A pre-analitika szerepe a patológiai minták. Dr. Lotz Gábor Semmelweis Egyetem, II. sz. Patológiai Intézet

Átírás

1 A pre-analitika szerepe a patológiai minták megőrz rzöttségében Dr. Lotz Gábor Semmelweis Egyetem, II. sz. Patológiai Intézet

2 A sebészeti anyagok útja Műtő OPTIMÁLIS HŐMÉRSÉKLET (20-22 C) IDŐFAKTOR (15 perc 1óra) Patológiai osztály Fixálás (24 óra, 10%-os pufferolt formalin) Kivágás Paraffinba ágyazás Diagnózis felállítása

3 Formalinban fixált anyagok vizsgálata Metszeten HE Speciális festések Immunhisztokémia In situ hibridizáció DNS/RNS/fehérje kinyerés után DNS-alapú technikák RNS-alapú technikák Fehérje-alapú technikák (FISH, CISH, SISH)

4 MILESTONE TissueSAFE High Vacuum Biospecimens Transfer System

5

6 Anyag és módszer műtéti (nagy)anyag: 1 ép máj metastasis mellőli, 1 focalis nodularis hyperplasia 1 colon adenocarcinoma májáttéte 4 ép vese (világossejtes veserák mellől) 1 ép gyomor (gyomor tumor mellől) 1 pecsétgyűrűsejtes carcinoma 1 leiomyoma uteri 1 liposarcoma

7 Anyag és módszer 2. Módszer: A mintákat a rezekciótól számított 15 percen belül a.) vákuumfóliáztuk, majd +4 C fokon tároltuk. A 0., 3., 6. és 10. napon a minták egy-egy részletét beágyazás után HE, PAS, IHC. DNS (QIAmp DNA FFPE Tissue Kit)- és RNS-izolálás (Qiagen RNeasy FFPE Kit ) után 1,2% agaróz gélelektroforézis. -80 C-ra friss mintát tettünk el. DNS (QIAmp DNA FFPE Tissue Kit)- és RNS-izolálás (TRIzol) után 1,2%-os agaróz gélelektroforézis. b.) formalinban tároltuk A 3., 6. és 10. napon a minták egy-egy részletét beágyazás után HE, PAS, IHC. DNS (QIAmp DNA FFPE Tissue Kit)- és RNS-izolálás (Qiagen RNeasy FFPE Kit ) után 1,2%-os agaróz gélelektroforézis.

8 Vese beérkezéskor (0. nap) Vese 6. nap Vese 3. nap Vese 10. nap

9 Vese, 0. nap, HE, 400x Vese, 3. nap, HE, 400x VÁKUUM-FÓLIÁZOTT, PARAFFINBA ÁGYAZOTT VESE Vese, 6. nap, HE, 400x Vese, 10. nap, HE, 400x

10 Vese, 0. nap, PAS, 400x Vese, 3. nap, PAS, 400x VÁKUUMFÓLIÁZOTT, PARAFFINBA ÁGYAZOTT VESE Vese, 6. nap, PAS, 400x Vese, 10. nap, PAS, 400x

11 Vese, 0. nap, CD10, 400x Vese, 3. nap, CD10, 400x FÓLIÁZOTT, BEÁGYAZOTT VESE Vese, 6. nap, CD10, 400x Vese, 10. nap, CD10, 400x

12 Vákuum-foliázás hatása a minták RNS- és DNS-koncentrációjára nap 3.nap 6.nap 10.nap 50 0 Folia Formalin RNS (ng/µl) nap 3.nap 6.nap 10.nap DNS (ng/ µl) 0 Fólia Formalin

13 A fóliázott mintákból izolált DNS fragmentációja Fóliázás: máj vese 1 vese 2 vese 3 gyomorák Nap: C o 1000 bp 500 bp FFP 1000 bp 500 bp Nap: máj vese 1 vese 2 vese 3 gyomorák CSAK- FFPE: 1000 bp 500 bp ~0,5 µg DNS/minta, 1.2%-os gél Nap: vese 2 vese 3 gyomorák

14 Következtetések A fóliázott sebészeti anyag szállítása és tárolása biztonságosabb. A formalin-igény csökken a sebészeti osztályokon. A rutin diagnosztikai eljárások számára a szöveti struktúra jól megőrzött marad. A molekuláris pathologiai vizsgálatok esetében több napos tárolás után is a műtét utáni állapottal csaknem megegyező minőségű makromolekulák izolálhatóak. A vákuumfóliázás technika előnyösebb a tumorbankok és a kutatások számára a rutin formalinos fixálással szemben. Korlátok: anaerob rothasztó baktériumok jelenléte esetén, (pl. vastagbéldaganatoknál) korlátozott lehet ezen eljárás alkalmazhatósága.

