A DAAM formin alcsalád szerepe az izomfejlődésben. Ph.D. értekezés

Átírás

1 A DAAM formin alcsalád szerepe az izomfejlődésben Ph.D. értekezés Készítette: Molnár Imre Témavezető: Dr. Mihály József Biológia Doktori Iskola MTA Szegedi Biológiai Kutatóközpont Genetikai Intézet SZTE Természettudományi és Informatikai Kar Szeged, 2014.

2 Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS A harántcsíkolt izom általános felépítése Izomfejlődés és szarkomer összeszerelődés Szarkomer összeszerelődési modellek A miofilamentumok összeszerelődése A vastag (miozin) filamentumok kialakulása Az aktin filamentumok összeszerelődése Aktin összeszerelődés és filamentumhossz szabályozás a harántcsíkolt izmokban A DAAM formin alcsalád CÉLKITŰZÉSEK EREDMÉNYEK A ddaam mutáns izmok fenotípusa és élettani jellemzése Az indirekt repülőizom szerkezete és fejlődése A ddaam-nak az izomfejlődésben betöltött szerepét vizsgáló kísérletek előzményei A ddaam mutáció befolyásolja a röpképességet és az indirekt repülőizom fejlődését Atomerő-mikroszkópiás mérések az indirekt repülőizom miofibrillumain A ddaam hatással van a lárvális szomatikus izmok és a szívcső fejlődésére A ddaam hiányos miofibrillumok vizsgálata A ddaam hiányos IFM szarkomerikus fenotípusa A ddaam mutánsok elektronmikroszópos (EM) analízise A ddaam fehérje szarkomerikus lokalizációja A ddaam fehérje kölcsönhat a vékony filamentum mutánsokkal A ddaam fehérje szükséges a vékony filamentumok növekedéséhez Evolúciós konzerváltság A ddaam és a miozin közötti kölcsönhatás AZ EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Felhasznált Drosophila törzsek Immunhisztokémia Felhasznált elsődleges ellenanyagok Felhasznált másodlagos ellenanyagok

3 Felhasznált egyéb reagensek Lárvális testhossz és mászási sebesség mérések Repülési teszt Sejtkultúrák és egér izom preparátumok előkészítése Elektronmikroszkópos analízis Atomerő-mikroszkópos mérések Western-blot Az aktin filamentumok vég-vég kapcsolódásának vizsgálata Statisztikai analízis FONTOSABB RÖVIDÍTÉSEK ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY IRODALOMJEGYZÉK

4 1. BEVEZETÉS 1.1. A harántcsíkolt izom általános felépítése A harántcsíkolt izomban három fő szerveződési szintet lehet megkülönböztetni: az izomrostok, a miofibrillumok, és a miofilamentumok szintjét. Az izomrostok a mioblasztok összeolvadásából létrejött úgynevezett szincíciumok. Citoplazmájuk nagy részét a kontraktilis állomány tölti ki, ami több száztól több ezerig terjedő párhuzamosan futó miofibrillumból áll. 1. ábra A harántcsíkolt izom felépítése. A harántcsíkolt izom fő szerveződési szintjei: az izomrostok, a miofibrillumok, és a miofilamentumok szintje. A két Z- korong közé eső rész a szarkomer, az izom szerkezeti és működési egysége. Forrás: Eckert, Animal Physiology A miofibrillumok harántcsíkolt mintázata a szarkomerikus fehérjék rendkívül szabályos elhelyezkedésének tulajdonítható; fénymikroszkópos szerkezetük alapján osztották fel őket A- és I- sávokra. Az elnevezés onnan ered, hogy ha mikroszkópban az izmot polarizált fénnyel világították meg, akkor az I az izotróp, világos, míg az A az anizotróp, sötét sávnak mutatkozott. Elektronmikroszkóppal 3

