FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone EP1 Használatra kész (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Kód: IS084. Javasolt alkalmazás

Átírás

1 FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α Clone EP1 Használatra kész (Dako Autostainer/Autostainer Plus) Kód: IS084 Javasolt alkalmazás Az antigén szinonimái Összefoglalás és magyarázat Biztosított reagens Immunogén Specificitás In vitro diagnosztikai alkalmazásra. A FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, Clone EP1 használatra kész (Dako Autostainer/Autostainer Plus) antitest immunhisztokémiai alkalmazásra, a humán ösztrogénreceptornak a formalinban fixált, paraffinba ágyazott humán emlıkarcinómás szöveti metszetekbıl, Autostainer/Autostainer Plus készülékekkel végzett félkvantitatív meghatározására szolgál. Az antitest az ösztrogénreceptor-α-pozitív sejteket jelöli meg, és segítséget nyújt a humán emlıkarcinómák ösztrogénreceptor státuszának a meghatározásában. A festıdés, illetve a festıdés hiányának klinikai értelmezését morfológiai vizsgálatokkal kell kiegészíteni megfelelı kontrollok alkalmazása mellett, és a kiértékelést a páciens kórtörténetének és egyéb diagnosztikai vizsgálati eredményeinek figyelembevételével patológus szakorvosnak kell végeznie. ER α A szteroidreceptorok nagy affinitást és specificitást mutatnak ligandjaik iránt. A humán ösztrogénreceptor (ER) fıként sejtmagok membránjában található, 65 kda molekulatömegő dimer protein, és azon trans-acting fehérjék osztályába tartozik, amelyek a hormonválasz-egységekként is ismert specifikus DNS-elemekhez való kötıdésük révén stimulálják a transzkripciót. Az ösztrogén megkötése által az ER indukálódik a géntranszkripció stimulálására, ezért indukálható erısítı faktorként is ismert (1, 2). Kórtörténetekre alapuló tanulmányok kimutatták, hogy pozitív korreláció áll fenn (azaz prognosztikus tényezı a jól differenciált, invazív emlırák esetében) az ER-státusz és a kezelés nélkül várható kimenetel, illetve az antihormonális terápia, például a tamoxifenre adott válasz között (2). Az ösztrogének elsısorban az állatok ösztrogén célszerveiben és a humán emlırákos szövetekben koncentrálódnak, és jól dokumentált tény, hogy az ösztrogén mitogén hatásait az ER közvetíti. Az emlırák növekedésének biológiai mechanizmusaival kapcsolatos kutatások eredményei szerint a növekedési arány a legtöbb emlırák esetében függ az ösztrogén, a progeszteron, vagy mindkettı jelenlététıl (2). Ezért emlıkarcinómákban az ösztrogénreceptor-státuszt validált prognosztikai és prediktív tényezınek számít az antihormonális terápiát alkalmazó kezelés szempontjából (2-4). Az alábbi témakörök áttekintéséhez lásd a Dako Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez c. kiadványát vagy az IHC eljárás detektálórendszerének útmutatóját: 1) Az eljárás elve, 2) Szükséges, de nem biztosított anyagok, 3) Tárolás, 4) Mintaelıkészítés, 5) A festési eljárás, 6) Minıségellenırzés, 7) Hibaelhárítás, 8) A festıdés értékelése, 9) Általános korlátozások. Használatra kész monoklonális nyúl antitest folyékony formában, stabilizáló fehérjét és 0,015 mol/l nátrium-azidot tartalmazó pufferben. Klón: EP1. Az ER α aminosavainak megfelelı rekombináns fehérje. Az MCF7 sejtekbıl készített lizátumok Western-blotján az antitest egy hozzávetıleg 67 kda molekulasúlyú, az ER α várt molekulatömegének megfelelı jelentısebb sávot jelöl meg. Az antitest nem lép keresztreakcióba az ER ß-val. Óvintézkedések 1. In vitro diagnosztikai alkalmazáshoz. 2. Kizárólag hozzáértı felhasználóknak. 3. A termék nátrium-azidot (NaN 3) tartalmaz, amely tiszta formában erısen mérgezı vegyület. Bár a termékben található koncentráció besorolása alapján nem veszélyes, a nátrium-azid reakcióba léphet az ólom és réz vízvezetékekkel, amelynek eredményeképpen rendkívül robbanékony fém-azid lerakódások alakulhatnak ki. Megsemmisítéskor nagy mennyiségő vízzel kell leöblíteni a vízvezetékben történı fém-azid felhalmozódás megelızésének érdekében. 4. Mint bármely biológiai eredető termék esetében, a megfelelı kezelési eljárásokat kell alkalmazni. 5. Viseljen megfelelı személyi védıfelszerelést, hogy a termék ne kerülhessen a szembe vagy a bırre. 6. Az oldat fel nem használt részét a helyi, állami és szövetségi elıírásoknak megfelelıen kell megsemmisíteni. ( ) P01470HU_003_IS084/ p. 1/5

