PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. SK vizsgálat az Autostainer Link 48 berendezéshez

Átírás

1 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK vizsgálat az Autostainer Link 48 berendezéshez Tartalomjegyzék 1. Javasolt alkalmazás Összegzés és magyarázat Nem laphámsejtes NSCLC A fej és a nyak laphámkarcinómája (SCCHN) Uroteliális karcinóma Melanóma Az eljárás elve Mellékelt anyagok Szükséges, de nem biztosított anyagok Óvintézkedések Tárolás Minták előkészítése Paraffinba ágyazott metszetek Kalciummentesített szövetek használata Metszettárolási javaslat A reagens előkészítése Az Autostainer Link 48 készüléken végzett festési eljárás Minőség-ellenőrzés A teszt igazolása A festés értelmezése A festés értelmezése Nem laphámsejtes NSCLC A festés értelmezése: A fej és a nyak laphámkarcinómája (SCCHN) A festés értelmezése: Uroteliális karcinóma A festés értelmezése: Melanóma Tárgylemez kiértékelése Korlátozások Általánosan érvényes korlátozások Termékspecifikus korlátozások A nem klinikai teljesítmény értékelése A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx analitikai specificitása Normál és daganatos szövetek Teljesítmény értékelése Teljesítmény értékelése: Nem laphámsejtes NSCLC Teljesítmény értékelése: SCCHN Teljesítmény értékelése: UC Teljesítmény értékelése: Melanóma Hibajavítás Irodalomjegyzék...22 P03914HU_04/SK / p. 1/23

2 1. Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai használatra. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx egy kvalitatív, Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 antitestet alkalmazó immunhisztokémiai vizsgálat, mely a formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE), nem laphámsejtes, nem-kissejtes tüdőrákszövetekben (NSCLC),a fej és a nyak laphámkarcinómáiban (SCCHN), uroteliális karcinóma (UC) és melanómaszövetekben előforduló PD-L1 protein detektálására használható az Autostainer Link 48 berendezésen található EnVision FLEX megjelenítőrendszer segítségével. A specifikus tumorfestésértelmezési útmutatások szerint a PD-L1 protein expressziója a bármilyen intenzitású részleges vagy teljes membránfestődést mutató értékelhető ráksejtek százaléka. A nem laphámsejtes NSCLC és SCCHN szövetekben a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével detektált PD-L1 expresszió összefüggésben lehet az OPDIVO (nivolumab) által eredményezett jobb túlélési aránnyal. A PD-L1 expresszióban a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével detektált uroteliális karcinóma összefüggésben lehet az OPDIVO által eredményezett jobb válaszaránnyal. A melanómaszövetekben a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével detektált PD-L1 expresszió segítheti azoknak a betegeknek a felmérését, akiknek az esetében felmerül a kombinált OPDIVO - (nivolumab) és YERVOY -kezelés (ipilimumab). 2. Összegzés és magyarázat A PD-1 ligandumok (PD-L1 és PD-L2) a T-sejtek PD-1 receptorhoz kötődve gátolják a T-sejtek proliferációját és citokintermelését. Egyes tumorokban upregulálódnak a PD-1 ligandumok, és az ezen az útvonalon történő jelátvitel hozzájárulhat a tumorok T-sejtek által végzett aktív immunfelügyeletének (surveillance) gátlásához (1). Az OPDIVO (nivolumab) egy humán immunglobulin G4 (IgG4) monoklonális antitest, amely a PD-1 receptorhoz kötődik, és blokkolja annak PD-L1 és PD-L2 fehérjével való interakcióját, melynek eredményeképpen az immunválasz PD-1 jelátviteli útvonal által mediált gátlása jön létre, ideértve a tumorral szemben adott immunválasz gátlását is (2). Szingén egértumor modellekben a PD-1 aktivitás gátlása csökkent tumornövekedést eredményezett (3). Az OPDIVO klinikai előnyeit és a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai hasznosságát vizsgáltuk NSCLC-, SCCHN-, UC- és melanómaszövetekben. 2.1 Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 fehérjéket expresszáló tumorsejtek nem laphámsejtes, nem-kissejtes tüdőrák-páciensmintákban történő detektálása arra utalhat, hogy az OPDIVO (nivolumab) segítségével biztosított kezelés javíthatja a túlélési arányt. Az OPDIVO Bristol-Myers Squibb által szponzorált klinikai vizsgálatában részt vevő páciensek mintáit a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével vizsgáltuk. A CA klinikai vizsgálat az OPDIVO készítménnyel kezelt, nem-laphámsejtes NSCLC páciensek PDL1 státuszának felmérésére szolgáló PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai validitását vizsgálták (5,11). 2.2 A fej és a nyak laphámkarcinómája (SCCHN) A PD-L1 fehérjéket expresszáló tumorsejtek SCCHN-páciensmintákban történő detektálása arra utalhat, hogy az OPDIVO (nivolumab) segítségével biztosított kezelés javíthatja a túlélési arányt. Az OPDIVO Bristol-Myers Squibb által szponzorált klinikai vizsgálatában részt vevő páciensek mintáit a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével vizsgáltuk. A CA klinikai vizsgálat az OPDIVO készítménnyel kezelt, nem-laphámsejtes SCCHN páciensek PDL1 státuszának felmérésére szolgáló PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai validitását vizsgálták (16). 2.3 Uroteliális karcinóma A PD-L1 fehérjéket expresszáló tumorsejtek UC-páciensmintákban történő detektálása arra utalhat, hogy az OPDIVO (nivolumab) segítségével biztosított kezelés javíthatja a válaszarányt. Az OPDIVO Bristol-Myers Squibb által szponzorált klinikai vizsgálatában részt vevő páciensek mintáit a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével vizsgáltuk. A CA klinikai vizsgálat az OPDIVO készítménnyel kezelt UC páciensek PD L1 státuszának felmérésére szolgáló PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai validitását vizsgálták. 2.4 Melanóma A citotoxikus T-limfocita antigén-4 (CTLA-4) a T-sejt aktivitásának negatív regulátora. A YERVOY (ipilimumab) monoklonális antitest, amely a CTLA-4-hez kapcsolódik és meggátolja a CTLA-4 kölcsönhatását a ligandumaival (CD80/CD86). Kimutatták, hogy a CTLA-4 blokádja megnöveli a T-sejt aktiválását és osztódását, ami hozzájárul a tumorellenes immunreakció általános megerősödéséhez (4). A PD-1 és a CTLA-4 kiegészítő és nem redundáns mechanizmusokon keresztül gátolja a tumorellenes immunitást. Az OPDIVO monoterápia és az OPDIVO + YERVOY kombinált terápia jelentősen nagyobb javulást eredményezett a progressziómentes túlélésben az egyedüli YERVOY terápia alkalmazásához képest olyan betegek esetében, akik előrehaladott melanómában szenvednek és korábban még nem részesültek kezelésben (8-10). A Bristol-Myers Squibb által szponzorált klinikai vizsgálatban részt vevő, OPDIVO készítménnyel kezelt páciensek melanóma tumorszövetmintáit a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével vizsgáltuk. A CA számú klinikai vizsgálat az OPDIVO, OPDIVO + YERVOY kombináció és a csak YERVOY készítménnyel kezelt, melanómában szenvedő betegek PD-L1 expressziójának felmérésére szolgáló PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai validitását vizsgálta. Az OPDIVO és a YERVOY a Bristol-Myers Squibb védjegyei. 3. Az eljárás elve A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx az FFPE minták Autostainer Link 48 berendezésben és PT Link előkezelő modullal végzett IHC festési eljárásához optimalizált reagenseket és protokollt tartalmazza (6). Az elsődleges monoklonális PD-L1 antitesttel vagy a negatív kontroll reagenssel (NCR) végzett inkubálást követően a mintákat az elsődleges antitestet termelő fajra specifikus linker antitesttel, majd végül dextrán polimer vázhoz kötött másodlagos antitest molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból álló, használatra kész megjelenítő reagenssel kell inkubálni. A következő lépésben hozzáadott kromogén enzimatikus konverziója látható reakciótermék kicsapódását eredményezi az antigén helyén. A kromogén erősítő reagens módosítja a kromogén reakció színét. Ezt követően elvégezhető a minta kontrasztfestése, majd a fedőlemez felhelyezése. Az eredményeket fénymikroszkóp segítségével kell értelmezni. A festések validálása érdekében két formalinnal fixált, paraffinba ágyazott humán sejtvonalakat tartalmazó kontroll tárgylemezt is biztosítunk. P03914HU_04/SK / p. 2/23

