PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. SK vizsgálat az Autostainer Link 48 berendezéshez. Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai használatra.

Átírás

1 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK vizsgálat az Autostainer Link 48 berendezéshez Javasolt alkalmazás In vitro diagnosztikai használatra. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx egy kvalitatív, Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 antitestet alkalmazó immunhisztokémiai vizsgálat, mely a formalinnal fixált, paraffinba ágyazott (FFPE), nem laphámsejtes, nem-kissejtes tüdırákszövetekben (NSCLC) és melanómaszövetekben elıforduló PD-L1 protein detektálására használható az Autostainer Link 48 berendezésen található EnVision FLEX megjelenítırendszer segítségével. A PD-L1 fehérje expresszióját a bármely intenzitáson pozitív membránfestıdést adó tumorsejtek százalékos aránya határozza meg. A nem laphámsejtes NSCLC szövetekben a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével detektált PD-L1 expresszió összefüggésben lehet az OPDIVO (nivolumab) által eredményezett jobb túlélési aránnyal. A melanómaszövetekben a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével detektált PD-L1 expresszió segítheti azoknak a betegeknek a felmérését, akiknek az esetében felmerül a kombinált OPDIVO - (nivolumab) és YERVOY -kezelés (ipilimumab). Összegzés és magyarázat A PD-1 ligandumok (PD-L1 és PD-L2) a T-sejtek PD-1 receptorhoz kötıdve gátolják a T-sejtek proliferációját és citokintermelését. Egyes tumorokban upregulálódnak a PD-1 ligandumok, és az ezen az útvonalon történı jelátvitel hozzájárulhat a tumorok T-sejtek által végzett aktív immunfelügyeletének (surveillance) gátlásához (1). Az OPDIVO (nivolumab) egy humán immunglobulin G4 (IgG4) monoklonális antitest, amely a PD-1 receptorhoz kötıdik, és blokkolja annak PD-L1 és PD-L2 fehérjével való interakcióját, melynek eredményeképpen az immunválasz PD-1 jelátviteli útvonal által mediált gátlása jön létre, ideértve a tumorral szemben adott immunválasz gátlását is (2). Szingén egértumor modellekben a PD-1 aktivitás gátlása csökkent tumornövekedést eredményezett (3). Az OPDIVO klinikai elınyeit és a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai hasznosságát vizsgáltuk NSCLC- és melanómaszövetekben. Nem laphámsejtes NSCLC: A PD-L1 fehérjéket expresszáló tumorsejtek nem laphámsejtes, nem-kissejtes tüdırák-páciensmintákban történı detektálása arra utalhat, hogy az OPDIVO (nivolumab) segítségével biztosított kezelés javíthatja a túlélési arányt. Az OPDIVO Bristol-Myers Squibb által szponzorált klinikai vizsgálatában részt vevı páciensek mintáit a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével vizsgáltuk. A CA klinikai vizsgálat az OPDIVO készítménnyel kezelt, nem laphámsejtes NSCLC páciensek PDL1 státuszának felmérésére szolgáló PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai validitását vizsgálták (5,11). Melanóma: A citotoxikus T-limfocita antigén-4 (CTLA-4) a T-sejt aktivitásának negatív regulátora. A YERVOY (ipilimumab) monoklonális antitest, amely a CTLA-4-hez kapcsolódik és meggátolja a CTLA-4 kölcsönhatását a ligandumaival (CD80/CD86). Kimutatták, hogy a CTLA-4 blokádja megnöveli a T-sejt aktiválását és osztódását, ami hozzájárul a tumorellenes immunreakció általános megerısödéséhez (4). A PD-1 és a CTLA-4 kiegészítı és nem redundáns mechanizmusokon keresztül gátolja a tumorellenes immunitást. Az OPDIVO monoterápia és az OPDIVO + YERVOY kombinált terápia jelentısen nagyobb javulást eredményezett a progressziómentes túlélésben YERVOY monoterápia alkalmazásához képest olyan betegek esetében, akik elırehaladott melanómában szenvednek és korábban még nem részesültek kezelésben (8-10). A Bristol-Myers Squibb által szponzorált klinikai vizsgálatban részt vevı, OPDIVO készítménnyel kezelt páciensek melanóma tumorszövetmintáit a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével vizsgáltuk. A CA számú klinikai vizsgálat az OPDIVO, OPDIVO + YERVOY kombináció és a csak YERVOY készítménnyel kezelt, melanómában szenvedı betegek PD-L1 expressziójának felmérésére szolgáló PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai validitását vizsgálta. Az OPDIVO és a YERVOY a Bristol-Myers Squibb védjegyei. Az eljárás elve A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx az FFPE minták Autostainer Link 48 berendezésben és PT Link elıkezelı modullal végzett IHC festési eljárásához optimalizált reagenseket és protokollt tartalmazza (6). Az elsıdleges monoklonális PD-L1 antitesttel vagy a negatív kontroll reagenssel (NCR) végzett inkubálást követıen a mintákat az elsıdleges antitestet termelı fajra specifikus linker antitesttel, majd végül dextrán polimer vázhoz kötött másodlagos antitest molekulákból és torma-peroxidáz molekulákból álló, használatra kész megjelenítı reagenssel kell inkubálni. A következı lépésben hozzáadott kromogén enzimatikus konverziója látható reakciótermék kicsapódását eredményezi az antigén helyén. A kromogén erısítı reagens módosítja a kromogén reakció színét. Ezt követıen elvégezhetı a minta kontrasztfestése, majd a fedılemez felhelyezése. Az eredményeket fénymikroszkóp segítségével kell értelmezni. A festések validálása érdekében két formalinnal fixált, paraffinba ágyazott humán sejtvonalakat tartalmazó kontroll tárgylemezt is biztosítunk. Mellékelt anyagok PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (kód: SK005) Az alább felsorolt anyagok 50 teszt elvégzésére elegendık (50 metszetet a PD-L1 elleni elsıdleges antitesttel kell inkubálni, 50 metszetet pedig a negatív kontroll reagenssel, ez összesen 100 metszet). A készletben további PD-L1 elleni elsıdleges antitestek találhatók 15 darab, sejtvonalakat tartalmazó kontroll lemez megfestéséhez. A tesztek száma azon alapul, hogy minden reagensbıl 2 x 150 µl-t kell használni metszetenként, kivéve a DAB+ és a Target Retrieval Solution (antigénfeltáró oldat) reagenst. ( ) P03914HU_02/SK / /17

