2. AKTIN-KÖTŐ FEHÉRJÉK

Átírás

1 A CITOSZKELETÁLIS RENDSZER Bugyi Beáta PTE ÁOK, Biofizikai Intézet 2. AKTIN-KÖTŐ FEHÉRJÉK Citoszkeletális aktin HEp-2 sejtekben - rodamin-falloidin jelölés forrás: Nyitrai Miklós, Grama László, PTE ÁOK, Biofizikai Intézet

2 ÁTTEKINTÉS. hegyes vég (-) Pi szöges vég (+) TAPOSÓMALOM EGYENSÚLY ATP ADP D nukleotid csere T

3 AZ AKTIN FUNKCIONÁLIS SOKSZÍNŰSÉGE EUKARIÓTA IZOM SEJTEK NEM-IZOM SEJTEK polaritás sejtmozgás LP LM SF Arc FA FC FP sejthalál, apoptózis alak, mechanikai stabilitás fagocitózis endocitózis izomösszehúzódás szabályozása NÖVÉNYEK organellum-, vezikula transzport exo-, endocitózis sejtciklus szabályozása intarcelluláris pathogének mozgása SEJTMAG transzkripció kromatin remodelling jelátvitel endoszómák mozgása sejtosztódás kontraktilis gyűrű kromoszóma transzport PROKARIÓTA ParM, MreB aktin homológ fehérjék sejtalak plazmid szegregáció

4 EUKARIÓTA NÖVÉNYEK NEM-IZOM SEJTEK sejtmozgás polaritás FC alak, mechanikai stabilitás IZOM SEJTEK LP FA az aktin fehérje viszonylag LM egyszerűnek tűnik fagocitózis SF Arc endocitózis endoszómák mozgása intarcelluláris pathogének mozgása sejtosztódás izomösszehúzódás betöltő, különböző szabályozása szerkezeti és dinamikai sajátságokkal kontraktilis gyűrű SEJTMAG kromoszóma transzport organellum-, vezikula transzport exo-, endocitózis sejtciklus szabályozása AZ AKTIN FUNKCIONÁLIS SOKSZÍNŰSÉGE transzkripció kromatin remodelling jelátvitel PROKARIÓTA FP ParM, MreB aktin homológ fehérjék sejtalak plazmid szegregáció sejthalál, apoptózis Mi teszi lehetővé a sejten belüli változatos funkciókat rendelkező aktin filamentum hálózatok kialakítását?

5 AKTIN FEHÉRJE A SEJTBEN Fluoreszcencia mikroszkópia - GFP-jelölt aktin (Green Fluorescent Protein) Fibroblaszt forrás: Vic Small

6 AZ AKTIN CITOSZKELETONHOZ ASSZOCIÁLT FEHÉRJÉK. AZ AKTIN MONOMEREKHEZ/FILAMENTUMOKHOZ SPECIFIKUSAN KAPCSOLÓDÓ, KÜLÖNBÖZŐ FUNKCIÓJÚ FEHÉRJÉK

7 AZ AKTIN CITOSZKELETONHOZ ASSZOCIÁLT FEHÉRJÉK. KAPCSOLÓDÁSUK SZERINT monomerhez kötődő PROFILIN THYMOSIN B4 filamentumhoz kötődő véghez kapcsolódó SAPKA FEHÉRJE oldalhoz kapcsolódó TROPOMIOZIN MIOZIN CORTACTIN

8 AZ AKTIN CITOSZKELETONHOZ ASSZOCIÁLT FEHÉRJÉK. FUNKCIÓJUK SZERINT filamentum képződést (polimerizációt) befolyásoló G : F aktin arányát szabályozó nukleációt/elongációt befolyásoló fehérjék NUKLEÁCIÓS FAKTOROK: formin, Arp2/3 komplex, PROFILIN: nukleotid cserét katalizálja az aktin monomeren polimerizációt gátló: SAPKA FEHÉRJE: szöges vég dinamikáját blokkolja THYMOSIN B4: monomereket szekvesztrálja depolimerizációt elősegítő ADF/COFILIN: aktin elegységek disszociációjának elősegítése a szöges végen GELSOLIN: filamentumok darabolása filamentumot stabilizáló TROPOMIOZIN filamentumokat keresztkötő FILAMIN, SPEKTRIN: gélformáló A-AKTININ, FIMBRIN, FASCIN, VILLIN: kötegformáló motorfehérjék MIOZIN