3 4. Mellékelt anyagok PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (kód: SK005) Az alább felsorolt anyagok 50 teszt elvégzésére elegendők (50 metszetet a PD-L1 elleni elsődleges antitesttel kell inkubálni, 50 metszetet pedig a negatív kontroll reagenssel, ez összesen 100 metszet). A készletben további PD-L1 elleni elsődleges antitestek találhatók 15 darab, sejtvonalakat tartalmazó kontroll lemez megfestéséhez. A tesztek száma azon alapul, hogy minden reagensből 2 x 150 µl-t kell használni metszetenként, kivéve a DAB+ és a Target Retrieval Solution (antigénfeltáró oldat) reagenst. A készlet legfeljebb 15 különálló futtatáshoz elegendő anyagot tartalmaz. Mennyiség Leírás 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Hidrogén-peroxidot, felületaktív anyagot (detergens) és 0,015 mol/l nátrium azidot tartalmazó pufferelt oldat. 1 x 19,5 ml Primer antitest: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Monoklonális nyúl anti-pd-l1 antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 15 ml Negative Control Reagent* NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonális nyúl kontroll IgG antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. *A monoklonális nyúl kontroll IgG értékesítése a Cell Signaling Technology licence alapján történik. 1 x 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT Nyúl immunglobulinok elleni egér szekunder antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextránhoz kötött peroxidáz molekulák és nyúl és egér immunglobulinok elleni kecske másodlagos antitest molekulák, stabilizáló proteint és antimikróbás szert tartalmazó pufferelt oldatban. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufferelt oldat hidrogén-peroxiddal és antimikróbás szerrel. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin-tetrahidro-klorid szerves oldószerben. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Réz-szulfát vízben. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Pufferelt oldat, ph 6,1, felületaktív anyaggal és antimikróbás szerrel. 15 lemez PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Control Slides (kontroll lemezek) CONTROL SLIDES Lemezenként két sejtvonal lecentrifugált pelletéből készített, formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszet: NCI-H226** pozitív PD-L1 protein expresszióval (pozitív PD-L1 protein expressziójú emberi tüdő laphámkarcinómából származik) és MCF-7 negatív PD-L1 protein expresszióval (negatív PD-Le expressziójú humán emlő adenokarciómából származik). P03914HU_04/SK / p. 3/23

4 PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1 negatív NCI-H226: PD-L1 pozitív ** Ezúton szeretnénk elismerni Dr. AF Gazdar és Dr. JD Minna (NIH) hozzájárulását az NCI-H226 (ATCC Number: CRL-5826 ) (7) sejtvonal kifejlesztéséhez. Megjegyzés: A reagensek kifejezetten a készlettel való használatra készültek. A teszt leírt teljesítményének megőrzése érdekében tilos bármiféle helyettesítést végezni, kivéve az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (kód: K8005) reagenst. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx az Autostainer Link 48 berendezéssel történő használatra készült. További információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 és a PT Link használati útmutatóit. 5. Szükséges, de nem biztosított anyagok PT Link Pre-treatment Module (kód: PT100/PT101/PT200) (előkezelő modul) Autostainer Link 48 készülék (kód: AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kód: K8007) (mosópuffer) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód: K8008) Desztillált vagy ionmentes víz (reagens minőségű víz) Stopperóra Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenőrzéséhez (lásd a Minőség-ellenőrzés című részt és a 5. táblázatot) Mikroszkópos tárgylemezek: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezek vagy Fisherbrand Superfrost Plus pozitív töltésű tárgylemezek. Fedőlemezek Tartós rögzítő közeg és segédreagensek a fedőlemezek rögzítéséhez Fénymikroszkóp (4 40x optikai nagyítás) 6. Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai alkalmazáshoz. 2. Foglalkozásszerű felhasználóknak. 3. A termék nátrium-azidot (NaN 3 ) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgező vegyület. A termékben alkalmazott koncentrációkban, bár nem sorolható be veszélyes anyagként, a NaN 3 reakcióba léphet az ólomból vagy rézből készült vízvezetékekkel, és erősen robbanékony fém-azidok felhalmozódásához vezethet. Kiöntéskor, a fém-azidok felhalmozódását megelőzendő, nagy mennyiségű vízzel kell leöblíteni (12). 4. Az elsődleges antitest, a negatív kontroll reagens, a linker és a megjelenítő reagens állati eredetű anyagot tartalmaz. 5. A fixálás előtt és után lévő mintákat, és a velük érintkező anyagokat potenciális fertőzéshordozóként kell kezelni, és a megfelelő óvintézkedéseket alkalmazva kell ártalmatlanítani (13). 6. A megadottól eltérő inkubálási idők, hőmérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. 7. A reagensek optimális koncentrációra vannak hígítva. További hígítás az antigénfestődés elvesztését eredményezheti. 8. A megjelenítő reagens, a folyékony DAB+ kromogén és az elkészített DAB+ szubsztrát-kromogén károsodhat, ha túlzottan erős fény éri. Ne tárolja a rendszer komponenseit és ne végezze a festést erős fényben, például közvetlen napfényben. 9. A paraffinmaradvány álnegatív eredményeket okozhat. 10. A javasolttól eltérő reagenstérfogatok használata a látható PD-L1 immunreaktivitás elvesztését okozhatja. 11. A lemez 2/3-ára vagy nagyobb területre kiterjedő, nagyméretű szövetmetszetek esetében elfordulhat, hogy 3x150 µl reagensre lesz szükség. 12. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználót alaposan ki kell képezni a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetően. További információért tájékozódjon a biztonsági adatlapról (Safety Data Sheet, SDS). 13. A szemmel és bőrrel való érintkezés elkerülése érdekében viseljen megfelelő személyi védőfelszerelést. 14. A fel nem használt oldatot a helyi, területi, nemzeti és nemzetközi hatósági előírásoknak megfelelően kell megsemmisíteni. 15. Foglalkozásszerű felhasználók részére igény esetén anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. Veszély DAB+ kromogén: 1 5% bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraammónium-tetraklorid H350 Rákot okozhat. H341 Feltehetően genetikai károsodást okoz. P201 Használat előtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. P202 Ne használja addig, amíg az összes biztonsági óvintézkedést el nem olvasta és meg nem értette. P280 Védőkesztyű használata kötelező. Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. Védőruha használata kötelező. P308 + P313 Expozíció vagy annak gyanúja esetén: orvosi ellátást kell kérni. P405 Elzárva tárolandó. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. P03914HU_04/SK / p. 4/23

