HER2 ETŰD kérdőív kiértékelése, minőségbiztosítási tapasztalatok

Átírás

1 HER2 ETŰD kérdőív kiértékelése, minőségbiztosítási tapasztalatok Krenács Tibor Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest HER2 kurzus október 21.

2 Műtő Szövet -tárolás -rögzítés -szállítás Pre-analitika Szövetrögzítés (10% formalin) Kontrollok A reakció értékelése értelmezése Poszt-analitika Antigénfeltárás Automatizálás (Standard kitek) A TESZT eredménye Inkubációs idő hőmérséklet Analitika Reagens minőség/ affinitás Jelző-/előhívórendszer STANDARIZÁLÁS?! Eltérő esetszám és tapasztalat Reagenshígítás Eltérő reagensek és forgalmazók FDA és IVD minősített tesztek jobban teljesítenek

3 HER2 ETÜD felmérés (2014) Emlő cc. esetszám/her2+ eset: immunreakciók száma, hány FISH validáció, kezelnek-e, máshol készült primer HER2 meghatározás alapján (F)ISH validálás: csak 2+ vagy minden 2+ és 3+ esetből Szövetrögzítés: (hőmérséklet) kezdetéig eltelt idő <15 perc; perc, perc, >60 perc Antigénfeltárás: módja, idő, hőmérséklet, puffer eszköz/berendezés Primer antitest (Hígítás, inkubációs idő): Herceptest, 4B5, SP3, CB11, poliklonális, EP1045Y, A24-V Detektáló rendszer: EnVision+, Super-sensitive Polymer-HRP, Super-sensitive (biotin, vagy polimer) HRP, Vector elite, Impress, iview (biotin), UltraView (polimer), BondMax polymer Refine, UltraVision HRP polymer, Histols-MR Előhívás: DAB, AEC, VIP (kitek, gyártók), előhívási idő Automatizálás: Sequenza (Shandon/Tecan), Ventana-Nexes, Ventana-BenchMark Ultra, Ventana-BenchMark XT, Dako/LabVision-Autostainer, Leica-BondMax, BioGenex-OptiMax Kontrollok: + Kontroll (1x3+; 1x3+ és 1x2+; 1x3+, 1x2+ és 1x negatív; ill. sejtvonal) - Kontroll (normál hám pozitivitása számít/nem számít) Értékelés: ASCO/CAP 2007, vagy 2013 (30%, vagy 10%, ill. (F)ISH hatérértékek)

4 HER2 ETÜD felmérés (2014) Szövetrögzítés szobahő:19 labor 4 o C-on: 5 labor QC Labor A QC Labor B

5 Szövettárolás és szállítás hűtve MOLEKULÁRIS MEGŐRZÖTTSÉG Stabilitás: DNS > Fehérje > RNS 4 o C-ra hűteni! formalinban vagy anélkül Az RNS integritása kritikus az mrns szintű expressziós vizsgálatokhoz és a cdns alapú vizsgálatokhoz (pl. szekvenálás)

6 Hűtött rögzítés, 4 o C-os formalinban Foszforilált/aktivált jelútfehérjék kimutathatók RTK szignálút intracelluláris jelközvetítők pras EGFR (HER2) RTK pakt Molekuláris terápia célpontjai praf NFkB Phospho-proteins perk1-2 (PDGF, c-met, c-kit, IGFR) pstat

7 PATOLÓGIA SEBÉSZET Pre-analitika Optimalizált munkamenet Hűtőszekrény Bussolati G (Torino) MŰTÉT 4 o C-os Formalin > 2 cm-es minták 4 o C-on (vákumfóliában) 1-72h Hűtőtáska Szövetbank (-80 o C) Indítás/kivágás 4 o C-os formalin rögzítés Paraffinba ágyazás Genetikai vizsgálatok (1-24h)

8 Szövetrögzítés formalinban ~2 mm-es szövet HŐMÉRSÉKLET : - Penetráció romlik (heterogén rögzítés) - Keresztkötés gyorsul Rögzítés RNAse Penetráció 4 o C-on a penetráció mélyebb szövetbe is megfelelő 10%-os formalin 16-24h 4 o C-on 95%-os alkohol 2 óra 4 o C-on Standard szövet-processzálás, ~40 o C Bussolatti

9 HER2 ETÜD felmérés (2014) Antigénfeltárás Hatékonyság: magas ph, ill. hosszabb feltárás Magas: ph 8-10 Alacsony: ph 6 A hatékonyabb magas ph-jú feltárás már beelőzte a citrátot 1 labor ph7,6-os puffet írt, ha nem elírás akkor szokatlan (az antigénfeltárás nem-neutrális ph-n működik legjobban) Feltárási Idő: Normál eloszlás Hatékonyság/reagenstakarékosság miatt a görbe jobbszéle irányába célszerű tolni.