2 Tárolás Mintaelıkészítés és a szükséges, de nem biztosított anyagok A festési eljárás és a szükséges, de nem biztosított anyagok 2 8 C-on tárolandó. Az üvegen feltüntetett lejárat i idı után nem használható fel. Ha a reagenseket a megadottól eltérı körülmények között tárolják, a felhasználónak igazolnia kell a feltételek megfelelıségét. Nincsenek olyan jelek, amelyekbıl egyértelmően megállapítható lenne, hogy a termék lebomlott. Emiatt a páciens mintáival egyidejőleg pozitív és negatív kontrollokat is vizsgálni kell. Ha nem várt festıdés jelenik meg, amely nem magyarázható a laboratóriumi technikákban rejlı eltérésekkel, és antitesttel kapcsolatos probléma gyanítható, forduljon a Dako mőszaki szolgálatához. Az antitest formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek jelölésére alkalmazható. A szövetmintákból körülbelül 4 µm-es metszeteket kell készíteni. Hıindukált epitópfeltárási (HIER) technikát alkalmazó elıkezelést kell végezni a Dako PT Link (Kód: PT100/PT101/PT200) készülék segítségével. A részleteket illetıen kérjük, olvassa el a PT Link használati útmutatóját. A legjobb eredményeket a szövetek EnVisionFLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (Kód: K8010/K8004) reagenssel, 97 C-on végzett 20 perces elıkezelése, majd EnVision FLEX Wash Buffer reagenssel (Kód: K8007) végzett 5 perces kezelése adja. Paraffinba ágyazott metszetek: A formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetmetszetek elıkezeléséhez a Dako PT Link 3 az 1-ben minta-elıkészítı eljárása javasolt. A festést követıen a metszeteket dehidratálni kell, el kell távolítani a visszamaradt dehidratáló reagenst, majd tartós rögzítıszer segítségével fel kell vinni tárgylemezre. A szövetmetszeteknek a kezelés, illetve az alábbi immunhisztokémiai festési eljárás során nem szabad kiszáradniuk. A szövetmetszetek tárgylemezhez való tapadásának elısegítésére ajánlott a Dako Silanized Slides (kód: S3003) használata. Az ajánlott megjelenítı rendszer az EnVisionFLEX, High ph (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Kód: K8010/ K8024), melyet az alább ismertetett protokoll szerint kell használni. A reagenseket használat elıtt megfelelıen kell hígítani. Valamennyi lépést szobahımérsékleten (20 25 C) kell elvégezni. 1. Inkubálja a szövetmetszeteket 200 µl EnVision FLEX Peroxidase-Blocking Reagent (Kód: DM821) reagenssel 5 (±1) percig. 2. Mossa a metszeteket 1 5 percig EnVision FLEX Wash Buffer pufferrel (Kód: K8007). 3. Inkubálja a szövetmetszetet 200 µl primary antibody termékkel (Kód: IS082) 20 (±1) percig. 4. Mossa a metszeteket 1 5 percig EnVision FLEX Wash Buffer pufferrel (Kód: K8007). 5. Inkubálja a szövetmetszeteket 200 µl EnVision FLEX/HRP reagenssel (Kód: DM822) 20 (±1) percig. 6. Mossa a metszeteket 1 5 percig EnVision FLEX Wash Buffer pufferrel (Kód: K8007). 7. Inkubálja a szövetmetszetet 200 µl EnVision FLEX Wash Buffer pufferrel (Kód: K8007) 5 (±1) percig. 8. Mossa a metszeteket 1 5 percig EnVision FLEX Wash Buffer pufferrel (Kód: K8007). 9. Inkubálja a szövetmetszeteket 400 µl EnVision FLEX Substrate Working Solution reagensben (Kódok: DM823 és DM827) 10 (±1) percig. 10. Mossa a metszeteket 1 5 percig EnVision FLEX Wash Buffer pufferrel (Kód: K8007). 11. Végezze el a metszet kontrasztfestését EnVision FLEX Hematoxylin (Kód: K8018) segítségével 5 (±1) percig. 12. Mossa a metszetet ioncserélt vízzel 1 5 percig. 13. Inkubálja a szövetmetszetet 200 µl EnVision FLEX Wash Buffer pufferrel (Kód: K8007) 5 (±1) percig. 14. Mossa a metszetet ioncserélt vízzel 1 5 percig. 15. Rögzítse a metszeteket tartós rögzítı közeg segítségével. ( ) P01470HU_003_IS084/ p. 2/5