5 Figyelmeztetés EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5% citromsav H319 Súlyos szemirritációt okoz. H411 Mérgező a vízi élővilágra, hosszan tartó károsodást okoz. P280 Szemvédő vagy arcvédő használata kötelező. P273 Kerülni kell az anyag környezetbe jutását. P264 A használatot követően a kezet alaposan meg kell mosni. P305 + P351 + P338 SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. P337 + P313 Ha a szemirritáció nem múlik el: orvosi ellátást kell kérni. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történő elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. 7. Tárolás A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx összetevőit, beleértve a kontroll lemezeket, az eredeti tartályában, sötét helyen, 2-8 C hőmérsékleten kell tárolni, amikor nincsenek használatban az Autostainer Link 48 berendezésben. Ne használja a készletet a dobozon feltüntetett lejárati időn túl. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérő feltételek között tárolják, akkor a felhasználó köteles a feltételeket validálni. Nincsen nyilvánvaló jel, amely a termék instabilitására utalna, ezért a páciens mintáival egyidejűleg egy pozitív és egy negatív kontroll vizsgálatát is el kell végezni. 8. Minták előkészítése A mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon IHC festésre. A mintákat a szabványos szövetfeldolgozási módszerekkel kell feldolgozni. 8.1 Paraffinba ágyazott metszetek Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetek használhatók. Javasolt kezelési és feldolgozási feltételek: <30 perc ischaemiás idő a fixálószerben történő elmerítést megelőzően, és órás fixálási idő 10%-os neutrális pufferelt formalinban. Egyéb fixálószereket nem validáltunk, így azok hibás eredményeket adhatnak. A mintákból készített 3 vagy 4 mm vastagságú blokkot 10%-os neutrális pufferelt formalinnal kell fixálni, alkoholsorral vízteleníteni és xilollal mosni, majd végül olvasztott paraffinnal átitatni. A paraffin hőmérséklete nem haladhatja meg a 60 C-ot. 8.2 Kalciummentesített szövetek használata A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készlet kalciummentesített szöveteken történő használatát nem validáltuk, ezért az nem ajánlott. 8.3 Metszettárolási javaslat A szövetmintákat 4-5 µm-es metszetekre kell vágni. A metszetkészítést követően a szöveteket pozitív töltésű Fisherbrand Superfrost Plus tárgylemezekre vagy Dako FLEX IHC mikroszkópos tárgylemezekre (kód: K8020) kell rögzíteni, majd 1 órán át 58 ± 2 C-os sütőben inkubálni. Az antigenitás megőrzése érdekében a tárgylemezre rögzített szövetmetszeteket sötét helyen, 2-8 C-os hőmérsékleten, vagy legfeljebb 25 C-os szobahőmérsékleten kell tárolni, és a metszetkészítést követő 4 hónapon belül meg kell festeni. A szövetek épségének és antigenitásának megőrzése érdekében a rögzítést követően tilos a tárgylemezeket 25 C-ot meghaladó hőmérsékleten tárolni vagy kezelni. 9. A reagens előkészítése A festés előtt a következő reagenseket kell elkészíteni: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Készítsen megfelelő mennyiségű 1x Target Retrieval Solution, Low ph reagenst a Target Retrieval Solution, Low ph (50x) reagens 1:50 arányú hígításával. Használjon reagens minőségű vizet. Az 1x Target Retrieval Solution előírt ph értéke: 6,1 ± 0,2. A Target Retrieval Solution, Low ph (50x) reagens egy darab 30 ml-es palackjának tartalmát 1:50 arányban hígítva 1,5 l 1x reagens áll rendelkezésre, amelyet a PT Link tartályba töltve egy alkalommal legfeljebb 24 tárgylemez kezeléséhez elegendő. Három használat, illetve a hígítást követő 5. nap után öntse ki az 1x Target Retrieval Solution oldatot. Szükség szerint további EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) rendelhető a K8005 kódszámot használva. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Készítsen elő megfelelő mennyiségű Wash Buffer reagenst a Wash Buffer (20x) reagens 1:20 arányú hígításával. Használjon reagens minőségű vizet. A fel nem használt 1x oldatot 2 8 ºC-on legfeljebb egy hónapig lehet tárolni. Ha zavaros a puffer, semmisítse meg. További információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 használati útmutatóját. Az EnVision FLEX Wash Buffer (20x) reagens a K8007 kódszámon rendelhető. DAB+ szubsztrát-kromogén oldat A használat előtt az oldatot alaposan fel kell keverni. Az oldatban létrejövő csapadék nem befolyásolja a festés minőségét. A DAB+ Substrate-Chromogen Solution reagens elkészítéséhez adjon 1 csepp folyékony DAB+ Chromogen reagenst egy ml DAB+ Substrate Buffer reagenshez, majd keverje össze. Az elkészített Substrate-Chromogen reagens sötét helyen, 2 8 C-on tárolva 5 napig stabil. P03914HU_04/SK / p. 5/23

6 Fontos megjegyzések: Ha a DAB+ Substrate Buffer üveg teljes tartalmát használja, adjon hozzá 9 csepp DAB+ kromogént. A címke szerint az üveg tartalma 7,2 ml, ez azonban a használható tartalomra értendő, és nem foglalja magában az üveg holttérfogatát. A palackban lévő folyékony DAB+ Chromogen színe átlátszótól levendula vagy lilásbarna színig változhat. Ez nem befolyásolja a termék teljesítményét. A hígítást a fenti utasításoknak megfelelően végezze el. Amennyiben túl nagy mennyiségű folyékony DAB+ Chromogen reagenst ad hozzá a DAB+ Substrate Buffer reagenshez, azzal csökkenti a pozitív jelet. 10. Az Autostainer Link 48 készüléken végzett festési eljárás Az eljárással kapcsolatos megjegyzések A felhasználó használat előtt gondosan olvassa el az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel és készülékkel (lásd: Óvintézkedések). Az immunfestés előtt valamennyi reagenst hozza szobahőmérsékletre (20-25 C). A további inkubálásokat is szobahőmérsékleten kell végezni. Ne hagyja, hogy a festés során a szövetmetszetek kiszáradjanak. A kiszáradt metszeteken nagyobb mértékű lehet a nem specifikus festődés. A szükséges lépések és inkubációs idők előre be van programozva a Dako Link szoftverben. A programozási protokollokkal és a tárgylemezek és a reagensek behelyezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 és a PT Link használati útmutatóját. Megjegyzés: A jelen rendszerhez mellékelt reagensek és instrukciók a javasolt reagensekkel és anyagokkal történő használat esetén optimális teljesítményt biztosítanak. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idő vagy a hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Festési protokoll A DakoLink legördülő menüben válassza ki a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx festési protokollt. A festéshez szükséges lépések és az inkubálási idők előre be vannak programozva a DakoLink szoftverbe. Amennyiben a megfelelő PD-L1 IHC 28-8 pharmdx protokollok nem találhatók meg az Ön szerverén, kérjük, vegye fel a kapcsolatot a helyi műszaki szervizképviselettel. 1. lépés: Deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárás Javasolt eljárás: A részletekkel kapcsolatban lásd a PT Link felhasználói útmutatóját. Állítsa a PT Link (kód: PT100/PT101/PT200) Preheat (Előmelegítés) és Cool (Hűtés) értékét 65 C-ra. Állítsa be a Heat (Melegítés) értékét 97 C-ra, az időt pedig 20 percre. Töltse fel a PT Link tartályait egyenként 1,5 l Target Retrieval Solution, Low ph, 1x munkaoldattal úgy, hogy elfedje a szövetmetszeteket. Melegítse elő a Target Retrieval Solution reagenst 65 C-ra. Merítse be a rögzített FFPE szövetmetszeteket tartalmazó Autostainer állványokat az előmelegített Target Retrieval Solution, Low ph, 1x munkaoldatba a PT Link tartályban. Inkubálja 20 percig 97 C-on.. Amint befejeződött az antigénfeltáró inkubálás és a hőmérséklet visszahűlt 65 C-ra, távolítsa el a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer tárgylemezállványokat a PT Link tartályából, és azonnal helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer tárgylemezállványt a hígított, szobahőmérsékletű Wash Buffer (kód: K8007) reagenst tartalmazó tartályba (pl. PT Link Rinse Station, kód: PT109). Hagyja a tárgylemezeket hígított, szobahőmérsékletű Wash Buffer reagensben 5 percig. 2. lépés: Festési eljárás A deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárást követően helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer állványokat az Autostainer Link 48 készülékbe. Ügyeljen arra, hogy a tárgylemezeken elegendő puffer maradjon a betöltés alatt és a futtatás indítása előtt. A készülék a megfelelő reagens hozzáadásával elvégzi a festési eljárást, követi az inkubációs időt, és leöblíti a tárgylemezeket a reagensek között. A reagens alkalmazási időtartamai előre be vannak programozva a Dako Link szoftverében. 3. lépés: Kontrasztfestés A tárgylemezek kontrasztfestését EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód: K8008) reagenssel kell végezni 7 percig. A hematoxilin inkubációs ideje előre be van programozva a protokollba. 4. lépés: Rögzítés Nem víz alapú, tartós rögzítőközeget kell használni. Megjegyzés: Idővel némi fakulás előfordulhat a megfestett tárgylemezeken. Ez többféle tényezőtől függ, például a kontrasztfestéstől, az alkalmazott rögzítőközegektől és módszerektől, valamint a tárgylemezek tárolásának körülményeitől. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahőmérsékleten (20 25 C között) kell tárolni. 11. Minőség-ellenőrzés A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készlet reagenseinek minőség-ellenőrzését a fent leírt antigénfeltárási és festési eljárásokat alkalmazó immunhisztokémiai eljárás segítségével végeztük. Amennyiben a felhasználó laboratóriuma eltér az ajánlott fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárásoktól, az jelentős bizonytalanságot okozhat az eredményekben. Minden egyes festési futtatás esetén mellékelni kell minőségbiztosítási kontrollokat. Ezen minőségbiztosítási kontrollokat a 5. táblázat tartalmazza, többek között a következőket: egy H&E festett páciens-szövetminta; labor által biztosított negatív és pozitív kontroll szövetek; és egy Dako által biztosított kontroll tárgylemez (15). Az Egyesült Államokban további információkért lásd a College of American Pathologists (CAP) immunhisztokémiai minősítő programjának minőség-ellenőrzési követelményeit és a CLSI immuncitokémiai minőségbiztosítás elfogadott irányelveit (14). P03914HU_04/SK / p. 6/23

