Immundiagnosztikai módszerek

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Immundiagnosztikai módszerek"

Ilona Bogdánné
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Western blot/immunoblot Immundiagnosztikai módszerek Katona Éva Ag Enzim/Fluorochrome/ izotóp Másodlagos, jelzett At Primer At Western Blotting fehérje/ag preparálás (1) Fehérje tisztítás/extrahálás -Totál protein standard lízis puffer A degradáció megakadályozására -a mintákat mindig 4 0 C-on centrifugáljuk -proteáz inhibitor pl. Pefabloc (Roche diagnostics) legyen a rendszerben fehérje tartalom meghatározás : Bradford reagens Standard BCA assay (Pierce) Western Blotting Elektroforézis (2) Poliakrilamid gél a fehérjéket denaturáljuk (disszociáljuk): anionos detergens (SDS), redukáló ágens és hő a polipeptidek kötődnek az SDS-hez: negatív töltés SDS-polipeptid komplexek a méretük alapján vándorolnak a gélben a polipeptid módosulásai pl. foszforiláció és glikoziláció hatással lehet 1

2 Western Blotting Elektroforézis (3) Western Blotting Elektroforézis (4) SDS-PAGE-et diszkontinuous puffer rendszerben végezzük Minta puffer és tömörítő gél Tris-HCl (ph:6.8) Szeparáló gél Tris-HCl (ph:8.8) Puffer tartály Tris-glycine (ph:8.3) tömörítő gél (akrilamid <5%) PH=6.8 szeparáló gél (akrilamid >5%) PH=8.8 Összetétel : Bis : az akrilamid monomereket keresztköti SDS : denaturáló reagens, Tris-HCl : klorid ion front vezeti a fehérjéket a pozitív elektród felé Amonium perszulfát : szabad gyököt biztosít TEMED : stabilizálja a polimerizációt Western Blotting Protein transzfer (5) Western Blotting Membrán típusok (6) - Nedves transzfer - Félszáraz transzfer 3MM papír membrán Gél 3MM papír + Nitrocellulóz (pórus méret 0.45 µm) standard membrán Nylon membránok Nagyobb affinitással kötik a proteineket, magas háttér Polyvinylidene fluoride (PVDF) nagy Affinitású kötés, előkezelés methanollal Az immobilizált protein láthatóvá tehető ponceau S festékkel (nylon membránoknál nem) - 2

3 Western Blotting blokkolás (7) Western Blotting Torma peroxidáz (HRPO) jelölés esetén 5% zsírszegény tejpor, bovine serum albumin, BLOTTO Alkalikus foszfatáz jelölés esetén 6% kazein, 1% polyvinylpyrrolidone, 10mM EDTA PBS-ben, 1 óra 65 0 C hőkezelés, tárolás 4 0 C-on Immunhisztokémia Normál szérum abból az állatfajból, melyben a második antitest készült Western Blotting Detektálás (8) Izotóppal jelzett antitestek Enzimekkel konjugált antitestek Horseradish peroxidase (HRPO) Alkaline phosphatase Biotinált antitestek Fluorochrome-jelzett antitestek : FITC, PE, EC5, PC5, stb. Western Blotting enzim konjugátumok (9) Western Blotting Detektálás (10) Hosrseradish peroxidase/alkaline phosphatase 1. Kromogén detektálás: HRP: Diaminobenzidine (DAB)-barna csapadék AP: BCIP/NTP- liláskék precipitátum 2. Kemiluminescens detektálás HRP: Luminol- az oxidált luminol kék fényt emittál ECL reagens (Pierce) AP: AMPPD a defoszforilált termék fényt bocsát ki 3

Hibalehetőségek : Nem-specifikus kötődés -A hiperimmun antiszérum a cél antigénen kívül más antigének ellen is tartalmaz IgG-t -Az antiszérum alacsony affinitással más, nem cél antigénekhez is

4 Hibalehetőségek : Nem-specifikus kötődés -A hiperimmun antiszérum a cél antigénen kívül más antigének ellen is tartalmaz IgG-t -Az antiszérum alacsony affinitással más, nem cél antigénekhez is kötődhet -Elfogadhatatlanul magas hátteret ad az antiszérum Immunhisztokémia Metszetek: Kriosztátos (~7µm) fagyasztott szövetekből, Paraffinba ágyazott (~ 5µm) Blokkolás: endogén peroxidáz, H202 ; nemspecifikus kötés, a második antitestet termelő állat normál széruma Első antitest (1-5µg/ml) Inkubálás 20 antitest, peroxidáz konjugált/biotinált At Detektálás DAB-al (barna) Festés haematoxylin-nal (kék) 4

5 Immunkromatográfia MŰKÖDÉSI ELV- REAKCIÓ Reakció Üvegszálas szűrő Sejtes elemek feltartóztatása Plazma Detektálási zóna Plazma Marker: ctnt Mioglobin D-Dimer 5

MŰKÖDÉSI ELV- DETEKTÁLÁS Kontroll: Az arannyal jelzett anti-marker MAB2 (az adott markerre specifikus monoklonális antitest 2) a szintetikus peptidhez kötődik Negatív reakció: A streptavidinnel

Marker: kardiális Troponin T Mioglobin D-Dimer A KEZELÉSE Code chip és tesztcsík behelyezése Code chips Minden doboz tesztcsík tartalmaz egy chip-et.