2 A készlet legfeljebb 15 különálló futtatáshoz elegendı anyagot tartalmaz. Mennyiség Leírás 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Hidrogén-peroxidot, felületaktív anyagot (detergens) és 0,015 mol/l nátrium azidot tartalmazó pufferelt oldat. 1 x 19,5 ml Elsıdleges antitest: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Monoklonális nyúl anti-pd-l1 antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 15 ml Negative Control Reagent* NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonális nyúl kontroll IgG antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. *A monoklonális nyúl kontroll IgG értékesítése a Cell Signaling Technology licence alapján történik. 1 x 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT Nyúl immunglobulinok elleni egér szekunder antitest stabilizáló proteint és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferelt oldatban. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextránhoz kötött peroxidáz molekulák és nyúl és egér immunglobulinok elleni kecske másodlagos antitest molekulák, stabilizáló proteint és antimikróbás szert tartalmazó pufferelt oldatban. 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufferelt oldat hidrogén-peroxiddal és antimikróbás szerrel. 1 x 5 ml DAB+ Chromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin-tetrahidro-klorid szerves oldószerben. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Réz-szulfát vízben. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Pufferelt oldat, ph 6,1, felületaktív anyaggal és antimikróbás szerrel. 15 lemez PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Control Slides (kontroll lemezek) CONTROL SLIDES Minden egyes lemez két pelletált, formalinban fixált, paraffinba ágyazott sejtvonal metszeteit tartalmazza: Az NCI-H226** pozitív PD-L1 protein expressziót mutat, míg az MCF-7 sejtvonal nem expresszálja a PD-L1 proteint. PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1 negatív NCI-H226: PD-L1 pozitív ** Ezúton szeretnénk elismerni Dr. AF Gazdar és Dr. JD Minna (NIH) hozzájárulását az NCI-H226 (ATCC Number: CRL-5826 ) sejtvonal kifejlesztéséhez (7) ( ) P03914HU_02/SK / /17

3 Megjegyzés: A reagensek kifejezetten a készlettel való használatra készültek. A teszt leírt teljesítményének megırzése érdekében tilos bármiféle helyettesítést végezni, kivéve az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (kód: K8005) reagenst. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx az Autostainer Link 48 berendezéssel történı használatra készült. További információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 és a PT Link használati útmutatóit. Szükséges, de nem biztosított anyagok PT Link Pre-treatment Module (kód: PT100/PT101) (elıkezelı modul) Autostainer Link 48 készülék (kód: AS480) EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kód: K8007) (mosópuffer) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód: K8008) Desztillált vagy ionmentes víz (reagens minıségő víz) Stopperóra Pozitív és negatív szövetek a folyamatok ellenırzéséhez (lásd a Minıség-ellenırzés címő részt és az 1. táblázatot) Mikroszkópos tárgylemezek: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kód: K8020) tárgylemezek vagy Fisherbrand Superfrost Plus pozitív töltéső tárgylemezek Fedılemezek Tartós rögzítı közeg és segédreagensek a fedılemezek rögzítéséhez Fénymikroszkóp (4 40x optikai nagyítás) Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai használatra. 2. Foglalkozásszerő felhasználóknak. 3. A termék nátrium-azidot (NaN3) tartalmaz, amely tiszta formában nagyon mérgezı vegyület. A termékben alkalmazott koncentrációkban, bár nem sorolható be veszélyes anyagként, a NaN3 reakcióba léphet az ólomból vagy rézbıl készült vízvezetékekkel, és erısen robbanékony fém-azidok felhalmozódásához vezethet. Kiöntéskor, a fém-azidok felhalmozódását megelızendı, nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni (12). 4. Az elsıdleges antitest, a negatív kontroll reagens, a linker és a megjelenítı reagens állati eredető anyagot tartalmaz. 5. A fixálás elıtt és után lévı mintákat, és a velük érintkezı anyagokat potenciális fertızéshordozóként kell kezelni, és a megfelelı óvintézkedéseket alkalmazva kell ártalmatlanítani (13). 6. A megadottól eltérı inkubálási idık, hımérsékletek vagy módszerek hibás eredményeket adhatnak. 7. A reagensek optimális koncentrációra vannak hígítva. További hígítás az antigénfestıdés elvesztését eredményezheti. 8. A megjelenítı reagens, a folyékony DAB+ kromogén és az elkészített DAB+ szubsztrát-kromogén károsodhat, ha túlzottan erıs fény éri. Ne tárolja a rendszer komponenseit és ne végezze a festést erıs fényben, például közvetlen napfényben. 9. A paraffinmaradvány álnegatív eredményeket okozhat. 10. A javasolttól eltérı reagenstérfogatok használata a látható PD-L1 immunreaktivitás elvesztését okozhatja. 11. A lemez 2/3-ára vagy nagyobb területre kiterjedı, nagymérető szövetmetszetek esetében elfordulhat, hogy 3x150 µl reagensre lesz szükség. 12. Általános szabály, hogy 18 év alatti személyek nem dolgozhatnak ezzel a termékkel. A felhasználót alaposan ki kell képezni a helyes munkavégzési eljárást, a termék veszélyes tulajdonságait és a szükséges biztonsági intézkedéseket illetıen. További információért tájékozódjon a biztonsági adatlapról (Safety Data Sheet, SDS). 13. A szemmel és bırrel való érintkezés elkerülésére viseljen megfelelı személyi védıfelszerelést. 14. A fel nem használt oldatot a helyi, területi, nemzeti és nemzetközi hatósági elıírásoknak megfelelıen kell megsemmisíteni. 15. Foglalkozásszerő felhasználók részére igény esetén anyagbiztonsági adatlapot biztosítunk. Veszély DAB+ kromogén: 1 5% bifenil-3,3,4,4 -tetrailtetraammónium-tetraklorid H350 Rákot okozhat. H341 Feltehetıen genetikai károsodást okoz. P201 Használat elıtt ismerje meg az anyagra vonatkozó különleges utasításokat. P202 Ne használja addig, amíg az összes biztonsági óvintézkedést el nem olvasta és meg nem értette. P280 Védıkesztyő használata kötelezı. Szemvédı vagy arcvédı használata kötelezı. Védıruha használata kötelezı. P308 + P313 Expozíció vagy annak gyanúja esetén: Orvosi ellátást kell kérni. P405 Elzárva tárolandó. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. Figyelmeztetés EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5% citromsav H319 Súlyos szemirritációt okoz. H411 Mérgezı a vízi élıvilágra, hosszan tartó károsodást okoz. P280 Szemvédı vagy arcvédı használata kötelezı. P273 Kerülni kell az anyag környezetbe jutását. P264 A használatot követıen a kezet alaposan meg kell mosni. P305 + P351 + P338 SZEMBE KERÜLÉS ESETÉN: Több percig tartó óvatos öblítés vízzel. Adott esetben a kontaktlencsék eltávolítása, ha könnyen megoldható. Az öblítés folytatása. P337 + P313 Ha a szemirritáció nem múlik el: Orvosi ellátást kell kérni. P501 A tartalom és az edényzet hulladékként történı elhelyezését a helyi, regionális, országos és nemzetközi szabályozásokkal összhangban kell elvégezni. ( ) P03914HU_02/SK / /17