7 12. A teszt igazolása A festőrendszer diagnosztikai eljárásban történő első felhasználása előtt a felhasználónak ellenőriznie kell a teszt teljesítményét. Ehhez ismert pozitív és negatív szöveteket képviselő, ismert immunhisztokémiai (IHC) teljesítményjellemzőkkel rendelkező, laboratórium által biztosított mintasorozaton kell igazolnia a tesztet. Tekintse meg a terméktájékoztató jelen fejezetében korábban ismertetett minőségellenőrzési eljárásokat. Ezeket a minőség-ellenőrzési eljárásokat minden új készletnél, illetve a teszt paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. A potenciális problémákat, azok okait és a lehetséges korrekciós intézkedéseket a 22. táblázatban ismertetjük. 13. A festés értelmezése A tárgylemez kiértékelését patológusnak kell elvégeznie fénymikroszkóp segítségével. A PD-L1 immunhisztokémiai festés értelmezése és értékelése céljából a teljes minta kezdeti felméréséhez 4x-es, míg az ezt követő értékeléshez 10 20x-os nagyítású objektívet lehet használni (szükség esetén az ellenőrzéshez pedig 40x-es objektívet). A PD-L1 festést egy barna (3,3 -diaminobenzidin, DAB) reakciótermék jelzi. A daganatsejtek teljes kerületén észlelhető és/vagy a kerület mentén részlegesen megjelenő lineáris membránfestődés bármilyen intenzitás esetén pozitív PD-L1 festődést jelez. A teljes mintát ki kell értékelni. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett páciensszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen. A részletes útmutatóval kapcsolatban tekintse meg jelen dokumentumnak a festés jelzésspecifikus értelmezésére vonatkozó részeit. Ha előfordul, a citoplazma-festődést nem kell beleszámolni az életképes sejtek közé. A jóindulatú sejtek és az immunsejtek (pl. az infiltráló limfociták vagy a makrofágok) szintén festődhetnek a PD-L1 hatására; ezeket azonban nem szabad figyelembe venni a PD-L1 pozitivitást meghatározó pontozás során. A tárgylemezeket minden festési futtatás során a 5. táblázatban megadott sorrendben kell megvizsgálni a festési menet érvényességének meghatározásához és a szövetminta festődésének kiértékeléséhez. A PD-L1 pontszámmal kapcsolatos további útmutatóval kapcsolatban tekintse meg jelen dokumentumban a festés jelzésspecifikus értelmezésére vonatkozó táblázatokat, valamint a megfelelő PD-L1 IHC 28-8 pharmdx értelmezési kézikönyvet a vonatkozó jelzéssel kapcsolatban A festés értelmezése Nem laphámsejtes NSCLC A teljes mintát ki kell értékelni. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett páciensszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen. Nem laphámsejtes NSCLC minták esetén jegyezze fel a bármilyen intenzitású PD-L1 kerületi és/vagy részleges lineáris plazmamembránfestődést mutató életképes tumorsejtek százalékos arányát. 1. táblázat: A festés értelmezése: Nem laphámsejtes NSCLC Jelzés Az értékeléshez minimálisan szükséges életképes tumorsejtek Jóindulatú sejtek és immunsejtek Citoplazma festődés, stromális, nekrotikus sejtek és sejtszennyeződések Egyéb elemek Nem laphámsejtes NSCLC 100 Nem része az értékelésnek Nincs figyelembe véve az értékelésnél NA 13.2 A festés értelmezése: A fej és a nyak laphámkarcinómája (SCCHN) Ezt a vizsgálatot invazív SCCHN szövetmintákhoz hitelesítették, és nem in situ diszplázia vagy karcinóma fókuszok lézióihoz. Minden PD-L1 antitesttel megfestett mintához tartoznia kell egy H&E módszerrel festett tárgylemeznek az invazív karcinómia, az in situ karcinóma és a környező normál epitélium megfelelő felmérése érdekében. A teljes mintát ki kell értékelni. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett páciensszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen. SCCHN minták esetén jegyezze fel a bármilyen intenzitású PD-L1 kerületi és/vagy részleges lineáris plazmamembrán-festődést mutató életképes tumorsejtek százalékos arányát. 2. táblázat: A festés értelmezése: SCCHN Jelzés Az értékeléshez minimálisan szükséges életképes tumorsejtek SCCHN 100 Jóindulatú sejtek és immunsejtek Nem része az értékelésnek Citoplazma festődés, stromális, nekrotikus sejtek és sejtszennyeződések Nincs figyelembe véve az értékelésnél Egyéb elemek Az in situ diszplázia vagy karcinóma fókuszok sejtjei nem szerepelnek az értékelésben. A H&E lemezek lehetővé teszik az invazív karcinóma, az in situkarcinóma és a környező normál epitélium megfelelő felmérését. P03914HU_04/SK / p. 7/23

8 13.3 A festés értelmezése: Uroteliális karcinóma Ezt a vizsgálatot invazív UC szövetmintákhoz hitelesítették, és nem in situ diszplázia vagy karcinóma fókuszok lézióihoz. Minden PD-L1 antitesttel megfestett mintához tartoznia kell egy H&E módszerrel festett tárgylemeznek az invazív karcinómia, az in situ karcinóma és a környező normál epitélium megfelelő felmérése érdekében. A teljes mintát ki kell értékelni. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett páciensszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen. UC minták esetén jegyezze fel a bármilyen intenzitású PD-L1 kerületi és/vagy részleges lineáris plazmamembrán-festődést mutató életképes tumorsejtek százalékos arányát. 3. táblázat: A festés értelmezése: UC Jelzés Az értékeléshez minimálisan szükséges életképes tumorsejtek Jóindulatú sejtek és immunsejtek Citoplazma festődés, stromális, nekrotikus sejtek és sejtszennyeződések Egyéb elemek UC 100 Nem része az értékelésnek Nincs figyelembe véve az értékelésnél Az in situ diszplázia vagy karcinóma fókuszok sejtjei nem szerepelnek az értékelésben. A H&E lemezek lehetővé teszik az invazív karcinóma, az in situkarcinóma és a környező normál epitélium megfelelő felmérését A festés értelmezése: Melanóma A teljes mintát ki kell értékelni. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett páciensszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen. A minták PD-L1 pozitívnak tekinthetők, ha a melanómasejtek 1%-a bármilyen intenzitású, kerületi és/vagy részleges lineáris PD-L1 plazmamembrán-festődést jelez. A minták PD-L1 negatívnak tekinthetők, ha a melanómasejtek < 1%-a jelez bármilyen intenzitású, kerületi és/vagy részleges lineáris PD-L1 plazmamembrán-festődést. MEGJEGYZÉS: Melanóma betegminták értelmezésekor barna színű melaninpigmentáció lehet jelen. A plazmamembrán festődésének értékelésekor ki kell zárni a melanint; a melanintartalom felismerésében és kizárásában segítséget nyújthat egy NCR reagenssel festett lemezsorozattal való összehasonlítás. Ha a melanin nagyon magas koncentrációja eleve kizárja a tumorsejtek plazmamembránfestésének értékelését, a mintát ki kell zárni az értelmezésből és határozatlannak kell minősíteni. 4. táblázat: A festés értelmezése: Melanóma Jelzés Az értékeléshez minimálisan szükséges életképes tumorsejtek Jóindulatú sejtek és immunsejtek Citoplazma festődés, stromális, nekrotikus sejtek és sejtszennyeződések Egyéb elemek Melanóma 100 Nem része az értékelésnek Nincs figyelembe véve az értékelésnél A melanint figyelmen kívül kell hagyni a plazmamembránfestődés értékelésekor. A melanintartalom felismerésében és kizárásában segítséget nyújthat egy NCR reagenssel festett lemezsorozattal való összehasonlítás. 14. Tárgylemez kiértékelése 5. táblázat. A lemezek kiértékelésének javasolt sorrendje. Minták Magyarázat Követelmények 1. H&E (A labor biztosítja) Első lépésként a hematoxilin és eozin (H&E) segítségével festett szövetminták kiértékelését kell elvégezni a szövettan és a prezervációs minőség felmérése érdekében. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx tesztet és a H&E festést a minta ugyanazon paraffinblokkjából származó sorozatmetszeteken kell elvégezni. A szövetmintáknak épnek, megfelelően prezervált állapotúnak kell lenniük, továbbá alkalmasnak kell lenniük a tumor jelenlétének megerősítésére. P03914HU_04/SK / p. 8/23

9 2. Kontroll lemez (A Dako biztosítja) 3. Pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja) 4. Negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja) 5. Negatív kontrollreagens használatával festett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletben található elsődleges PD-L1 antitesttel festett kontroll lemezeket meg kell vizsgálni annak ellenőrzése érdekében, hogy minden reagens megfelelően működik-e. A kontroll tárgylemez PD-L1- pozitív sejtvonalpelletet és PD-L1-negatív sejtvonalpelletet tartalmaz. Következő lépésként az elsődleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeket kell megvizsgálni. Ezek a tárgylemezek igazolják, hogy hatékony volt a fixálási módszer és az antigénfeltáró folyamat. Az ismert pozitív kontroll szöveteket kizárólag a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelő teljesítményének ellenőrzésére szabad használni, a páciensek mintáinak specifikus diagnosztizálásához NEM használhatók. A következő lépésben az elsődleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett, negatív kontrollszöveteket tartalmazó (más néven PD-L1 negatív) tárgylemezeket kell vizsgálni annak igazolására, hogy az elsődleges antitest specifikusan jelöli a célantigént. Emellett a pozitív kontroll szövet negatív részei negatív kontroll szövetként is szolgálhatnak, de ezt a felhasználónak igazolnia kell. Vizsgálja meg a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletből származó negatív kontroll reagenssel megfestett páciensmintákat. A negatív kontroll reagens az elsődleges antitest helyett kerül alkalmazásra, mely segít az antigén helyén történő specifikus festés értelmezésében. Minden egyes festési futtatás során meg kell festeni egy kontroll tárgylemezt az elsődleges PD-L1 antitesttel. NCI-H226 (a PD-L1-pozitív kontroll sejtvonal pozitív PD-L1 protein expressziójú emberi tüdő laphámkarcinómából származik) elfogadási kritériumai: Plazmamembrán-festődés a sejtek 80%-ában, 2+ átlagos festődési intenzitás. Nem specifikus festődés intenzitása <1+. MCF-7 (a PD-L1-negatív sejtvonal negatív PD-L1 protein expressziójú humán emlő adenokarciómából származik) elfogadási kritériumok: Nincs specifikus festődés. Nem specifikus festődés intenzitása <1+. Felhívjuk figyelmét, hogy esetenként megfigyelhető az MCF-7 sejtpellet néhány sejtjének festődése. A következő elfogadási kritériumok alkalmazandók: elfogadható, ha a jellegzetes plazmamembrán-festődést mutató sejtek összes száma 10, vagy ha az MCF-7 sejtpellet határain belül 1+ intenzitású citoplazmafestődés van jelen. Ha bármelyik kontroll sejtvonal nem felel meg a fenti kritériumoknak, akkor a páciens mintáinak összes eredményét érvénytelennek kell tekinteni. A kontrolloknak a beteg mintájával megegyező daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a beteg mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehető leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. A festődés értelmezéséhez használjon ép mintákat, mivel a nekrotikus vagy degenerált sejtek esetében gyakori a nem specifikus festődés. A pozitív kontrollként használt szöveteknek PD-L1 festés esetén gyenge vagy közepes festődést kell mutatniuk, ily módon ki tudják mutatni a teszt érzékenységének kismértékű változásait. Minden egyes festési futtatásba két pozitív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 antitesttel megfestett tárgylemez: Barna színű membránfestődés jelenlétét kell megfigyelni. A nem specifikus festődés legyen 1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemez: Nincs membránfestődés. A nem specifikus festődés legyen 1+. Ha a pozitív kontroll szövetek nem mutatnak megfelelő pozitív festődést, a tesztminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A kontrolloknak a beteg mintájával megegyező daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a beteg mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehető leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. Minden egyes festési futtatásba két negatív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 antitesttel megfestett tárgylemez: Nincs membránfestődés a tumorsejtekben. A nem specifikus festődés legyen 1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemez: Nincs membránfestődés. A nem specifikus festődés legyen 1+. Amennyiben a negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeken specifikus plazmamembrán-festődés figyelhető meg, a páciensminta eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A plazmamembrán-festődés hiánya igazolja, hogy az elsődleges PD-L1 antitest specifikusan jelöli a célantigént. A nem specifikus festődés legyen 1+. P03914HU_04/SK / p. 9/23