3 Programozási táblázat a javasolt teszthez: Valamennyi inkubálási lépést szobahımérsékleten kell végezni. További részletekért kérjük, olvassa el az adott eszköz Használati útmutatóját. Az Auxiliary (kiegészítı) lépésnél 10 tárgylemez festésekor a rinse buffer (öblítı puffer) beállítást kell választani. >10 tárgylemez festésekor az Auxiliary lépésnél a none (nincs) beállítást kell választani. Ez biztosítja az öblítési idık összehasonlíthatóságát. Az optimális körülmények a mintától és az elıkészítés módjától függıen változhatnak, ezeket az egyes laboratóriumoknak kell validálniuk (5). Ellenırizze, hogy a módosított protokoll továbbra is hiteles eredményeket biztosít-e. Vizsgálja meg, hogy a kapott festıdési mintázat megegyezik-e a Teljesítményjellemzık" pontban ismertetett festıdési mintázattal. Hematoxilin kontrasztfestéshez javasolt az EnVisionFLEX Hematoxylin (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (Kód: K8018) reagens alkalmazása. Nem vizes alapú, tartós rögzítıszer használata ajánlott. Javasolt a páciensmintákkal egyidejőleg pozitív és negatív kontrollokat futtatni ugyanazt a protokollt alkalmazva. Ideális esetben a pozitív kontrollok között olyan emlıcarcinoma szövetnek is lenni kell, amelyben az ER expressziója alacsony szintő. Alternatívaként jóindulatú méhnyakszövet is használható. A sejteknek vagy struktúráknak az összes pozitív minta esetében a Teljesítményjellemzık" részben az adott szövettípusra vonatkozóan ismertetett reakciómintázatot kell mutatniuk. Az ajánlott negatív kontroll reagens a FLEX Universal Negative Control, Rabbit, Használatra kész (Autostainer/Autostainer Plus) (Kód: IS600). A festés értelmezése Termékspecifikus korlátozás Teljesítményjellemzık A sejtfestıdési mintázat nukleáris. Ha citoplazma jelölıdése is megfigyelhetı, azt nem specifikusnak kell tekinteni. Pozitív eredményt a tumorsejtek 1%-ának magfestıdése jelent (6). Ez összhangban van a pozitív értékeléshez az ASCO/CAP által ajánlott 1% vagy annál több pozitív tumorsejt határértékkel (3). 1. Álnegatív eredményeket okozhat, hogy az antigén idıvel lebomlik a szövetekben. A szobahõmérsékleten tárolt mintákat a szövetek lemezre való rögzítés után 2 hónapon belül meg kell festeni (7). 2. Az optimális és reprodukálható eredmények érdekében rutin szövetfixálás (semleges pufferelt formalin) és paraffinba ágyazás esetén az ER fehérje detektálásához antigén feltárást kell végezni. 3. A nem formalinnal rögzített szövetek esetében a Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 használatát még nem validálták. Precizitás: Vizsgálat céljára sorozatmetszetet készítettünk a három különbözı, formalinban fixált, paraffinba ágyazott emlıcarcinoma blokkból. A vizsgálat a következı módon zajlott: Meneten belüli precizitás: A standard EnVision FLEX, High phprotokollnak megfelelıen három szövetblokk metszeteit Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 reagenssel festettük meg. Egyidejőleg az egyes blokkokból egy-egy metszetet negatív kontroll reagenssel festettünk meg. Menetek közötti precizitás: Szövetblokkonként egy-egy metszettel megismételtük a fenti eljárást két további napon. Egyidejőleg az egyes szövetblokkokból egy-egy metszetet negatív kontroll reagenssel festettünk meg. ( ) P01470HU_003_IS084/ p. 3/5