5 tovább vizsgálva, a világos I-sávok közepén sötét vonalak formájában található a Z-korong (az izom hisztológiában alkalmazott elnevezés szerint a Z a német Zwischenscheibe - az I-sávok közötti korong - elnevezésre utal). Míg az anizotróp, sötét sáv közepén egy újabb világos H-sáv (a német Helle világos - elnevezés után), és az M-vonal (a német Mittel közép - elnevezés itt a szarkomer közepére utal), található (1. ábra). A miofibrillumok miofilamentumok kötegeiből állnak, amelyeket a szarkoplazmás retikulum ciszternái, mitokondriumok és glikogénszemcsék vesznek körül. A miofilamentumokat magasan szerveződött makromolekuláris komplexek alkotják, amelyek fő alkotóelemei a miozin II-t tartalmazó vastag filamentumok, és az aktint tartalmazó vékony filamentumok. Az A-sávnak megfelelő részt foglalják el a vastag filamentumok, míg az I-sáv adja azt a régiót, ahol a vékony filamentumok nem fednek át a vastag filamentumokkal. A két Z-korong közé eső rész a szarkomer, az izom szerkezeti és működési egysége. A szarkomer közepén az M-vonal fehérjék keresztkötik és kihorgonyozzák egymáshoz a vastag filamentumokat (1. ábra, 2. ábra). 2. ábra A szarkomer szerkezete. Az ábrán nagyobb felbontásban látható az előbbi képen ábrázolt szarkomer. Az ellentétes polaritású vékony filamentumokat az α-aktinin keresztköti és rögzíti a Z-korongok mindkét oldalához. A vékony filamentumok F-aktinból és a hozzájuk kapcsolódó Tropomiozin-Troponin komplexből állnak. Gerincesek esetében a vékony filamentumok Nebulint is tartalmaznak, amely a filamentumok hosszát szabályozza. A vékony filamentumok plusz végét a CAPZ míg mínusz végét a Tropomodulin fehérje zárja le. A ZASP fehérje a Z- korongok szerveződésében játszik szerepet. A vastag filamentumokat az M-vonal fehérjék rögzítik. A gerincesekben a Titin molekulák az M-vonaltól a Z-korongokig terjednek. A vastag filamentumokat rögzítik, és elasztikus rendszert alkotva megakadályozzák a miofilamentumok túlzott megnyúlását. Forrás: Sparrow és Schöck

6 A vastag filamentum néhány száz miozin II molekulát tartalmaz antiparallel elrendezésben, vagyis az ellentétes irányú miozin molekulák farki részei a Miomezin fehérje segítségével összekapcsolódnak. A miozin molekula két motorikus nehéz láncból (MHC) áll, végükön található a fej -régió. Ily módon bipoláris szerkezetet vesznek fel, amelyben a fejek oldalirányban állnak. A fejhez két pár (fajspecifikus) könnyű lánc (MLC) kapcsolódik. A könnyű lánc párok közül az egyik mindig az eszenciális könnyű lánc (ELC), a másik a regulációs könnyű lánc (RLC). A vékony filamentumokat a globuláris szerkezetű aktin monomerek (G-aktin) polimerizálódásával keletkező kettős hélix szerkezetű filamentáris aktin (F-aktin) (Chesarone and Goode, 2009) és a Tropomiozin-Troponin komplex alkotja. Az F-aktin hélixhez kapcsolódnak a Tropomiozin dimerek, melyek szintén helikális szerkezetet vesznek fel, a ~ 38 nm hosszú hélixük hét aktin monomernyi távolságon ível keresztül. A dimerek végei szorosan egymáshoz kapcsolódnak, így a Tropomiozin ív az aktin filamentum mentén folyamatos. A Tropomiozin molekulákon keresztül kötődik az aktin filamentumokhoz a három alegységből álló Troponin komplex. Ezekből a Troponin-T alegység (TnT) a Tropomiozinhoz kötődik, a Troponin-C (TnC) kalcium-ionokat köt, végül a Troponin-I (Tn-I) az aktin-miozin kapcsolódást gátolja (Au 2004; Gunning 2008) (3. ábra). A vékony filamentumok párhuzamos sorokba rendezve rögzülnek a Z-korongokhoz, amit az α-aktinin fehérje keresztkötő aktivitása biztosít. Gerincesekben a harántcsíkolt izmok vékony filamentumai még egy járulékos fehérjét tartalmaznak, a Nebulint. Ez egy hosszú, fonál-alakú, rugalmatlan fehérje, amely az aktinfilamentumokkal párhuzamos lefutású, azokat a Z-korongokhoz rögzíti, és valószínűleg részt vesz a vékony filamentumok hosszának szabályozásában (Bang és mtsai. 2006; Witt és mtsai 2006). 5