10 6. Elsődleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez Utolsó lépésként a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletben lévő elsődleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensmintákat tartalmazó teljes tárgylemezt vizsgálja meg. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx immunreaktivitásával kapcsolatos specifikus információkért tekintse meg az Összefoglaló és magyarázat, a Korlátozások és A nem klinikai teljesítmény értékelése című fejezeteket. A pozitív festődés intenzitását az ugyanahhoz a futtatáshoz tartozó negatív kontroll reagens tárgylemezen megfigyelt nem specifikus háttérfestődés figyelembe vételével kell értékelni. Mint minden immunhisztokémiai teszt esetén, itt is igaz, hogy a negatív eredmény csupán azt jelenti, hogy az antigén nem volt detektálható, és nem azt, hogy az antigén nem volt jelen a vizsgálatba bevont sejtekben/szövetekben. A festés értelmezésével kapcsolatos irányelveket lásd a 13. fejezetben. 15. Korlátozások 15.1 Általánosan érvényes korlátozások 1. Az immunhisztokémia többlépcsős diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelő reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, az immunhisztokémiai tárgylemez előkészítése és a festődési eredmények értelmezése területén. 2. A szövet festődése függ a festést megelőző kezeléstől és előkészítéstől. A nem megfelelően végzett fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés és metszés, illetve a más szövetekkel és folyadékokkal történő szennyezés műtermékeket, elégtelen antitestfeltárást vagy álnegatív eredményeket okozhat. Az ellentmondó eredmények oka a fixálási és beágyazási módszerek eltérései, illetve a szövetben eredendően jelen lévő szabálytalanságok lehetnek. 3. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények megfelelő értelmezését. 4. A pozitív festődés, illetve a pozitív festődés hiányának klinikai értelmezését a klinikai tünetek, a morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok figyelembe vételével kell végezni. A festődés, vagy a festődés hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatokkal és megfelelő kontrollokkal, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatokkal kell kiegészíteni. A festett tárgylemez értelmezése az alkalmazott antitesteket, reagenseket és módszereket jól ismerő képesített patológus feladata. A festést tanúsított és engedélyezett laboratóriumban kell végezni, a festett tárgylemezek felülvizsgálatáért és a pozitív és negatív kontrollok megfelelőségének biztosításáért felelős patológus felügyelete alatt. 5. A hepatitisz B vírussal fertőzött személyektől származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidáz alkalmazásakor nem specifikus festődést mutathatnak (17). 6. A daganatok és más patológiás szövetek antigén-expressziójának biológiai variabilitása miatt a váratlan reakciók lehetőségét nem lehet teljesen kizárni a tesztelt szövettípusok esetében. Értesítse a Dako technikai támogató csoportját, ha váratlan reakciókat észlel. 7. A proteinek vagy szubsztrát reakciótermékek nem immunológiai jellegű kötődése álpozitív eredményeket adhat. Ugyancsak álpozitív eredményt adhat a pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm c) (14). 8. A rendszerhez biztosított reagenseket és útmutatásokat optimális teljesítmény eléréséhez alakítottuk ki. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idő vagy a hőmérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat Termékspecifikus korlátozások 1. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idővel lebomlik a szövetekben. A tárgylemezre rögzített szövetmetszeteket sötét helyen, 2-8 C-os hőmérsékleten, vagy legfeljebb 25 C-os szobahőmérsékleten kell tárolni, és a metszetkészítést követő 4 hónapon belül meg kell festeni. A szövetek épségének és antigenitásának megőrzése érdekében a rögzítést követően tilos a tárgylemezeket 25 C-ot meghaladó hőmérsékleten tárolni vagy kezelni. 2. Az optimális és reprodukálható eredmények érdekében a PD-L1 protein antigénfeltáró előkezelést igényel a szövetek rutinszerű fixálása (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazása során. 3. A reagenseket nem szabad eltérő tételszámú készletekből vagy más gyártóktól származó készletekből pótolni. Az egyetlen kivétel az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), amely szükség szerint a K8005 kódszámot használva rendelhető. 4. A megfestett kontroll sejtvonalak csak a festési futtatás validálására használhatók, a szövetmetszetek festődési reakciójának pontozására viszont nem. 5. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx használatát a 10%-os neutrális pufferelt formalinon kívül más fixálószerrel fixált szöveteken nem validáltuk. 6. Az excíziós, incíziós, punch- vagy vastagtű-biopsziával nyert mintatípusok elfogadhatónak bizonyultak a PD-L1 IHC pharmdx készletet használó klinikai vizsgálatok számára. A vékonytű-biopsziával levett vagy egyéb citológai minták nem voltak megfelelőek a biomarker-elemzéshez, ezért kikerültek a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletet használó klinikai vizsgálatokból. 16. A nem klinikai teljesítmény értékelése 16.1 A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx analitikai specificitása A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx elsődleges antiteste egy nyúl monoklonális anti-humán PD-L1 antitest, a clone Az antitest előállításához használt immunogén a humán PD-L1 extracelluláris doménjét (Phe19-Thr239) tartalmazó, tisztított rekombináns humán PD-L1. Az elsődleges PD-L1 antitesttel történő IHC festés nem mutatott keresztreaktivitást a kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtek által exogén módon expresszált PD-L2-vel. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kifejezetten az FFPE szövetekben lévő tumorsejtekben expresszált PD-L1 membránfehérje detektálására szolgál, amely a PD-L1 antigén hozzáadásával teljesen megszüntethető. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx nem képes detektálni a PD-L1 membránfehérjét olyan PD-L1 knock-out tumorsejtekben, amelyben a PD-L1 gént genetikailag törölték Normál és daganatos szövetek A 6. táblázat a Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 antitest immunreaktivitását foglalja össze a normál szöveteket tartalmazó javasolt panelen. A 7. táblázat a Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 antitest immunreaktivitását foglalja össze daganatos szövetek esetén több különféle tumort tartalmazó microarray vizsgálatokban. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott volt, és a tájékoztatóban leírt módon festették meg PD-L1 IHC 28-8 pharmdx reagenssel. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx által detektált PD-L1 fehérje olyan típusú sejtek membránjában található, amelyek ismerten a PD-L1 antigén expressziójára képesek, mint pl. az immunsejtek és az epithelialis eredetű, főként tumorsejtek sejtjei. P03914HU_04/SK / p. 10/23