15 FISH: A pre-analitikai hibák következményei A Her2-pozitív emlőrákok mellett a célzott terápiás lehetőségek egyre bővülő köre kezelhetővé képes tenni olyan, korábban reménytelen daganatos megbetegedéseket is, mint a tüdőrák vagy a melanoma egyes fajtái. Fennáll annak lehetősége, hogy egy beteg azért nem részesülhet célzott kezelésben, mert szövetmintájának rossz minőségű feldolgozása miatt nem lehet azon diagnosztikus értékű molekuláris patológiai vizsgálatot végezni. Következmények???

16 FISH: A pre-analitikai hibák következményei A sokszor nagyon nehezen értékelhető esetek... elégtelenül fixált túlfixált eozinnal festett fixálatlanul tárolt/szállított és utólagosan fixált

17 Elégtelenül fixált szövet MET / CEN 7

18 Elégtelenül fixált szövet ALK break apart

19 Túlfixált szövet Her2 / CEN 17

20 Elégtelenül fixált szövetek standard feltárással

21 Elégtelenül fixált szövetek standard feltárással Elégtelenül fixált szövetek módosított feltárással

22 Túlfixált szövetek standard feltárással

23 Túlfixált szövetek módosított standard feltárással

24 Az eozinos felületfestés hatása Az eozin savas vegyhatású festék, így a nukleinsavak degradálódását okozhatja (savas hidrolízissel bomlanak). Másrészt az eozin zavarja a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) kiértékelését, mert ha nem is károsodott olyan mértékben a célszekvencia, ami a hibridizációt meghiúsítaná, de az eozin rendkívül erős fluoreszcenciája a szöveti autofluoreszcenciát olyan mértékben felerősíti, hogy az a specifikus fluoreszcens jeleket elfedheti. Fontos tudni, hogy az eozin utólagos savas elszíntelenítése az autofluoreszcenciát nem csökkenti, de a fehérjéket, nukleinsavakat tovább károsítja. Felületfestési célra Giemsa vagy metilénkék használata javasolt, de bármely más olyan festék alkalmazható, ami nem növeli jelentősen a háttér-fluoreszcenciát és megőrzi a makromolekulákat (próbafestés!).

25 Eozin-festett szövet EGFR / CEN 7

26 fixálatlanul szállított és utólagosan fixált szövet Her2 / CEN 17

27 FISH: A pre-analitikai hibák következményei A teljesen reménytelen esetek... nem-pufferolt formalinnal (túl)fixált nagyon túlfixált savval dekalcinált fixálatlanul tárolt/szállított és utólagosan fixált

28 Túlfixálás, nem-pufferolt formalinnal

29 A neutrális pufferolt formalin jelentősége A hagyományosan használt, csapvízzel hígított formalin nem felel meg a mai felhasználási követelményeknek. Állás során a formalinban hangyasav képződik a formaldehid oxidációja miatt továbbá, továbbá a szövetekből kioldott fehérjékben a bázikus aminocsoportok fixálás közbeni lekötődése miatt túlsúlyra jutnak a savas csoportok. Savas közegben a fehérjék szerkezete irreverzibilisen megváltozhat (így pl. az epitópok is) és a nukleinsavak savas hidrolízissel bomlanak! Csak a stabil neutrális ph-t biztosító, úgynevezett neutrális pufferolt formalin (NPF) alkalmas a megfelelő szöveti fixálásra. Ennek jelentőségét jól szemlélteti, hogy ugyanazon szövetminta NPFban fixált részletéből kb. 50-szer több β-aktin DNS molekula nyerhető ki, mint a nem-pufferolt formalinban fixáltból!

30 Erős túlfixálás (agresszív feltárás után)

31 Savas dekalcinálás

32 fixálatlanul szállított és utólagosan fixált

33 Következtetés A pre-analitikai tevékenységek korszerű kivitelezése, a megfelelő mintaelőkészítés elengedhetetlen előfeltétel nemcsak a szövettani, de a molekuláris patológiai vizsgálatok eredményességéhez is.

34 Prof. Dr. Tímár József Dr. Kiss András Dr. Korompay Anna Dr. Törzsök Péter Dr. Somorácz Áron Dr. Lendvai Gábor Dr. Szász Marcell Sklánitzné Samodai Erika Pekár Zoltánné Tordainé Szabó Hédi KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS