Avidin biotin rendszer

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Avidin biotin rendszer"

Rebeka Bognár
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 Avidin biotin rendszer Avidin: 4 alegység, Da Da glikoprotein Green M Avidin Adv Prot Chem (1975) biotin kötőhely/alegység; CH kötőhely/alegység pi ~ 10 avidin biotin 1.3*10-15 M (Trp, Lys kötőhely) stabilitás (8 M UREA, 3M Guanidin. HCl) nem-specifikus kötődés is treptavidin treptomyces avidinii 4 alegység, Da protein biotin kötőhely/alegység pi 5 6 kisebb nem-specifikus kötődés

3*10-15 M (Trp, Lys kötőhely) stabilitás (8 M UREA, 3M Guanidin.

2 Biotin D-biotin, (hexahidro-2-oxo-1h-tieno[3,4-d]imidazol-4-pentánsav) minden sejt, kis mennyiség kofaktor R (C 2 transzport) előfordulás: Lys ε-aminocsoport BICITI hiánybetegség (1927, BA)

3 Konjugátumok ph 1.5 tartó biotin HC pentánsav reaktív csoport zempontok kötőhelyek mélysége 9 Å biotin származék gyengébb kölcsönhatás pl. iminobiotin ph 4 HC Biotinálás - 2, -H, -C=, -CH, fotoreaktív 2 + Br -

4 - 2 HC D-biotin Karbodiimid + 6-aminokapronsav H 2 HC BICITI HÁRMFUKCIÓ KJUGÁTUM R Aktív észter 13.5 A R = H R = 3 a -biotin zulfo--biotin R zukcinimidil-6-(biotinamido)-hexanoát -LC-biotin R = H, R = 3 a 22.4 A 2 + Br - HC Iminobiotin H R --BITI 24.3 A Affinitás kromatográfia

5 -H a H (CH2 ) 4 (CH 2 ) 4 MALEIMID BUTÁ BITI ph A BITI-BMCC DMF/DM TIÉTER KÖTÉ b (CH 2 ) 2 (CH2 ) 6 (CH 2 ) 4 H 2-piridilditio propionsavamid Biotin DIZULFID KÖTÉ ph 7 EDTA 29.2 A BITI-HPDP DMF/DM

6 A BITI-BMCC DMF/DM TIÉTER KÖTÉ b (CH 2 ) 2 (CH2 )

6 -CH (CH 2 ) 4 H 2 H H 2 (CH 2 ) 4 (CH 2 ) 5 H BITI HIDRAZID BITI-LC-HIDRAZID 15.7 A 24.7 A -CH H H 2 (CH 2 ) 4 (CH 2 ) 5 5-(biotinamido)pentilamin

7 A. zintézis módszerek 1) Reakciótípusok Biokonjugátumok szintézise, a konjugátumok jellemzése, problémák Egy-lépéses (single pot) Két-lépéses pl. két partner pl. direkt jelölés két partner + kapcsolószer pl. homobifunkciós reagens két partner + kapcsolószer: első lépés: egyik partner + kapcsolószer második lépés: aktivált első partner + másik partner heterobifunkciós reagens (MB) homobifunkciós reagens (toluol-2,4-diizocianát, glutáraldehid)

homobifunkciós reagens két partner + kapcsolószer: első lépés: egyik partner + kapcsolószer második lépés:

8 Három lépéses 1. IgG 2 + H 3 IgG H PIRRL-α-ACILAZID 2. HA ph < 7 HA + bis-diazo-p-fenilén diamin 3. IgG H HA Howard A, Wild F: Br J Exp Pathol (1957) pl. immunokonjugátumok, immunotoxinok

9 Többlépéses IgG (CH 2) 2 PDP 2. Tx 2 + IgG (CH 2 ) 2 Tx (CH 2 ) DTT 4. IgG (CH 2 ) 2 H (CH 2 ) 2 Tx Tx (CH 2 ) 2 H

10 2) Reakciókörülmények reagens / kapcsolóágens megválasztása ph [reagens, funkciós csoport, partnerek funkciója] reakcióidő [30 perc - nap] fény [UV látható] hő inoerősség [ionizáltság mértéke, konformáció] moláris arányok koncentráció oldékonyság oldószer pl. -hidroxi szukcinimidek hidrolízis 10 perc ph 8.6 TRATÉGIA kis hőmérsékletfüggés 4-5 óra ph 7.0 perc óra koncentráció mm

mértéke, konformáció] moláris arányok koncentráció oldékonyság oldószer pl.