11 6. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx normál szöveteken mért reaktivitásának összegzése Szövettípus (vizsgált #) Pozitív plazmamembrán-festődés: Szövetelemek Pozitív citoplazma-festődés: Szövetelemek Agyalapi mirigy (3) 1/3 adenohipofízis elülső lebenye 1/3 adenohipofízis elülső lebenye 3/3 neurohipofízis hátulsó lebenye Bőr (3) 0/3 1/3 epithelium Csecsemőmirigy (3) 3/3 medulla epithelium 0/3 Csontvelő (3) 3/3 megakariociták 3/3 megakariociták Emlő (3) 0/3 0/3 Gyomor (3) 0/3 0/3 Hasnyálmirigy (3) 3/3 epithelium (főként szigetsejtek) 3/3 epithelium (főként szigetsejtek) Here (3) 0/3 1/3 Leydig-sejtek Kisagy (3) 0/3 0/3 Lép (3) 1/3 makrofágok 0/3 3/3 litorális sejt Máj (3) 2/3 immunsejtek 2/3 immunsejtek Mandula (3) 3/3 crypta epithelium 0/3 3/3 csíraközpont (immunsejtek) Méh (3) 0/3 0/3 Méhnyak (3) 1/3 epithelium 1/3 epithelium Mellékpajzsmirigy (3) 3/3 epithelium 0/3 Mellékvese (3) 3/3 velőállomány sejtek 3/3 velőállomány sejtek Mezoteliális sejtek (3) 0/3 0/3 Nagyagy (3) 0/3 0/3 Nyálmirigy (3) 0/3 0/3 Nyelőcső (3) 0/3 0/3 Pajzsmirigy (3) 0/3 0/3 Perifériás ideg (3) 0/3 0/3 Petefészek (3) 0/3 0/3 Prosztata (2) 0/2 0/2 Szívizom (3) 0/2 0/2 Tüdő (3) 3/3 alveoláris makrofágok 0/3 Vastagbél (3) 2/3 makrofágok 0/3 Vázizom (3) 0/2 0/2 Vékonybél (2) 0/2 0/2 Vese (3) 3/3 tubulus epithelium 3/3 tubulus epithelium 7. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx daganatos szöveteken mért reaktivitásának összegzése Tumor típusa Elhelyezkedés / Szerv PD-L1 pozitív/összes (N=162) Bronchioloalveolaris carcinoma, tüdő 0/1 Emlő, DCIS 0/2 Emlő, invazív duktális 3/7 Emlő, invazív duktális, nyirokcsomóáttét 1/1 Epehólyag 2/4 Fej és nyak, kemény szájpad 0/1 Féregnyúlvány 1/1 Gyomor 1/6 Gyomor, mucinózus 0/1 Gyomor-bélrendszeri, tüdőáttét 0/1 Hasnyálmirigy 1/2 Hasnyálmirigy, duktális 0/3 Méh, endometrium 1/3 Méh, világossejtes 1/1 Adenokarcinóma Méhnyak, endocervikális típus 0/1 Nyálmirigy/parotis 0/2 Nyelőcső 1/1 Pajzsmirigy, follikuláris 0/1 Pajzsmirigy, follikuláris-papilláris 0/1 Pajzsmirigy, papilláris 0/3 Petefészek 0/1 Petefészek, endometriális 0/1 Petefészek, mucinózus 0/1 Petefészek, szerózus 0/1 Prosztata 2/4 Rectum 2/4 Tüdő 2/5 Vastagbél 2/5 Vastagbél, májáttét 1/1 Vastagbél, mucinózus 0/1 Vékonybél 0/2 Adrenokortikális karcinóma Mellékvese 0/1 P03914HU_04/SK / p. 11/23

12 Tumor típusa Elhelyezkedés / Szerv PD-L1 pozitív/összes (N=162) Astrocytoma Nagyagy 0/3 Átmeneti sejtes karcinóma Húgyhólyag 3/6 Vese 0/1 Basalis sejtes karcinóma Bőr 0/1 Embrionális karcinóma Here 0/1 Ependymoma Agy 0/1 Glioblasztóma Agy 0/1 Hepatoblasztóma Máj 0/1 Hepatocelluláris karcinóma Máj 1/5 Rectum 0/1 Interstitialoma Vastagbél 0/1 Vékonybél 0/1 Karcinóma Nasopharyngealis, NPC 0/1 Kissejtes karcinóma Tüdő 1/2 Kordóma Medenceüreg 0/1 Bőr 1/2 Fej és nyak 0/2 Méh 1/1 Méhnyak 2/4 Laphámsejtes karcinóma Metasztatikus nyelőcső laphámsejtes karcinóma áttéte 1/1 nyirokcsomóban Nyelőcső 4/7 Tüdő 1/3 Limfóma Anaplasztikus nagysejtes Nyirokcsomó 1/1 Diffúz B-sejtes Nyirokcsomó 2/4 Hodgkin Nyirokcsomó 2/2 Non-Hodgkin Nyirokcsomó 1/1 Liposzarkóma Hasüreg, mucinosus 0/1 Medulláris karcinóma Pajzsmirigy 0/1 Medulloblastoma Agy 0/1 Melanóma Orrüreg 0/1 Rectum 0/1 Meningióma Agy 0/2 Mezotelióma Peritoneum 0/1 Nagysejtes karcinóma Tüdő 1/1 Neuroblasztóma Retroperitoneum 0/1 Neurofibróma Lágyszövet, derék 0/1 Pecsétsejtes karcinóma Metasztatikus pecsétsejtes karcinóma áttéte petefészekben 0/1 Vastagbél 0/1 Primitív neuroektodermális Retroperitoneum 0/1 Spermatocitóma Here 0/2 Szarkóma Kondroszarkóma Csont 0/1 Leiomyosarcoma Húgyhólyag 0/1 Lágyszövet, mellkasfal 0/1 Liposzarkóma Hasüreg, mucinosus 0/1 Oszteoszarkóma Csont 0/2 Lágyszövet, embrionális 0/1 Rhabdomyosarcoma Prosztata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Synoviális szarkóma Medenceüreg 0/1 Világossejtes Hasfal 0/1 Szeminóma Here 0/2 Szigetsejttumor Hasnyálmirigy 0/1 Thymoma Mediastinum 1/1 Vesesejt karcinóma Papilláris Vese 0/1 Világossejtes Vese 0/6 17. Teljesítmény értékelése 17.1 Teljesítmény értékelése: Nem laphámsejtes NSCLC Analitikai érzékenység: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx analitikus érzékenységét 112 egyedi pácienstől származó nem laphámsejtes, I IV. stádiumú NSCLC FFPE mintán vizsgáltuk egy gyártói készlet segítségével. A PD-L1 expresszió értékelése festődést mutatott a 0-100% pozitív daganatsejt és 0-3 festődési intenzitás tartományban. P03914HU_04/SK / p. 12/23

13 Megismételhetőség/külső megismételhetőség: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx megismételhetőségét és külső megismételhetőségét a Dako és három külső tesztelőhely vizsgálta. A teljesítményadatokat a 8. és 9. táblázat tartalmazza. Minden egyes meghatározott PD-L1 expressziós szint esetén elvégzésre került a tesztek negatív százalékos egyezési (NPA), pozitív százalékos egyezési (PPA) és teljes százalékos egyezési (OA) értékének független páros összehasonlítása. A leggyakrabban megfigyelt értéket alkalmaztuk az NPA, a PPA és az OA, valamint az ezekhez tartozó 95%-os Wilson-féle konfidencia-intervallumok kiszámításához, így az ezen megfigyelésből származó egyik érték eltávolításra került a páros összehasonlítási műveletből. 8. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx megismételhetősége nem laphámsejtes NSCLC % egyezés (95%-os KI) Megismételhetőség Módszer 1% expressziós szint 5% expressziós szint 10% expressziós szint Berendezések között Megfigyelők között Napok között Tételek között Futtatásokon belül A 10, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban teszteltük három Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 60 független páros összehasonlítást végeztünk. A 12, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban három analitikus segítségével ellenőriztük egy Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 72 független páros összehasonlítást végeztünk. A 10, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban öt nem egymást követő napon ellenőriztük az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 80 független páros összehasonlítást végeztünk. A 20, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező nem laphámsejtes NSCLC mintát két példányban öt reagenstétellel vizsgáltuk az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 160 független páros összehasonlítást végeztünk. A 10, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező nem laphámsejtes NSCLC mintát egy futtatáson belül nyolc példányon vizsgáltuk az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 70 független páros összehasonlítást végeztünk. NPA 100 (82,4, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) P03914HU_04/SK / p. 13/23