10 IHC leggyakoribb hibalehetőségek NORDIQC (Skandináv országok) forduló Fals negatív: 2559 (Slides) metszetből 740 ( 29 %) Túlhígított primer antitest Overdiluted primary antibody 247 ( 33 %) Elégtelen HIER Insuffiecient HIER 243 ( 33 %) Nem megfelelő primer antitest 107 ( 14 %) Nem értelmezhető ok 41 ( 6 %) Fals pozitív: 102 ( 4%) Túl tömény primer antitest Concentrated primary antibody 51 ( 50 %) Nem megfelelő minőségű primer antitest 16 (16 %) Túlzott antiténfeltárás 13 (13 %) A detektáló rendszer nemspecifikus reakciója 19 (19 %) Nem értelmezhető ok 3 ( 2 %)

11 ER Antigénfeltárás Érzékenység Nyúl poliklonális Her-2 Erős AR nem kritikus Standard tárolás ER HER2 HIER idő (perc) Erős AR B5, SP3, CB11 Nem jellemző Álnegativiás Friss metszés (max. 3 nap) Metszettárolás 4 o C-on

12 Patológiai Program Emlő vagy gyomor cc. IHC Her2 Túlrögzített szövetek

13 Patológiai Program Emlő cc. Túlrögzített szövetek IHC Her2

14 Patológiai Program Emlő vagy gyomor cc. IHC Her2 Jó, közepes, gyenge reakciók

15 HER2 ETÜD felmérés (2014) Primer antitest Poliklonális: Herceptest, vagy monoklonális egér: 4B5, CB11 nyúl: SP3, EP1045Y, A24V A poliklonális HER2 kiszorul (a Herceptest drága), hajlamos a reakció over-gradálására, antigénfeltárásra 4B5: a leginkább elfogadott a klinikumban, a legelterjedtebb SP3: előnye, hogy csak a 3+ és a valódi 2+ estekben pozitív CB11: nehezebb értékelni, gyulladásos sejtekben álpozitív Újabb klónokkal még kevés a klinikai validáció. Inkubálási idő: normál eloszlás Manuálisan: inkább perc javasolt Automatával: akár perc alatt (reagens megtakarítás érhető el hígabb antitest hosszabb inkubációs idejű alkalmazásával)

16 Patológiai Program Gyomor cc. IHC Her2 m4b5 rsp3 mcb11

17 HER2 ETÜD felmérés (2014) Detektáló rendszer Biotinos, vagy polimer konjugátum? 5 labor 37 o C 4 Ventana 1 BondMax 27/28 labor polimer konjugátumot használ 1/28 labor használ biotinos iview rendszert (Ventana?) UltraView a leggyakoribb, de a többi rendszer is alkalmas Kétlépéses és 3 lépéses módszerek (utóbbi pl. Novolink) Inkubálási idő: nem-normális eloszlás A 30-szobahőn manuálisan is megfelelő Automatával lehet rövidebb is, ésszerűen perc javasolt. (reagens megtakarítás, nagyobb primer antitest hígítás hosszabb inkubációs idejű detektálással)

18 Pathológiai Program IHC-Her2 Saját metszet 3+ ~1+ Túl érzékeny reakció Endogén biotin 0+ ~1-2+ Endogén biotin Erős citoplazma

19 Pathológiai Program Immunhisztokémia Normál hámpozitivitás

20 HER2 ETÜD felmérés (2014) Előhívás DAB, vagy más kromogén kit?

21 Pathológiai Program IHC-Her2 Saját metszet Hiányos Erős citplazma Erős stróma Széteső szövet

22 HER2 ETÜD felmérés (2014) A módszer végrehajtása Manuális vagy automatizátt? 19/26 automatizált, 7 manuális (ebből 1 sequenza)

23 HER2 ETÜD felmérés (2014) Kontrollok Csak 3+-es vagy egyéb is, ill. szövet, vagy sejtblokk? A legideálisabb a 3+, 2+ (és negatív esetek) kombinálása (nehéz 2+ esetet találni)

24 HER2 ETÜD felmérés (2014) Interpretálás 23/30 Vizsgálja a normál hámot; 1/30 Nem számít ha a normál hám pozitív 20/30=2013-as ASCO/CAP (DE, ebből 6/30=30%+1; 30%=össz.7 labor) 2/30=2007-es ASCO/CAP (DE, 10%) 7/30 nincs adat IHC 2+-ből: 20/30 Automatikusan; 7/30 Onkológus kérésére indikál (F)ISH-t QC 20/30 Megnyugtató (4-5 közötti átlag) Más válasz nem jött Más patológia HER2 vizsgálata alapján terápia 17/30 nem; 13/30 igenből 6-nál ismert az esetszám (1,5,15,20, 50, 70)

25 HER2 ETÜD felmérés (2014) Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján Alkalmazott Javasolt C Labor Antigénfeltárás: MW 15, ph 6 (egyből hűt); MW 40, ph 6 Primer antitest: CB11 (BioGenex) RTU 30 ; Detetktáló: Supersensitive polimer 15 ; 30 perc inkubálás Manuális festés Hullámzó teljesítmény sokszor a határon Hibalehetőségek: Elégtelen antigénfeltárás (a rögzítéshez képest) Túl rövid detektálás (a detektáló érzékenységéhez képest)