4 Tárolás A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx összetevıit, beleértve a kontroll lemezeket, az eredeti tartályában, sötét helyen, 2 8 C hımérsékleten kell tárolni, amikor nincsenek használatban az Autostainer Link 48 berendezésben. Ne használja a készletet a dobozon feltüntetett lejárati idın túl. Ha a reagenseket a jelen tájékoztatóban leírtaktól eltérı feltételek között tárolják, akkor a felhasználó köteles a feltételeket validálni. Nincsen nyilvánvaló jel, amely a termék instabilitására utalna, ezért a páciens mintáival egyidejőleg egy pozitív és egy negatív kontroll vizsgálatát is el kell végezni. Minták elıkészítése A mintákat úgy kell kezelni, hogy a szövet alkalmas maradjon IHC festésre. A mintákat a szabványos szövetfeldolgozási módszerekkel kell feldolgozni. Paraffinba ágyazott metszetek Formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetek használhatók. A javasolt kezelési és feldolgozási körülmények a következık: <30 perc ischaemiás idı a fixálószerben történı elmerítést megelızıen, és órás fixálási idı 10%-os neutrális pufferelt formalinban. Egyéb fixálószereket nem validáltunk, így azok hibás eredményeket adhatnak. A mintákból készített 3 vagy 4 mm vastagságú blokkot 10%-os neutrális pufferelt formalinnal kell fixálni, alkoholsorral vízteleníteni és xilollal mosni, majd végül olvasztott paraffinnal átitatni. A paraffin hımérséklete nem haladhatja meg a 60 C-ot. A szövetmintákat 4-5 µm-es metszetekre kell vágni. A metszetkészítést követıen a szöveteket pozitív töltéső Fisherbrand Superfrost Plus tárgylemezekre vagy Dako FLEX IHC mikroszkópos tárgylemezekre (kód: K8020) kell rögzíteni, majd 1 órán át 58 ± 2 C-os sütıben inkubálni. Az antigenitás megırzése érdekében a tárgylemezre rögzített szövetmetszeteket sötét helyen, 2 8 C-os hımérsékleten, vagy legfeljebb 25 C-os szobahımérsékleten kell tárolni, és a metszetkészítést követı 4 hónapon belül meg kell festeni. A szövetek épségének és antigenitásának megırzése érdekében a rögzítést követıen tilos a tárgylemezeket 25 C-ot meghaladó hımérsékleten tárolni vagy kezelni. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készlet kalciummentesített szöveteken történı használatát nem validáltuk, ezért az nem ajánlott. A reagens elıkészítése A festés elıtt a következı reagenseket kell elkészíteni: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Készítsen megfelelı mennyiségő 1x Target Retrieval Solution, Low ph reagenst a Target Retrieval Solution, Low ph (50x) reagens 1:50 arányú hígításával. Használjon reagens minıségő vizet. Az 1x Target Retrieval Solution elıírt ph értéke: 6,1 ± 0,2. A Target Retrieval Solution, Low ph (50x) reagens egy darab 30 ml-es palackjának tartalmát 1:50 hígítva 1,5 l 1x reagens áll rendelkezésre, amelyet a PT Link tartályba töltve egy alkalommal legfeljebb 24 tárgylemez kezeléséhez elegendı. Három használat, illetve a hígítást követı 5 nap után öntse ki az 1x Target Retrieval Solution oldatot. Szükség szerint további EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) rendelhetı a K8005 kódszámot használva. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Készítsen elı megfelelı mennyiségő Wash Buffer reagenst a Wash Buffer (20x) reagens 1:20 arányú hígításával. Használjon reagens minıségő vizet. A fel nem használt oldatot 2 8 ºC-on legfeljebb egy hónapig lehet tárolni. Ha zavaros a puffer, semmisítse meg. További információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 használati útmutatóját. Az EnVision FLEX Wash Buffer (20x) reagens a K8007 kódszámon rendelhetı. DAB+ szubsztrát-kromogén oldat A használat elıtt az oldatot alaposan fel kell keverni. Az oldatban létrejövı csapadék nem befolyásolja a festés minıségét. A DAB+ szubsztrát-kromogén oldat elkészítéséhez adjon 1 csepp folyékony DAB+ kromogén reagenst egy ml DAB+ szubsztrát puffer reagenshez, majd keverje össze. Az elkészített szubsztrát-kromogén reagens sötétben, 2-8 C hımérsékleten történı tárolás esetén 5 napig marad stabil. Fontos megjegyzések: Ha a DAB+ szubsztrát puffer üveg teljes tartalmát használja, adjon hozzá 9 csepp DAB+ kromogént. A címke szerint az üveg tartalma 7,2 ml, ez azonban a használható tartalomra értendı, és nem foglalja magában az üveg holttérfogatát. A palackban lévı folyékony DAB+ kromogén színe átlátszótól levendula vagy lilásbarna színig változhat. Ez nem befolyásolja a termék teljesítményét. A hígítást a fenti utasításoknak megfelelıen végezze el. Amennyiben túl nagy mennyiségő folyékony DAB+ kromogén reagenst ad hozzá a DAB+ szubsztrát puffer reagenshez, azzal csökkenti a pozitív jelet. Az Autostainer Link 48 készüléken végzett festési eljárás Az eljárással kapcsolatos megjegyzések A felhasználó használat elıtt gondosan olvassa el az utasításokat, és ismerkedjen meg minden komponenssel és készülékkel (lásd: Óvintézkedések). Az immunfestés elıtt a reagenseket hagyja szobahımérsékletre (20 25 C) melegedni. A további inkubál ásokat is szobahımérsékleten kell végezni. Ne hagyja, hogy a festés során a szövetmetszetek kiszáradjanak. A kiszáradt metszeteken nagyobb mértékő lehet a nem specifikus festıdés. ( ) P03914HU_02/SK / /17