9 G-aktin NUKLEÁCIÓS FAKTOROK Formin N-WASP/WAVE/Scar - Arp2/3 komplex WH2 domén fehérjék (Spire, Cordon Bleu, Leiomodin) MONOMER-KÖTŐ profilin thymosin b4 FRAGMENTÁLÓ FEHÉRJÉK gelsolin F-aktin KÖTEGFORMÁLÓ FEHÉRJÉK a-aktinin, fimbrin, fascin, villin GÉLFORMÁLÓ FEHÉRJÉK filamin, spektrin, MOTORFEHÉRJÉK miozin OLDALKÖTŐ FEHÉRJÉK tropomiozin, ADF/cofilin, kortaktin, talin, VÉGKÖTŐ FEHÉRJÉK sapkafehérje, gelsolin, vinculin

10 AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 1. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK SPONTÁN FILAMENTUMKÉPZŐDÉS ~ 10 ~ G ~ 10 6 ~ G + G G2 G2 + G G3 G3 + G F - + monomer dimer trimer / nukleusz filamentum Az aktin filamentumok spontán nukleációja lassú az aktin dimerek/trimerek instabilitása miatt.

11 AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 1. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK NUKLEÁCIÓS FAKTOROK - + az aktin filamentumok nukleációját segítik elő/katalizálják membránhoz kötött, jelátviteli utak által szabályozott fehérjék anarchikus filamentum képződés az aktin filamentumok képződésének térbeli és időbeli szabályozása G : F aktin arányának szabályozása egyedi mechanizmus: aktin oligomerek stabilizálása/monomerek filamentumba épülésének elősegítése különböző szerkezetű aktin filamentum hálózatok kialakítása

12 AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 1. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK Az aktin filamentumok képződésének sebessége: df dt df dt k Nc k N szöges hegyes szöges ( k k ) Nc ( k k hegyes ) N Hogyan növelhető a polimerizáció sebessége? N: filamentum végek koncentrációja k + : asszociációs sebességi állandó

13 NUKLEÁCIÓS FAKTOROK N-WASP/WAVE/Scar Arp2/3 komplex ARPC4 ARPC3 ARPC2 Arp3 Arp2 ARPC5 ARPC1 Arp2/3 komplex 3D röntgendiffrakciós szerkezete Arp2/3 : Actin-related protein 7 alegységből álló komplex (Arp2, Arp3) inaktív, aktivátorai: WAVE/N-WASP/Scar/WHAMM/WASH/WAFL/JMY kortaktin/miozin I

14 NUKLEÁCIÓS FAKTOROK N-WASP/WAVE/Scar Arp2/3 komplex Fibroblaszt Lamellipodium elektronmikroszkópós képe (0.1 mm) elágazásos aktin filamentum hálózat: sejtmozgás lamellipodium képződés patogének mozgása, idegnyúlványok formálása Keratocita (Xenopus laevis) Fent: fluoreszcencia mikroszkópos képe: Arp 2/3 komplex Lent: Lamellipodium elektronmikroszkópos képe

15 NUKLEÁCIÓS FAKTOROK N-WASP/WAVE/Scar Arp2/3 komplex nincs növekedés inaktív Arp2/3 komplex anya filamentum aktív Arp2/3 komplex Arp2/3 komplex anya filamentum izomerizáció Arp2 Arp3 laterális dimer növekedés a szöges végen N: filamentumvégek koncentrációja

16 NUKLEÁCIÓS FAKTOROK FORMINOK N mdia1 FH1-FH2 C GDB FH3 FH1 linker FH2 DAD profilin G-aktin nukleációs aktivitás Formin Homológia domének (FH1, FH2) FH2: dimer, aktin kötő régió, szükséges és elégséges a nukleációt elősegítő hatás kifejtéséhez FH1: profilint kötő régió (profilin: aktin monomer kötő fehérje) A Bni1p formin FH2 doménjének 3D röntgendiffrakciós szerkezete inaktív (N-, és C terminális közötti intramolekuláris autoinhibíciós kölcsönhatás), aktivátorai: RhoGTPázok

17 NUKLEÁCIÓS FAKTOROK FORMINOK GFP-dDia2 / F-aktin Aktin kötegek (Drosophila melanogaster) 0.1 mm Filopodia (Dictyostelium) egyenes aktin filamentumok: sejtosztódás: kontraktilis gyűrű, polaritás: aktin kábelek sejtmozgás: stressz szálak, filopodia, sejt-sejt kapcsolatok endocitózis aktin-mikrotubulus kölcsönhatás