26 HER2 ETÜD felmérés (2014) Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján Alkalmazott Javasolt D Labor Antigénfeltárás: MW 12, ph 9 (hülni hagy); MW 30 Primer antitest: A24-V (Histopat.) hígítás?, 60 ; Detetktáló: EnVision polimer 30 ; Automata (Autostainer?) Hibalehetőségek: Elégtelen antigénfeltárás (a rögzítéshez képest) Primer antitest hígítás? (akár tovább hígítható) Méréskelt-jó teljesítmény, legalább 8 éve nem vesz részt QC-ben

27 HER2 ETÜD felmérés (2014) Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján Alkalmazott Javasolt E Labor Antigénfeltárás: MW 15, ph 6 (15 hülni hagy); MW 30 Primer antitest: EP1045Y (BioCare) 1:100, 60 ; Detetktáló: EnVision polimer 30 ; Automata: Dako-Autostainer Szakértő felügyelet + a Preanalitika stabilizálása Hibalehetőség: Elégtelen antigénfeltárás (a rögzítéshez képest) Jó-kiváló teljesítmény, kezdeti kihagyás után aktív a QC-ben

28 HER2 ETÜD felmérés (2014) Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján Alkalmazott Javasolt F Labor Antigénfeltárás: BondMax ph9, 10 ; MW 20 Primer antitest: CB11 (NovoCastra) 1:400, 30 ; Detetktáló: BondMax Refine polimer 8 ; Automata: BondMax Hibalehetőség: Elégtelen antigénfeltárás (a rögzítéshez képest) Rövid detektálás A primer antitest váltása? Jó teljesítmény, de hullámzó, aktív a QC-ben

29 HER2 ETÜD felmérés (2014) Hibalehetőségekre a beküldött és QC adatok alapján Alkalmazott Javasolt G Labor Antigénfeltárás: BondMax ph6, 30 ; Primer antitest: SP3 (Histopat) 1:50, 15 ; 30 Detetktáló: BondMax Refine polimer 16 ; Automata: BondMax Hibalehetőség: Korrekt protokoll, de Hosszabb inkubálás mellett a primer antitest hígítható Gyakorlatilag nem vesz részt a QC programban

30 Patológia + + HER2 teszt QualiCont eredmények között ( Forduló) HER2 teszt összesen 33 fordulóban 0 3+/FISH+ Technikai részletek a részvevőktől 2+/FISH Ford.

31 HER2 teszt - QualiCont eredmények Összes: 33 Forduló ig ig ig

32 HER2 tesz - QualiCont eredmények ig ig 36 labor 30 labor

33 HER2 tesz - QualiCont eredmények Antigénfeltárás MW citrát 1-2x5

34 HER2 tesz - QualiCont eredmények Primer antitest

35 HER2 tesz - QualiCont eredmények Primer antitest

36 HER2 tesz - QualiCont eredmények Detektáló rendszer

37 HER2 tesz - QualiCont eredmények Automatizálás

38 Receptor meghatározás hazánkban Kisebb intézetekben (IHC), ill. centrumokban (IHC, ISH) Prof. Kulka Janina (SE II. sz. Patológiai Intézet) Her2 FISH konzultációs esetek A Her2 IH eredménye - 64 eset 8% 30% 62% Csökkent Maradt Nőtt 7 beküldött 3+ esetből: - 3 eset score 0-3 eset score 2+, FISH: nem amplifikált - 1 eset score 1+ lett. Fölösleges terápia

39 Emlőcarcinoma diagnosztikája III. Konszenzus konferencia alapján Cserni és mtsai: Magyar Onkológia 2016, 60: Gyors (<30 perc) rögzítés nélkül (ill. 4 o C-os tárolás) Rögzítés: max percen belül (5x-ös formalin) rámetszés nélkül a patológiai osztályra Ha nem hűtve 4 o C-on tárolni és szállítani (foszforilalt fehérjék, DNS, RNS megőrzés) Rögzítési idő: min. 6h (core biopsia) 24 - max.72h (5-10 mm-es szövet) Receptormeghatározás: - 3-napon belül metszett, adhéziós tárgylemezre (4 o C-on sötétben 2 hónapig tárolható) - citológiai mintán csak formalinrögzítés után Külső minőségellenőrzési program: folyamatos megfelelés IVD jelzésű primer antitestek előnyben Automatizálás előnyben (de tapasztalattal megoldható anélkül is) Döntő hiba: elégtelen antigénfeltárás (túlrögzítés) (ismétlésnél a feltárást 30-50%-al növelni)

40

41 HER-2 körvizsgálatok és 3+ esteket gyakorisága ben laboronként A 90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 2+ és 3+ esetek előfordulási gyakorisága / /3+ Körvizsgálatok: Alulértékelt HER2 3+-es eset Magyar Onkológia 51:23 29, 2007 Álnegatív Álpozitív - résztvevők értékelésében 22/218 - szakértők értékelésében 21/218 10% Felülértékelés csak 1% volt, de negatív esetek 2+-re értékelése - 5%-ban résztvevők ill. - 7%-ban szakértők, előfordult.