11 B. Analízis módszerek [kicsi nagy, nagy nagy] dialízis molekulatömeg időtartam molekulaméret csere molekulatöltés oldószer UC méret hőmérséklet gélszűrés/gpc HPLC elektroforézis papír méret töltés ephadex, Bio-Gel P méret különbség (alak!) detektálási módszer (cpm, UV stb.) eluens (oldékonyság, stabilitás) molekulaméret - standardek gél (PAGE, AGAR) detektálási módszerek egy/két dimenzió (Festés, cpm, UV, fluoreszcencia) (Funkcionális: enzimaktivitás, immunoreaktivitás)

(alak!) detektálási módszer (cpm, UV stb.

12 C. Komplikációk, problémák Heterogenitás ennek jellemzése / oldékonyság reprodukálhatóság /specificitás, szelektivitás/ a szubsztitúció mértékének meghatározása (spektroszkópia, cpm, M stb.) stabilitás ( polc, oldat vs. idő, körülmények) kémiai (pl. aggregálódás) funkcionális (pl. enzim) immunogenitás / allergizáló hatás denaturáció biodisztribúció sejtbe jutás módja

M stb.) stabilitás ( polc, oldat vs. idő, körülmények) kémiai (pl.

13 Egy arany -os történet Zsigmondy R (1905) kolloidális arany-sol (< 10 nm) Faulk WP, Taylor GM (1971) immunogold elektronmikroszkóp (Immunochemistry ) blotting flow-cytometry hibridizáció (1990/1991)

14 1. Monodiszperz arany-szuszpenzió előállítása HAuCl 4 klóraranysav / K 2 C 3 oldat acitrát aszkorbinsav nm 6 15 nm 1983 foszfor < 5 nm 1905 abh 4 2 nm 1984 Σ Redukció: Au 3+ Au o

aszkorbinsav 15 150 nm 6 15 nm 1983 foszfor <

15 2. Protein arany konjugátum Datív kötés Ionos kölcsönhatás Arany részecske Hidrofób kölcsönhatás Deryagin BV, Landau L (1941) ActaPhysiochim VR Verwey EJW, verbeck JTG (1948) Theory of the stability of lyophobic colloids Elsevier DVL teória

(1941) ActaPhysiochim VR 14 633-662 Verwey EJW, verbeck JTG

16 Mechanizmus/előállítás (kék) + a + Cl - vagy puffer Arany-szol (narancsvörös) protein (narancsvörös) követés: színváltozás λ = 580 nm változás Abszorpció Horisberger M et al. Experienta (1975) protein ( µg) Arany-szol (0.25 ml) ellenőrzés λ = 580 nm +10% acl 1 min a) koaguláció λ = 580 nm b) nincs változás

Horisberger M et al. Experienta 31 1147-49 (1975) protein (2.

17 Befolyásoló tényezők Gyakorlat Előnyei a protein töltésviszonyai pi az abszorpciós folyamat ph-ja próbák nincs univerzális protokol 10% többlet a fehérjéből, mint a minimum pi környezetében menjen a reakció láthatóvá tétel / mikroszkópia stabil (v.ö. fluorofór, kromofór) biztonságos (v.ö. radioizotóp) kvantitatív mérés

fehérjéből, mint a minimum pi környezetében menjen a reakció láthatóvá tétel /

18 Ellis I et al. J Histochem Cytochem (1988) Antitesttel fedett arany részecske Célsejt Lektinnel fedett felszín BG-Hansen TC et al. J Immunol Meth (1978) ejtmembrán Poliszacharid lánc Arany részecske Glükoproteinek és glükolipidek Extracelluláris Intracelluláris pecifikus kötődés a cukor felismerő egységhez

19 Az A fehérje fedi a részecske felszínét treptavidin adszorbeálva az arany felszínéhez Arany részecske Arany részecske Antitest kötődése az antigénhez Az A fehérje kötődése az antitest Fc régiójához Antitest kötődése az antigénhez Biotinilált antitest zövet Jemmenson R, Agre M J Histochem Cytochem (1987) zövet Moreis RE, aelinger CB J Histochem Cytochem (1984)

régiójához Antitest kötődése az antigénhez Biotinilált antitest zövet Jemmenson R, Agre M J

Hasonló dokumentumok

9. Előadás Fehérjék Előzmények Peptidkémia Analitikai kémia Protein kémia 1901 E.Fischer : Gly-Gly 1923 F. Pregl : Mikroanalitika 1952 Stein and Moore : Aminosav analizis 1932 Bergman és Zervas : Benziloxikarbonil