5 A szükséges lépések és inkubációs idık elıre be van programozva a Dako Link szoftverben. A programozási protokollokkal és a tárgylemezek és a reagensek behelyezésével kapcsolatos további információkért tekintse meg az Autostainer Link 48 és a PT Link használati útmutatóját. Megjegyzés: A jelen rendszerhez mellékelt reagensek és instrukciók a javasolt reagensekkel és anyagokkal történı használat esetén optimális teljesítményt biztosítanak. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idı vagy a hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Festési protokoll A DakoLink legördülı menüben válassza ki a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx festési protokollt. A festéshez szükséges lépések és az inkubálási idık elıre be vannak programozva a DakoLink szoftverbe. Amennyiben a megfelelı PD-L1 IHC 28-8 pharmdx protokollok nem találhatók meg az Ön szerverén, kérjük, vegye fel a kapcsolatot a helyi mőszaki szervizképviselettel. 1. lépés: Deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárás Javasolt eljárás: A részletekkel kapcsolatban lásd a PT Link felhasználói útmutatóját. Állítsa a PT Link (kód: PT100/PT101) Preheat (Elımelegítés) és Cool (Hőtés) értékét 65 C-ra. Állítsa be a Heat (Melegítés ) értékét 97 C-ra, az idıt pedig 20 percre. Töltse fel a PT Link tartályait egyenként 1,5 l Target Retrieval Solution, Low ph, 1x munkaoldattal úgy, hogy elfedje a szövetmetszeteket. Melegítse elı a Target Retrieval Solution reagenst 65 C-ra. Merítse be a rögzített FFPE szövetmetszeteket tartalmazó Autostainer állványokat az elımelegített Target Retrieval Solution, Low ph, 1x munkaoldatba a PT Link tartályban. Inkubálja 20 percig 97 C hımérsékleten. Amint befejezıdött az antigénfeltáró inkubálás és a hımérséklet visszahőlt 65 C-ra, távolítsa el a tárgylemezeket tartalma zó Autostainer tárgylemezállványokat a PT Link tartályából, és azonnal helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer tárgylemezállványt a hígított, szobahımérséklető Wash Buffer (kód: K8007) reagenst tartalmazó tartályba (pl. PT Link Rinse Station, kód: PT109). Hagyja a tárgylemezeket hígított, szobahımérséklető Wash Buffer reagensben 5 percig. 2. lépés: Festési eljárás A deparaffinizálás, rehidratálás és antigénfeltárás (3 az 1-ben) eljárást követıen helyezze a tárgylemezeket tartalmazó Autostainer állványokat az Autostainer Link 48 készülékbe. Ügyeljen arra, hogy a tárgylemezeken elegendı puffer maradjon a betöltés alatt és a futtatás indítása elıtt. A készülék a megfelelı reagens hozzáadásával elvégzi a festési eljárást, követi az inkubációs idıt, és leöblíti a tárgylemezeket a reagensek között. A reagens alkalmazási idıtartamai elıre be vannak programozva a Dako Link szoftverében. 3. lépés: Kontrasztfestés A tárgylemezek kontrasztfestését EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód: K8008) reagenssel kell végezni 7 percig. A hematoxilin inkubációs ideje elıre be van programozva a protokollba. 4. lépés: Rögzítés Nem víz alapú, tartós rögzítıközeget kell használni. Megjegyzés: Idıvel némi fakulás elıfordulhat a megfestett tárgylemezeken. Ez többféle tényezıtıl függ, például a kontrasztfestéstıl, az alkalmazott rögzítıközegektıl és módszerektıl, valamint a tárgylemezek tárolásának körülményeitıl. A fakulás minimálisra csökkentése érdekében a lemezeket sötét helyen, szobahımérsékleten (20 25 C között) kell tárolni. Minıség-ellenırzés A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készlet reagenseinek minıség-ellenırzését a fent leírt antigénfeltárási és festési eljárásokat alkalmazó immunhisztokémiai eljárás segítségével végeztük. Amennyiben a felhasználó laboratóriuma eltér az ajánlott fixálási, feldolgozási és beágyazási eljárásoktól, az jelentıs bizonytalanságot okozhat az eredményekben. Minden egyes festési futtatás esetén mellékelni kell minıségbiztosítási kontrollokat. Ezen minıségbiztosítási kontrollokat az 1. táblázat tartalmazza, többek között a következıket: egy H&E festett páciens-szövetminta; labor által biztosított negatív és pozitív kontroll szövetek; és egy Dako által biztosított kontroll tárgylemez (15). Az Egyesült Államokban további információkért lásd a College of American Pathologists (CAP) immunhisztokémiai minısítı programjának minıség-ellenırzési követelményeit és a CLSI immuncitokémiai minıségbiztosítás elfogadott irányelveit (14). A teszt igazolása A festırendszer diagnosztikai eljárásban történı elsı felhasználása elıtt a felhasználónak ellenıriznie kell a teszt teljesítményét. Ehhez ismert pozitív és negatív szöveteket képviselı, ismert immunhisztokémiai (IHC) teljesítményjellemzıkkel rendelkezı, laboratórium által biztosított mintasorozaton kell igazolnia a tesztet. Tekintse meg a terméktájékoztató jelen fejezetében korábban ismertetett minıségellenırzési eljárásokat. Ezeket a minıség-ellenırzési eljárásokat minden új készletnél, illetve a teszt paramétereinek megváltozásakor meg kell ismételni. A potenciális problémákat, azok okait és a lehetséges korrekciós intézkedéseket a 12. táblázatban ismertetjük. A festés értelmezése Nem laphámsejtes NSCLC és melanóma A tárgylemez kiértékelését patológusnak kell elvégeznie fénymikroszkóp segítségével. A PD-L1 immunhisztokémiai festés értelmezése és értékelése céljából a teljes minta kezdeti felméréséhez 4x-es, míg az ezt követı értékeléshez 10 20x-os nagyítású objektívet lehet használni (szükség esetén az ellenırzéshez pedig 40x-es objektívet). A PD-L1 festést egy barna (3,3 -diaminobenzidin, DAB) reakciótermék jelzi. A daganatsejtek teljes kerületén észlelhetı és/vagy a kerület mentén részlegesen megjelenı lineáris membránfestıdés bármilyen intenzitás esetén pozitív PD-L1 festıdést jelez. A teljes mintát ki kell értékelni. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen. Ha elıfordul, a citoplazma-festıdést nem kell beleszámolni az életképes sejtek közé. A jóindulatú sejtek és az immunsejtek (pl. az infiltráló limfociták vagy a makrofágok) szintén festıdhetnek a PD-L1 hatására; ezeket azonban nem szabad figyelembe venni a PD-L1 pozitivitást meghatározó pontozás során. ( ) P03914HU_02/SK / /17

