése/kontrollja) - tudományos alapon a függetlenség fenntartásával Adatáziskezelő program Adatbevitel Automatizálás a tesztek technikai részletei számszerűsített értékelés/kritika - módszer paraméter-eredményesség (grafikus ábrázolás) - értékelő lapok, visszajelzés - átjárhatóság - QualiCont központi adatbank

44 Proficiency Testing for Histopathology Kredit pont alapú - nem rendszeres Technikai programok programok IHC, ISH/FISH, molekuláris (PCR) 178. HistoQIP (2/év): 2 H-E, 2 speciális, 1 IHC 179. Immunhisztokémia (2/év): 8-10-core Her2, EGFR, ER, CD20, CD117 Interpretatív programok: (hasonló a hazai TOTO metszetekhez) PIP, Performance improvement program (10 ismeretlen eset) Listából kiválasztott diagnózis (40 kredit pont) Digitális metszet program (5 eset alkalmanként) Digitális Online program in dermatology

45 uali ont Patológiai Program Hisztotechnológia H-E Hisztotechnológia Speciális festés Rugalmas rost Amyloid Reticulin PAS

46 Digital/Virtual microscopy Scanning camera NEW Hitachi camera 3-chip for each pixel 1 pixel = 0,23 µm 20x NA=0,63

47 UK NEQAS ICC Her2 teszt A HER-2 értékelés: megfelelőség 36 ország UK és külföldi laborok B HER-2 értékelés: megfelelőség Csak UK laborok - Hatékony visszajelzés és ellenőrzés az UK laborokban - UK laborok működési feltétele a NEQAS megfelelés (CPA)

48 Immunhisztokémia Antigénfeltárás Rögzítés nincs CD79a 5 /T-E 10 /T-E

49 Immunhisztokémia: Standardizálás - Automatizálás Pre-analitika (?) Analitika Poszt-analitika (-)