18 NUKLEÁCIÓS FAKTOROK FORMINOK profilin-aktin: spontán nukleáció gátolt ATP hidrolízis FH2 domén elmozdul a + vég irányába + - nyitott zárt nyitott zárt nukleáció processziv elongáció a szöges végen a filamentumok szöges végéhez kötődik, ugyanakkor elősegíti a profilin-aktin filamentumba épülését N: filamentum végek koncentrációja k+: asszociációs sebességi állandó

19 NUKLEÁCIÓS FAKTOROK FORMINOK Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia Egyedi aktin filamentumok polimerizációja formin jelenlétében Bni1p FH1-FH2 Aktin Fluoreszcencia mikroszkópia Egyedi aktin filamentumok elongációja mdia1 FH1-FH2 funkcionalizált mikrogyöngyökről

20 pirén fluoreszcencia, a.u. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK ÖSSZEFOGLALÁS pirén fluoreszcencia, a.u. Arp2/3 komplex formin 2.5 mm aktin nm GST-VCA + 50 nm Arp2/3 2.5 mm aktin + 25 nm mdia1 FH1-FH2 1,0 1,0 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0, idõ, s 0, idő, s N: filamentum végek koncentrációja N: filamentum végek koncentrációja k+: asszociációs sebességi állandó

21 NUKLEÁCIÓS FAKTOROK ÖSSZEFOGLALÁS Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia Egyedi aktin filamentumok polimerizációja formin jelenlétében (DAAM FH1-FH2) Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia Egyedi aktin filamentumok polimerizációja Arp2/3 komplex jelenlétében

22 AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: ADF/kofilin Az aktin ATPáz aktivitásának következménye: taposómalom egyensúly (treadmilling): növekedés a szöges végen Pi depolimerizáció a hegyes végen J(c) ADP ATP C cb T D 0 [G-aktin] C ss C cp gyorsabb depolimerizáció a hegyes végen (~ 30x) J(c) ADP ATP C cb T c ss ADF D 0 + ADF [G-aktin] C ss (ADF)

23 AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: sapka fehérje növekedés a szöges végen Pi depolimerizáció a hegyes végen J(c) ADP ATP C cb T D 0 [G-aktin] C ss C cp capping/sapkázás : gátolt növekedés a szöges végen J(c) CP capping gyorsabb növekedés a nem sapkázott szöges végeken ADP ATP 0 C cb c ss T D C ss(cp) = C cp

24 AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: profilin növekedés a szöges végen Pi depolimerizáció a hegyes végen J(c) ADP ATP C cb T D 0 [G-aktin] C ss C cp növekedés a szöges végen gyorsabb ADP-ATP csere ADP ATP T D profilin gátolt a hegyes végen való beépülés gátolt a spontán nukleáció

25 AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: összefoglalás capping - polimerizáció CP depolimerizáció ADP ATP T D profilin ADF thymosin b4 szekvesztráció 1. spontán nukleáció 2. nukleációs faktor által katalizált nukleáció

26 AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: összefoglalás capping - polimerizáció CP depolimerizáció T ~ 90 x ADP ATP D profilin ADF thymosin b4 Filamentum turnover szekvesztráció in vitro 1 mm / 30 min in vivo 1 mm / 20 s 1. spontán nukleáció 2. nukleációs faktor által katalizált nukleáció

27 Aktin polimer mennyisége AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 1. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK Az aktin filamentumok képződésének sebessége: df dt df dt k Nc k N szöges hegyes szöges ( k k ) Nc ( k k hegyes ) N Hogyan növelhető a polimrizáció sebessége? N: filamentum végek koncentrációja k + : asszociációs sebességi állandó Idő, min

28 pirén fluoreszcencia, a.u. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK ÖSSZEFOGLALÁS pirén fluoreszcencia, a.u. Arp2/3 komplex formin 2.5 mm aktin nm GST-VCA + 50 nm Arp2/3 2.5 mm aktin + 25 nm mdia1 FH1-FH2 1,0 1,0 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0, idõ, s 0, idő, s N: filamentum végek koncentrációja N: filamentum végek koncentrációja k+: asszociációs sebességi állandó