6 MEGJEGYZÉS: Melanóma betegminták értelmezésekor barna színő melaninpigmentáció lehet jelen. A plazmamembrán festıdésének értékelésekor ki kell zárni a melanint; a melanintartalom felismerésében és kizárásában segítséget nyújthat egy NCR reagenssel festett lemezsorozattal való összehasonlítás. Ha a melanin nagyon magas koncentrációja eleve kizárja a tumorsejtek plazmamembránfestésének értékelését, a mintát ki kell zárni az értelmezésbıl és határozatlannak kell minısíteni. A tárgylemezeket minden festési futtatás során az 1. táblázatban megadott sorrendben kell megvizsgálni a festési menet érvényességének meghatározásához és a szövetminta festıdésének kiértékeléséhez. További információkért tekintse meg a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Interpretation Manual for Non-Squamous Non-Small Cell Lung Cancer or for Melanoma címő kiadványt. 1. táblázat: A tárgylemezek értékelésének javasolt sorrendje Minták Magyarázat Követelmények 1. H&E (A labor biztosítja) Elsı lépésként a hematoxilin és eozin (H&E) segítségével festett szövetminták kiértékelését kell elvégezni a szövettan és a prezervációs minıség felmérése érdekében. 2. Kontroll lemez (A Dako biztosítja) A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletben található elsıdleges PD-L1 antitesttel festett kontroll lemezeket meg kell vizsgálni annak ellenırzése érdekében, hogy minden reagens megfelelıen mőködik-e. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx tesztet és a H&E festést a minta ugyanazon paraffinblokkjából származó sorozatmetszeteken kell elvégezni. A szövetmintáknak épnek, megfelelıen prezervált állapotúnak kell lenniük, továbbá alkalmasnak kell lenniük a tumor jelenlétének megerısítésére. Minden egyes festési futtatás során meg kell festeni egy kontroll tárgylemezt az elsıdleges PD-L1 antitesttel. NCI-H226 (PD-L1 pozitív kontroll sejtvonal) elfogadási kritériumai: Plazmamembrán-festıdés a sejtek 80%-ában, 2+ átlagos festıdési intenzitás. Nem specifikus festıdés intenzitása < Pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja) A kontroll tárgylemez PD-L1- pozitív sejtvonalpelletet és PD-L1- negatív sejtvonalpelletet tartalmaz. Következı lépésként az elsıdleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett pozitív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeket kell megvizsgálni. Ezek a tárgylemezek igazolják, hogy hatékony volt a fixálási módszer és az antigénfeltáró folyamat. Az ismert pozitív kontroll szöveteket kizárólag a feldolgozott szövetek és tesztreagensek megfelelı teljesítményének ellenırzésére szabad használni, a páciensek mintáinak specifikus diagnosztizálásához NEM használhatók. MCF-7 (PD-L1 negatív kontroll sejtvonal) elfogadási kritériumai: Nincs specifikus festıdés. Nem specifikus festıdés intenzitása <1+. Felhívjuk figyelmét, hogy esetenként megfigyelhetı az MCF-7 sejtpellet néhány sejtjének festıdése. A következı elfogadási kritériumok alkalmazandók: elfogadható, ha a jellegzetes plazmamembrán-festıdést mutató sejtek összes száma 10, vagy ha az MCF-7 sejtpellet határain belül 1+ intenzitású citoplazmafestıdés van jelen. Ha bármelyik kontroll sejtvonal nem felel meg a fenti kritériumoknak, akkor a páciens mintáinak összes eredményét érvénytelennek kell tekinteni. A kontrolloknak a páciens mintájával megegyezı daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a páciens mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehetı leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. A festıdés értelmezéséhez használjon ép mintákat, mivel a nekrotikus vagy degenerált sejtek esetében gyakori a nem specifikus festıdés. A pozitív kontrollként használt szöveteknek PD-L1 festés esetén gyenge vagy közepes festıdést kell mutatniuk, ily módon ki tudják mutatni a teszt érzékenységének kismértékő változásait. Minden egyes festési futtatásba két pozitív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 anyaggal festett tárgylemez: Barna színő membránfestıdés jelenlétét kell megfigyelni. A nem specifikus festıdés legyen 1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemezek: Nincs membránfestıdés. A nem specifikus festıdés legyen 1+. Ha a pozitív kontroll szövetek nem mutatnak megfelelı pozitív festıdést, a tesztminták eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. ( ) P03914HU_02/SK / /17

7 4. Negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezek (A labor biztosítja) 5. Negatív kontrollreagens használatával festett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez 6. Elsıdleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensszöveteket tartalmazó tárgylemez A következı lépésben az elsıdleges PD-L1 antitesttel és a negatív kontroll reagenssel egyaránt megfestett, negatív kontrollszöveteket tartalmazó (más néven PD-L1 negatív) tárgylemezeket kell vizsgálni annak igazolására, hogy az elsıdleges antitest specifikusan jelöli a célantigént. Emellett a pozitív kontroll szövet negatív részei negatív kontroll szövetként is szolgálhatnak, de ezt a felhasználónak igazolnia kell. Vizsgálja meg a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletbıl származó negatív kontroll reagenssel megfestett páciensmintákat. A negatív kontroll reagens az elsıdleges antitest helyett kerül alkalmazásra, mely segít az antigén helyén történı specifikus festés értelmezésében. Utolsó lépésként a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletben lévı elsıdleges PD-L1 antitesttel megfestett páciensmintákat tartalmazó teljes tárgylemezt vizsgálja meg. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx immunreaktivitásával kapcsolatos specifikus információkért tekintse meg az Összefoglaló és magyarázat, a Korlátozások és a Teljesítményjellemzık címő fejezeteket. A kontrolloknak a páciens mintájával megegyezı daganatot tartalmazó biopsziás vagy sebészeti mintának kell lenniük, a páciens mintájával vagy mintáival azonos módon, a lehetı leggyorsabban fixálva, feldolgozva és beágyazva. Minden egyes festési futtatásba két negatív kontrollszövetet tartalmazó tárgylemezt kell bevonni. PD-L1 anyaggal festett tárgylemez: A tumorsejtek esetén nincs membránfestıdés. A nem specifikus festıdés legyen 1+. Negatív kontroll reagenssel festett tárgylemezek: Nincs membránfestıdés. A nem specifikus festıdés legyen 1+. Amennyiben a negatív kontrollszöveteket tartalmazó tárgylemezeken specifikus plazmamembrán-festıdés figyelhetı meg, a páciensminta eredményeit érvénytelennek kell tekinteni. A plazmamembrán-festıdés hiánya igazolja, hogy az elsıdleges PD-L1 antitest specifikusan jelöli a célantigént. A nem specifikus festıdés legyen 1+. A pozitív festıdés intenzitását az ugyanahhoz a futtatáshoz tartozó negatív kontroll reagens tárgylemezen megfigyelt nem specifikus háttérfestıdés figyelembe vételével kell értékelni. Mint minden immunhisztokémiai teszt esetén, itt is igaz, hogy a negatív eredmény csupán azt jelenti, hogy az antigén nem volt detektálható, és nem azt, hogy az antigén nem volt jelen a vizsgálatba bevont sejtekben/szövetekben. A PD-L1 pontszám értelmezése során a teljes PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemez valamennyi életképes daganatsejtjét értékelni kell és be kell vonni az értelmezésbe. A megfestett sejtek százalékos arányának meghatározásához minimálisan 100 életképes tumorsejtnek kell lennie a PD-L1 festett betegszövetet tartalmazó tárgylemezen. Általánosan érvényes korlátozások 1. Az immunhisztokémia többlépcsıs diagnosztikai folyamat, amely speciális képzést igényel a megfelelı reagensek kiválasztása, a szövetek kiválasztása, fixálása és feldolgozása, az immunhisztokémiai tárgylemez elıkészítése és a festıdési eredmények értelmezése területén. 