14 9. táblázat: A három külső vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 28-8 pharmdx nem laphámsejtes NSCLC megismételhetősége Megismételhetőség 1% expressziós szint 5% expressziós szint % egyezés (95%-os konfidencia-intervallum) Módszer Vizsgálóhelyek közötti elemzés A 10, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező nem laphámsejtes NSCLC mintát öt nem egymást NPA 100 (93,6, 100) NPA 91,4 (82,5, 96,0) (három követő napon teszteltük. A vizsgálóhelyek közötti elemzést PPA 98,8 (93,6, 99,8) PPA 97,1 (90,2, 99,2) vizsgálóhely) három vizsgálóhelyen, összesen 140 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. OA 99,3 (96,1, 99,9) OA 94,3 (89,1, 97,1) Vizsgálóhelyen belüli vizsgálat Megfigyelők között (egy megfigyelő mindhárom vizsgálóhelyen) Egy megfigyelőn belül (egy megfigyelő mindhárom vizsgálóhelyen) A 10, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező nem laphámsejtes NSCLC mintát öt nem egymást követő napon teszteltük a három vizsgálóhelyen. A vizsgálóhelyen belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 120 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. A 15, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező, PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével megfestett nem laphámsejtes NSCLC minta pontozását három patológus végezte el három nem egymást követő napon, három vizsgálóhelyen. A megfigyelők közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 120 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. A 15, különböző PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkező, PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével megfestett nem laphámsejtes NSCLC minta pontozását három patológus végezte el három nem egymást követő napon, három vizsgálóhelyen. A egy megfigyelőn belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 90 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) Klinikai teljesítmény értékelése: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai használatóságának értékelése a CA számú, háromfázisú, randomizált, nyílt jelölésű, nivolumab és docetaxel készítményeket összehasonlító, felnőtt ( 18 év), előrehaladott vagy áttétes nem laphámsejtes NSCLC-ben szenvedő pácienseken végzett vizsgálattal történt, akiket előzőleg eredménytelenül kezeltek platinabázisú doublet kemoterápiával. A vizsgálatban összesen 582, 112 vizsgálati helyről, 22 országból származó tesztalany került be randomizált módon (Argentína, Ausztrália, Ausztria, Brazília, Kanada, Chile, Csehország, Franciaország, Németország, Hongkong, Magyarország, Olaszország, Mexikó, Norvégia, Peru, Lengyelország, Románia, Oroszország, Szingapúr, Spanyolország, Svájc és az Egyesült Államok). A tesztalanyok 1:1 arányban kerültek randomizálásra, a rétegezés pedig a következő elvek szerint történt: 1) előzetesen alkalmaztak kontra nem alkalmaztak fenntartó terápiát és 2) másodvonalbeli kontra harmadvonalbeli terápia. A vizsgálat előtti (alapértékeket képviselő) tumorszövetmintákat még a randomizálás és az első kezelés előtt begyűjtöttük a hatékonyság előre megtervezett, előre meghatározott alapszintű PD-L1 expressziós szintek szerinti elemzése érdekében (másodlagos cél). Az elsődleges cél a teljes túlélés (OS) meghatározása volt. Az egyéb másodlagos célok közé tartozott az objektív válaszarány (ORR), progressziómentes túlélés (PFS), valamint a betegséggel összefüggő tünetek 12 hét alatt bekövetkező javulása a tüdőrák tüneti skála (LCSS) alapján mérve. Az alapszintű demográfiai és betegségjellemzők összességében kiegyenlítetten fordultak elő a nivolumab és docetaxel csoportok randomizált tesztalanyai között. Az életkor medián értéke 62 év volt (tartomány:21 85), ahol az alanyok 34%-a volt 65 éves vagy idősebb, és 7%-a volt 75 éves vagy idősebb. A páciensek túlnyomó része fehér (92%) férfi (55%) volt; az alapszintű ECOG teljesítménystátusz 0 (31%) vagy 1 (69%) volt. A páciensek hetvenkilenc százaléka volt leszokott/aktív dohányos. A tumorminták nem laphámsejtes, a vizsgálat bevonási kritériumainak megfelelő NSCLC tumorokból kerültek begyűjtésre. A 10. táblázat a CA számú vizsgálatban részt vevő randomizált tesztalanyok előre meghatározott alapértékű expressziós szinteken mutatott PD-L1 expressziójának gyakoriságát mutatja. 10. táblázat: Vizsgálat előtti PD-L1 expresszió gyakorisága a CA vizsgálatban részt vevő összes, nem laphámsejtes NSCLCben szenvedő randomizált tesztalany esetén Populáció PD-L1 expressziós kategória Nivolumab 3 mg/kg Docetaxel Összesen Összes Alapértéken mérhető PD-L1, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) Kiinduló PD-L1 expresszió 1% 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) Kiinduló PD-L1 expresszió < 1% 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) Kiinduló PD-L1 expresszió 5% 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) Kiinduló PD-L1 expresszió < 5% 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Kiinduló PD-L1 expresszió 10% 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) Kiinduló PD-L1 expresszió < 10% 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) PD-L1 nem mérhető, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) Az OPDIVO csoport előre meghatározott expressziós szintjein PD-L1 expressziót mutató páciensek jobb túlélési aránnyal rendelkeznek a docetaxel csoportba tartozó páciensekhez képest, míg a docetaxel csoportba tartozó páciensek túlélési aránya azon páciensek túlélési arányával egyezett meg, akik nem mutattak PD-L1 expressziót. A PD-L1 expressziós szint alapján végzett elemzés során a teljes túlélés (OS) medián értékét tekintve a nivolumab csoport jelentős eltérést mutatott a docetaxel csoporthoz képest. A nivolumab tesztalanyok teljes túlélés mediánja 17,1, 18,2 és 19,4 hónap volt a docetaxel csoportban részt vevő tesztalanyok 9,0, 8,1 és 8,0 hónapjához képest a sorrendben 1%, 5% és 10%-os PD-L1 expressziós szintek esetén. A<1%,<5% és <10%-os expressziós szintek esetén a kezelési csoportokban lévő tesztalanyok teljes túlélési értékei közt nem volt eltérés tapasztalható, a nivolumab esetén a teljes OS 9,7 és 10,4 hónap között, míg a docetaxel csoport esetén 10,1 és 10,3 hónap között változott. Az 1. ábrán nem rétegezett kockázati arány (HR) és a teljes túlélés (OS) medián értéke látható. A 2. és 3. ábrán az alcsoportok PD-L1 expressziós szintje alapján elkészített Kaplan-Meier túlélési görbe látható. P03914HU_04/SK / p. 14/23

15 1. ábra: Forest-görbe PD-L1 expressziós szinten alapuló teljes túlélés (OS) a CA vizsgálatban részt vevő, nem laphámsejtes NSCLC-ben szenvedő páciensek esetén Teljes túlélés OS (hónap) PD-L1 expressziós szint Nem rétegezett HR OPDIVO Docetaxel 1% (n = 246) 0,59 17,1 9,0 <1% (n 209) 0,90 10,4 10,1 5% (n = 181) 0,43 18,2 8,1 <5% (n = 274) 1,01 9,7 10,1 10% (n = 165) <10% (n = 290) 0,40 19,4 8,0 1,00 9,9 10,3 0,25 0,5 1,0 2,0 Az OPDIVO-ra pozitívabban Megjegyzés: A nem rétegezett kockázati arány értékének, valamint a hozzá tartozó 95%-os konfidencia-intervallum becslését a Cox-féle arányos kockázati modell segítségével végeztük el, ahol a randomizált csoportot egyetlen kovariánsnak tekintettük 2. ábra: Teljes túlélés - a CA vizsgálatban részt vevő, 1% PD-L1 expressziós szintű, nem laphámsejtes NSCLC betegek Túlélési esély 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Docetaxel 0, Teljes túlélés (hónap) Kockázatok száma OPDIVO Docetaxel P03914HU_04/SK / p. 15/23