4 Készülékek közötti precizitás: Szövetblokkonként három-három metszettel három különbözı Autostainer készüléken végeztük a fenti eljárást. Egyidejőleg az egyes szövetblokkokból egy-egy metszetet negatív kontroll reagenssel festettünk meg. A Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 reagenssel végzett precizitási kísérletek konzisztens eredményeket adtak a futtatáson belüli, futtatások közötti és készülékek közötti vizsgálatok során. A vizsgálat során azonos vizsgálati körülményeket tartottunk fenn, és a reagenseket 2 8 C hımérsékleten tároltuk a futtatások között. Normál szövetek: Az 1. táblázat mutatja a Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 immunreaktivitását a normál szövetek ajánlott csoportjával szemben. A szöveteket formalinban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk és a terméktájékoztatóban leírt utasítások szerint Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 reagenssel festettük. 1. táblázat: Normál szövetek Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 reaktivitásának összefoglalása Szövettípus Pozitív festıdéső szövetelemek (vizsgált szövetek száma) Agyalapi mirigy (3) 0/3 Bır (3) 0/3 Csecsemımirigy (3) 0/3 Csontvelı (3) 0/3 Emlõ (2) 2/2 Glanduláris epithel sejtek (20%), nukleáris Gyomor (3) 0/3 Hasnyálmirigy (3) 0/3 Here (3) 0/3 Kisagy (3) 0/3 Lép (3) 0/3 Máj (3) 0/3 Mandula (3) 2/3 Epithel sejtek (1%), nukleáris 1/3 Germinális centrum limfociták (<1%), nukleáris Méh (3) 3/3 Myometrium (<1 40%), nukleáris 3/3 Glanduláris epithelium (50 80%), nukleáris 3/3 Stróma sejtek (30 80%), nukleáris Méhnyak (3) 3/3 Epithel sejtek (30%), nukleáris 3/3 Stromális sejtek (30%), nukleáris Mellékpajzsmirigy (3) 0/3 Mellékvese (3) 0/3 Mesothelsejtek (3) 0/3 Nagyagy (3) 0/3 Nyálmirigy (3) 0/3 Nyelıcsı (3) 1/3 Epithel sejtek (<1%), nukleáris Pajzsmirigy (3) 0/3 Perifériás ideg (3) 0/3 Petefészek (3) 3/3 Follikuláris epithelium (20 40%), nukleáris 2/3 Stróma sejtek (10 30%), nukleáris Prosztata (3) 3/3 Stróma sejtek (5 30%), nukleáris Szívizom (3) 0/3 Tüdı (3) 0/3 Vastagbél (3) 0/3 Vázizom (3) 0/3 Vékonybél (3) 0/3 Vese (3) 0/3 A módszer összehasonlítása: A Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 reagens tesztelését EnVision FLEX készülékkel végeztük, és az ASCO/CAP irányelveknek ( 1% határérték) megfelelıen értékeltük (3). Az anti-er α keverék (1D5 és ER klónok) tesztelését Dako ER/PR pharmdx Kit segítségével végeztük, és az eredményeket a terméktájékoztatóban leírt Allred pontozási irányelv szerint értékeltük. A módszerösszehasonlítási adatok a 2. táblázatban láthatók. A megfelelı pontozási irányelveket figyelembe véve a Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 erıs korrelációt mutatott a Dako ER/PR pharmdx Kit ER α antitest komponensével. Az összes egyezés 96,2%, a pozitív egyezés 98,9%, a negatív egyezés 92,2% volt. 2. táblázat: Egyezés a Clone EP1, Anti-ER α és az ER/PR pharmdx Kit anti-er α komponense között Monoclonal Rabbit Anti- Human ER α, Clone EP1 Anti-ER α Component of ER/PR pharmdx Kit Pozitív Negatív Összesen Pozitív Negatív Összesen ( ) P01470HU_003_IS084/ p. 4/5

5 Pozitív százalékos egyezés = 183/185 = 98,9% Negatív százalékos egyezés = 119/129 = 92,2% Összes százalékos egyezés = 302/314 = 96,2% Kappa = 0, %-os konfidencia intervallum = 0,8761 és 0,9645 között Hivatkozások 1. Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen receptor. Cell 1987;51: Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. Diseases of the Breast. Harris et al. eds., Lippincott Williams & Wilkins 2000; Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134: Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast cancer: College of American Pathologists Consensus Statement Arch Pathol Lab Med 2000;124: Fitzgibbons PL, Murphy DA, Hammond EH, Allred C, Valenstein PN. Recommendations for Validating Estrogen and Progesterone Receptor Immunohistochemistry Assays. Arch Pathol Lab Med 2010:134; Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing testing accuracy. Adv Anat Pathol 2005;12:10-9. Review. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( )- CLSI, 940 West Valley Road, Suite Wayne, PA USA M3634 IHC003-D03803 Report on file. A Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, Clone EP1 antitestet az Epitomics Inc. hozta létre az Epitomics jogvédett monoklonális nyúl antitest technológiájának segítségével, amely az 5,675,063 és a 7,402,409 szabadalmak oltalma alatt áll. Kiadás: 11/15 ( ) P01470HU_003_IS084/ p. 5/5