2. A szövet festıdése függ a festést megelızı kezeléstıl és elıkészítéstıl. A nem megfelelıen végzett fixálás, fagyasztás, kiolvasztás, mosás, szárítás, melegítés és metszés, illetve a más szövetekkel és folyadékokkal történı szennyezés mőtermékeket, elégtelen antitestfeltárást vagy álnegatív eredményeket okozhat. Az ellentmondó eredmények oka a fixálási és beágyazási módszerek eltérései, illetve a szövetben eredendıen jelen lévı szabálytalanságok lehetnek. 3. A túlzott vagy elégtelen kontrasztfestés veszélyeztetheti az eredmények megfelelı értelmezését. 4. A pozitív festıdés, illetve a pozitív festıdés hiányának klinikai értelmezését a klinikai tünetek, a morfológia és egyéb hisztopatológiai kritériumok figyelembe vételével kell végezni. A festıdés, vagy a festıdés hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatokkal és megfelelı kontrollokkal, valamint egyéb diagnosztikai vizsgálatokkal kell kiegészíteni. A festett tárgylemez értelmezése az alkalmazott antitesteket, reagenseket és módszereket jól ismerı képesített patológus feladata. A festést tanúsított és engedélyezett laboratóriumban kell végezni, a festett tárgylemezek felülvizsgálatáért és a pozitív és negatív kontrollok megfelelıségének biztosításáért felelıs patológus felügyelete alatt. 5. A hepatitisz B vírussal fertızött személyektıl származó, hepatitisz B felületi antigént (HBsAg) tartalmazó szövetek torma-peroxidáz alkalmazásakor nem specifikus festıdést mutathatnak (15). 6. A daganatok és más patológiás szövetek antigén-expressziójának biológiai variabilitása miatt a váratlan reakciók lehetıségét nem lehet teljesen kizárni a tesztelt szövettípusok esetében. Értesítse a Dako technikai támogató csoportját, ha váratlan reakciókat észlel. 7. A proteinek vagy szubsztrát reakciótermékek nem immunológiai jellegő kötıdése álpozitív eredményeket adhat. Ugyancsak álpozitív eredményt adhat a pszeudoperoxidáz aktivitás (eritrociták) vagy endogén peroxidáz aktivitás (citokróm c) (14). 8. A rendszerhez biztosított reagenseket és útmutatásokat optimális teljesítmény eléréséhez alakítottuk ki. A reagensek további hígítása, illetve az inkubálási idı vagy a hımérséklet megváltoztatása hibás vagy ellentmondó eredményeket adhat. Termékspecifikus korlátozások 1. A hamis negatív eredményeket okozhatja az, hogy az antigén idıvel lebomlik a szövetekben. A tárgylemezre rögzített szövetmetszeteket sötét helyen, 2 8 C-os hımérsékleten, vagy legfeljebb 25 C-os szobahımérsékleten kell tárolni, és a metszetkészítést követı 4 hónapon belül meg kell festeni. A szövetek épségének és antigenitásának megırzése érdekében a rögzítést követıen tilos a tárgylemezeket 25 C-ot meghaladó hımérsékleten tárolni vagy kezelni. 2. Az optimális és reprodukálható eredmények érdekében a PD-L1 protein antigénfeltáró elıkezelést igényel a szövetek rutinszerő fixálása (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazása során. ( ) P03914HU_02/SK / /17

8 3. A reagenseket nem szabad eltérı tételszámú készletekbıl vagy más gyártóktól származó készletekbıl pótolni. Az egyetlen kivétel az EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), amely szükség szerint a K8005 kódszámot használva rendelhetı. 4. A megfestett kontroll sejtvonalak csak a festési futtatás validálására használhatók, a szövetmetszetek festıdési reakciójának pontozására viszont nem. 5. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx használatát a 10%-os neutrális pufferelt formalinon kívül más fixálószerrel fixált szöveteken nem validáltuk. 6. Az excíziós, incíziós, punch- vagy vastagtő-biopsziával nyert mintatípusok elfogadhatónak bizonyultak a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletet használó klinikai vizsgálatok számára. A vékonytő-biopsziával levett vagy egyéb citológai minták nem voltak megfelelıek a biomarker-elemzéshez, ezért kikerültek a PD-L1 IHC 28-8 pharmdx készletet használó klinikai vizsgálatokból. A nem klinikai teljesítmény értékelése A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx analitikai specificitása A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx elsıdleges antiteste egy nyúl monoklonális anti-humán PD-L1 antitest, a clone Az antitest elıállításához használt immunogén a humán PD-L1 extracelluláris doménjét (Phe19-Thr239) tartalmazó, tisztított rekombináns humán PD-L1. Az elsıdleges PD-L1 antitesttel történı IHC festés nem mutatott keresztreaktivitást a kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtek által exogén módon expresszált PD-L2-vel. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx kifejezetten az FFPE szövetekben lévı tumorsejtekben expresszált PD-L1 membránfehérje detektálására szolgál, amely a PD-L1 antigén hozzáadásával teljesen megszüntethetı. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx nem képes detektálni a PD-L1 membránfehérjét olyan PD-L1 knock-out tumorsejtekben, amelyben a PD-L1 gént genetikailag törölték. Normál és daganatos szövetek A 2. táblázat a Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 antitest immunreaktivitását foglalja össze a normál szöveteket tartalmazó javasolt panelen. A 3. táblázat a Monoclonal Rabbit Anti-Human PD-L1 antitest immunreaktivitását foglalja össze daganatos szövetek esetén több különféle tumort tartalmazó microarray vizsgálatokban. Minden szövet formalinban fixált, paraffinba ágyazott volt, és a tájékoztatóban leírt módon festették meg PD-L1 IHC 28-8 pharmdx reagenssel. A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx által detektált PD-L1 fehérje olyan típusú sejtek membránjában található, amelyek ismerten a PD-L1 antigén expressziójára képesek, mint pl. az immunsejtek és az epithelialis eredető, fıként tumorsejtek sejtjei. 2. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx normál szöveteken mért reaktivitásának összefoglalása Szövettípus (vizsgált #) Pozitív plazmamembrán-festıdés: Szövetelemek Pozitív citoplazma-festıdés: Szövetelemek Agyalapi mirigy (3) 1/3 adenohipofízis elülsı lebenye 1/3 adenohipofízis elülsı lebenye 3/3 neurohipofízis hátulsó lebenye Bır (3) 0/3 1/3 epithelium Csecsemımirigy (3) 3/3 medulla epithelium 0/3 Csontvelı (3) 3/3 megakariociták 3/3 megakariociták Emlı (3) 0/3 0/3 Gyomor (3) 0/3 0/3 Hasnyálmirigy (3) 3/3 epithelium (fıként szigetsejtek) 3/3 epithelium (fıként szigetsejtek) Here (3) 0/3 1/3 Leydig-sejtek Kisagy (3) 0/3 0/3 Lép (3) 1/3 makrofágok 0/3 3/3 litorális sejt Máj (3) 2/3 immunsejtek 2/3 immunsejtek Mandula (3) 3/3 crypta epithelium 0/3 3/3 csíraközpont (immunsejtek) Méh (3) 0/3 0/3 Méhnyak (3) 1/3 epithelium 1/3 epithelium Mellékpajzsmirigy (3) 3/3 epithelium 0/3 Mellékvese (3) 3/3 velıállomány sejtek 3/3 velıállomány sejtek Mezoteliális sejtek (3) 0/3 0/3 Nagyagy (3) 0/3 0/3 Nyálmirigy (3) 0/3 0/3 Nyelıcsı (3) 0/3 0/3 Pajzsmirigy (3) 0/3 0/3 Perifériás ideg (3) 0/3 0/3 Petefészek (3) 0/3 0/3 Prosztata (2) 0/2 0/2 Szívizom (3) 0/2 0/2 Tüdı (3) 3/3 alveoláris makrofágok 0/3 Vastagbél (3) 2/3 makrofágok 0/3 Vázizom (3) 0/2 0/2 Vékonybél (2) 0/2 0/2 Vese (3) 3/3 tubulus epithelium 3/3 tubulus epithelium ( ) P03914HU_02/SK / /17

9 3. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx daganatos szöveteken mért reaktivitásának összefoglalása Tumor típusa Elhelyezkedés / Szerv PD-L1 pozitív/összes (N=162) Bronchioloalveolaris carcinoma, tüdı 0/1 Emlı, DCIS 0/2 Emlı, invazív duktális 3/7 Emlı, invazív duktális, nyirokcsomóáttét 1/1 Epehólyag 2/4 Fej és nyak, kemény szájpad 0/1 Féregnyúlvány 1/1 Gyomor 1/6 Gyomor, mucinózus 0/1 Gyomor-bélrendszeri, tüdıáttét 0/1 Hasnyálmirigy 1/2 Hasnyálmirigy, duktális 0/3 Méh, endometrium 1/3 Méh, világossejtes 1/1 Méhnyak, endocervikális típus 0/1 Adenocarcinoma Nyálmirigy/parotis 0/2 Nyelıcsı 1/1 Pajzsmirigy, follikuláris 0/1 Pajzsmirigy, follikuláris-papilláris 0/1 Pajzsmirigy, papilláris 0/3 Petefészek 0/1 Petefészek, endometriális 0/1 Petefészek, mucinózus 0/1 Petefészek, szerózus 0/1 Prosztata 2/4 Rectum 2/4 Tüdı 2/5 Vastagbél 2/5 Vastagbél, májáttét 1/1 Vastagbél, mucinózus 0/1 Vékonybél 0/2 Adrenokortikális karcinóma Mellékvese 0/1 Astrocytoma Nagyagy 0/3 Átmeneti sejtes karcinóma Húgyhólyag 3/6 Vese 0/1 Basalis sejtes karcinóma Bır 0/1 Embrionális karcinóma Here 0/1 Ependymoma Agy 0/1 Glioblasztóma Agy 0/1 Hepatoblasztóma Máj 0/1 Hepatocelluláris karcinóma Máj 1/5 Rectum 0/1 Interstitialoma Vastagbél 0/1 Vékonybél 0/1 Karcinóma Nasopharyngealis, NPC 0/1 Kissejtes karcinóma Tüdı 1/2 Kordóma Medenceüreg 0/1 Bır 1/2 Fej és nyak 0/2 Méh 1/1 Laphámsejtes karcinóma Méhnyak 2/4 Metasztatikus nyelıcsı laphámsejtes karcinóma áttéte 1/1 nyirokcsomóban Nyelıcsı 4/7 Tüdı 1/3 Limfóma Anaplasztikus nagysejtes Nyirokcsomó 1/1 Diffúz B-sejtes Nyirokcsomó 2/4 Hodgkin Nyirokcsomó 2/2 Non-Hodgkin Nyirokcsomó 1/1 Liposzarkóma Hasüreg, mucinosus 0/1 Medulláris karcinóma Pajzsmirigy 0/1 Medulloblastoma Agy 0/1 Melanóma Orrüreg 0/1 Rectum 0/1 Meningióma Agy 0/2 Mezotelióma Peritoneum 0/1 Nagysejtes karcinóma Tüdı 1/1 Neuroblasztóma Retroperitoneum 0/1 Neurofibróma Lágyszövet, derék 0/1 Pecsétsejtes karcinóma Metasztatikus pecsétsejtes karcinóma carcinoma áttéte petefészekben 0/1 Vastagbél 0/1 Primitív neuroektodermális Retroperitoneum 0/1 ( ) P03914HU_02/SK / /17

10 Tumor típusa Elhelyezkedés / Szerv PD-L1 pozitív/összes (N=162) Spermatocitóma Here 0/2 Szarkóma Kondroszarkóma Csont 0/1 Leiomyosarcoma Húgyhólyag 0/1 Lágyszövet, mellkasfal 0/1 Liposzarkóma Hasüreg, mucinosus 0/1 Oszteoszarkóma Csont 0/2 Lágyszövet, embrionális 0/1 Rhabdomyosarcoma Prosztata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Synoviális szarkóma Medenceüreg 0/1 Világossejtes Hasfal 0/1 Szeminóma Here 0/2 Szigetsejttumor Hasnyálmirigy 0/1 Thymoma Mediastinum 1/1 Vesesejt karcinóma Papilláris Vese 0/1 Világossejtes Vese 0/6 Analitikai érzékenység: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx analitikus érzékenységét 112 egyedi pácienstıl származó nem laphámsejtes, I IV. stádiumú NSCLC FFPE mintán vizsgáltuk egy gyártói készlet segítségével. A PD-L1 expresszió értékelése festıdést mutatott a 0-100% pozitív daganatsejt és 0-3 festıdési intenzitás tartományban. Megismételhetıség: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ismételhetıségét a Dako vizsgálta. A teljesítményadatokat a 4. táblázat tartalmazza. Minden egyes meghatározott PD-L1 expressziós szint esetén elvégzésre került a tesztek negatív százalékos egyezési (NPA), pozitív százalékos egyezési (PPA) és teljes százalékos egyezési (OA) értékének független páros összehasonlítása. A leggyakrabban megfigyelt értéket alkalmaztuk az NPA, a PPA és az OA, valamint az ezekhez tartozó 95%-os Wilson-féle konfidencia-intervallumok kiszámításához, így az ezen megfigyelésbıl származó egyik érték eltávolításra került a páros összehasonlítási mőveletbıl. 4. táblázat: A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx ismételhetısége - nem laphámsejtes NSCLC Megismételhetıség Módszer Berendezések között Megfigyelık között Napok között Tételek között Futtatásokon belül A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban teszteltük három Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 60 független páros összehasonlítást végeztünk. A 12, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban három analitikus segítségével ellenıriztük egy Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 72 független páros összehasonlítást végeztünk. A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát három példányban öt nem egymást követı napon ellenıriztük az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 80 független páros összehasonlítást végeztünk. A 20, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát két példányban öt reagenstétellel vizsgáltuk az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 160 független páros összehasonlítást végeztünk. A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát egy futtatáson belül nyolc példányon vizsgáltuk az Autostainer Link 48 berendezésben. Összesen 70 független páros összehasonlítást végeztünk. % egyezés (95%-os CI) 1% expressziós szint 5% expressziós szint 10% expressziós szint NPA 100 (82,4, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) ( ) P03914HU_02/SK / /17

11 Külsı reprodukálhatóság: Nem laphámsejtes NSCLC A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx külsı reprodukálhatóságát három külsı tesztelıhely vizsgálta. Értékelés elıtt a megfestıdött metszetek vakosítására és randomizálására került sor. A teljesítményadatokat az 5. táblázat tartalmazza. Minden egyes meghatározott PD-L1 expressziós szint esetén elvégzésre került a tesztek negatív százalékos egyezési (NPA), pozitív százalékos egyezési (PPA) és teljes százalékos egyezési (OA) értékének független páros összehasonlítása. A leggyakrabban megfigyelt értéket alkalmaztuk az NPA, a PPA és az OA, valamint az ezekhez tartozó 95%-os Wilson-féle konfidencia-intervallumok kiszámításához, így az ezen megfigyelésbıl származó egyik érték eltávolításra került a páros összehasonlítási mőveletbıl. 5. táblázat: A három külsı vizsgálóhelyen tesztelt PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - nem laphámsejtes NSCLC reprodukálhatósága Reprodukálhatóság Vizsgálóhelyek közötti elemzés (három vizsgálóhely) Vizsgálóhelyen belüli vizsgálat Megfigyelık között (egy megfigyelı mindhárom vizsgálóhelyen) Egy megfigyelın belül (egy megfigyelı mindhárom vizsgálóhelyen) Módszer A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát öt nem egymást követı napon teszteltük. A vizsgálóhelyek közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 140 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. A 10, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı nem laphámsejtes NSCLC mintát öt nem egymást követı napon teszteltük a három vizsgálóhelyen. A vizsgálóhelyen belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 120 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. A 15, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı, PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével megfestett nem laphámsejtes NSCLC minta pontozását három patológus végezte el három nem egymást követı napon, három vizsgálóhelyen. A megfigyelık közötti elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 120 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. A 15, különbözı PD-L1 IHC expressziós szintekkel rendelkezı, PD-L1 IHC 28-8 pharmdx segítségével megfestett nem laphámsejtes NSCLC minta pontozását három patológus végezte el három nem egymást követı napon, három vizsgálóhelyen. A egy megfigyelın belüli elemzést három vizsgálóhelyen, összesen 90 független páros összehasonlítás segítségével végeztük. A klinikai teljesítmény értékelése: Nem laphámsejtes NSCLC % egyezés (95%-os CI) 1% expressziós szint 5% expressziós szint NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) A PD-L1 IHC 28-8 pharmdx klinikai használatóságának értékelése a CA számú, háromfázisú, randomizált, nyílt jelöléső, nivolumab és docetaxel készítményeket összehasonlító, felnıtt ( 18 év), elırehaladott vagy áttétes nem laphámsejtes NSCLC-ben szenvedı pácienseken végzett vizsgálattal történt, akiket elızıleg eredménytelenül kezeltek platinabázisú doublet kemoterápiával. A vizsgálatban összesen 582, 112 vizsgálati helyrıl, 22 országból származó tesztalany került be randomizált módon (Argentína, Ausztrália, Ausztria, Brazília, Kanada, Chile, Csehország, Franciaország, Németország, Hongkong, Magyarország, Olaszország, Mexikó, Norvégia, Peru, Lengyelország, Románia, Oroszország, Szingapúr, Spanyolország, Svájc és az Egyesült Államok). A tesztalanyok 1:1 arányban kerültek randomizálásra, a rétegezés pedig a következı elvek szerint történt: 1) elızetesen alkalmaztak kontra nem alkalmaztak fenntartó terápiát és 2) másodvonalbeli kontra harmadvonalbeli terápia. A vizsgálat elıtti (alapértékeket képviselı) tumorszövetmintákat még a randomizálás és az elsı kezelés elıtt begyőjtöttük a hatékonyság elıre megtervezett, elıre meghatározott alapszintő PD-L1 expressziós szintek szerinti elemzése érdekében (másodlagos cél). Az elsıdleges cél a teljes túlélés (OS) meghatározása volt. Az egyéb másodlagos célok közé tartozott az objektív válaszarány (ORR), progressziómentes túlélés (PFS), valamint a betegséggel összefüggı tünetek 12 hét alatt bekövetkezı javulása a tüdırák tüneti skála (LCSS) alapján mérve. Az alapszintő demográfiai és betegségjellemzık összességében kiegyenlítetten fordultak elı a nivolumab és docetaxel csoportok randomizált tesztalanyai között. Az átlagos életkor 62 év volt (tartomány: 21 85), ahol az alanyok 34%-a volt 65 éves vagy idısebb, és 7%-a volt 75 éves vagy idısebb. A páciensek túlnyomó része fehér (92%) férfi (55%) volt; az alapszintő ECOG teljesítménystátusz 0 (31%) vagy 1 (69%) volt. A páciensek hetvenkilenc százaléka volt leszokott/aktív dohányos. A tumorminták nem laphámsejtes, a vizsgálat bevonási kritériumainak megfelelı NSCLC tumorokból kerültek begyőjtésre. A 6. táblázat a CA számú vizsgálatban részt vevı randomizált tesztalanyok elıre meghatározott alapértékő expressziós szinteken mutatott PD-L1 expressziójának gyakoriságát mutatja. 6. táblázat: Vizsgálat elıtti PD-L1 expresszió gyakorisága a CA vizsgálatban részt vevı összes, nem laphámsejtes NSCLC-ben szenvedı randomizált tesztalany esetén Kiindulási populáció PD-L1 expressziós kategória Nivolumab 3 mg/kg Docetaxel Összesen Összes Mérhetı PD-L1, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) PD-L1 expresszió 1% 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) PD-L1 expresszió < 1% 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) PD-L1 expresszió 5% 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) PD-L1 expresszió < 5% 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Kiinduló PD-L1 expresszió 10% 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) PD-L1 expresszió < 10% 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) PD-L1 nem mérhetı, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) ( ) P03914HU_02/SK / /17