Tesztcsíkok: Cardiac M, Cardiac T Quantitative, Cardiac D-Dimer Minden tesztcsík alsó oldalán van egy bar code, amit a készülék leolvas. A bar code adatainak meg kell egyezniük a tesztcsík adataival.

6 MŰKÖDÉSI ELV- DETEKTÁLÁS Kontroll: Az arannyal jelzett anti-marker MAB2 (az adott markerre specifikus monoklonális antitest 2) a szintetikus peptidhez kötődik Negatív reakció: A streptavidinnel fedett felszínhez csak a biotinált anti-marker MAB1 kötődik Pozitív reakció: A streptavidinnel fedett felszínhez biotinált anti-marker MAB1-markerarannyal jelzett anti-marker MAB2 komplex kötődik Marker: kardiális Troponin T Mioglobin D-Dimer A KEZELÉSE Code chip és tesztcsík behelyezése Code chips Minden doboz tesztcsík tartalmaz egy chip-et. A tesztcsíkok első használata előtt be kell helyezni a készülékbe. A Lot-specifikus adatokat a készülék leolvassa és eltárolja. Tesztcsíkok: Cardiac M, Cardiac T Quantitative, Cardiac D-Dimer Minden tesztcsík alsó oldalán van egy bar code, amit a készülék leolvas. A bar code adatainak meg kell egyezniük a tesztcsík adataival. Qualyti Control Liofilizált kontroll szérumokkal (Cardiac reader célértékkel). A kontroll szérumok oldása 1 ml desztillált vízben történik. 150 µl kontroll szérum szükséges egy méréshez. A KEZELÉSE A minta felvitele Szívjunk fel 150 ± 15 µl vért pipettába v. fecskendőbe A tesztcsíkok dobozában található code chip-et kattanásig illesszük be a képen látható résbe A tesztcsíkot helyezzük be a készülékbe szükséges anyagok Minta: Heparinos, vénás, teljes vér Nyomjuk meg a start gombot, ekkor a tesztcsík mintafelviteli pozícióba fordul Mérjük be a mintát a teszt csík piros háromszöggel jelzett mintafelviteli helyére A mintafelviteli eszközt tartsuk függôleges pozícióban függőleges 6

A KEZELÉSE Minták mérése Az eredmények megjelenítésekinyomtatása A minta felvitele után nyomjuk meg a start gombot A kijelzőn az eredményközlésig hátralévő idő látható Az

0 µg/l Mérési idő: 12 perc Cardiac M Heparinos teljes vér Mérési tartomány: 30-700 µg/l Mérési idő: 8 perc Cardiac D-Dimer Heparinos teljes vér Mérési tartomány: 0.

A GYORSTESZT KIVITELEZÉSE Vérvétel Heparinos csőbe vagy fecskendôbe Szívjunk fel 150 µl (± 15 µl) Mérjük rá a mintát a teszt csík vért pipettába v.

7 A KEZELÉSE Minták mérése Az eredmények megjelenítésekinyomtatása A minta felvitele után nyomjuk meg a start gombot A kijelzőn az eredményközlésig hátralévő idő látható Az eredmény csatolt (külső) printeren ki is nyomtatható Teszt paraméterek Cardiac T Quantitative Heparinos teljes vér Mérési tartomány: µg/l Mérési idő: 12 perc Cardiac M Heparinos teljes vér Mérési tartomány: µg/l Mérési idő: 8 perc Cardiac D-Dimer Heparinos teljes vér Mérési tartomány: mg/l Cut-off: 0.5 mg/l Mérési idő: 12 perc Amikor a tesztcsík visszafordul a kiindulási pozícióba, a készülék felszólít, hogy távolítsuk el. A GYORSTESZT KIVITELEZÉSE Vérvétel Heparinos csőbe vagy fecskendôbe Szívjunk fel 150 µl (± 15 µl) Mérjük rá a mintát a teszt csík vért pipettába v. fecskendőbe piros háromszöggel jelzett mintafelviteli helyére és 15 perc után olvassuk le az eredményt a) Egy vonal (kontroll vonal) b) Két vonal (kontroll és teszt) = negatív teszt eredmény = pozitív teszt eredmény c) Nincs kontroll vonal = nem valós eredmény! Ismételjük meg a tesztet! 7

Hasonló dokumentumok

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 14-15

Western blot/immunoblot Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban 14-15 Enzim/ Fluorochrome 2 0 t 1 0 t Katona Éva g Western lotting fehérje/g preparálás (1) Fehérje tisztítás/extrahálás -Totál protein