7 3. ábra A vékony filamentumok szerkezete. Az F-aktin hélixhez kapcsolódnak a Tropomiozin dimerek. Mivel a dimerek végei szorosan egymáshoz kapcsolódnak, így a Tropomiozin ív az aktin filamentum mentén folyamatos. Ezen a Tropomiozin íven keresztül pedig a három alegységből álló Troponin komplex kötődik az aktin filamentumokhoz. Forrás: Alberts és mtsai A miofibrilláris vastag és vékony filamentumok egymáshoz viszonyított szarkomerikus helyzete szigorúan szabályozott. Rovarok repülőizmaiban például egy-egy miozin filamentumot hat vékony filamentum vesz körül hexagonális elrendezésben. A vastag filamentumok miozin II fehérjéinek globuláris feji része képes a vékony filamentumok F-aktinjához kötődni, ami az izomösszehúzódás alapjául szolgál, hiszen az aktomiozin kölcsönhatás eredményeként az egymáson elcsúszó két filamentum rendszer a szarkomerek megrövidülését okozza (Lymn és Taylor 1971). Az aktin és miozin fehérjék kapcsolódását, tehát végső soron az izomösszehúzódást, a Tropomiozin-Troponin komplex szabályozza. A vékony és vastag filamentumok mellett a miofibrillumok harmadik fő filamentum rendszerét a Titin filamentumok alkotják. A Titin óriásmolekula a Z-korongtól az M-vonalig terjed és ily módon egymáshoz rögzíti a szarkomer széli és központi szerkezeti elemeit. A Titin filamentumok egy masszív elasztikus rendszert alkotnak, aminek az a legfontosabb szerepe, hogy megakadályozza a miofilamentumok túlzott megnyúlását (2. ábra) (Clark és mtsai. 2002) Izomfejlődés és szarkomer összeszerelődés Az izomfejlődés egy többlépéses folyamat, amely bizonyos sejteknek izom prekurzor sejtekké vagy mioblasztokká válásával kezdődik. A paraxiális myotomban és a dermomyotomban bizonyos mioblaszt őssejtekben a pax-3 gén kezd aktiválódni és magas szinten kifejeződni, amit a miogenezis szabályozó gének, a bhlh (basic helix-loop-helix) 6

8 fehérjecsaládba tartozó transzkripciós faktorok expressziója követ (Brand-Saberi 2005). A bhlh faktorokat termelő sejtek már mioblasztok, melyek az izomszövetté differenciálódás irányába indultak. Ezek egy aktív osztódási fázison mennek keresztül, ahol a számuk megsokszorozódik. Ezt követően vándorolnak és sorokba rendeződnek, majd fuzionálva többsejtmagvú, szincíciális miotubulusokokat hoznak létre vagy közvetlenül kardiomiocitákká differenciálódnak. Ezután az extracelluláris mátrixhoz (ECM) vagy más izomsejtekhez kapcsolódnak mielőtt miofibrillumokat képeznének. A miofibrillogenezis kezdeti szakaszában egy szarkomerekből álló sor jön létre. Ezek a szarkomerek később szélességükben, bizonyos izmokban hosszúságukban is növekednek, és szorosan kapcsolódnak egymáshoz, vagy esetenként a szarkolemmához. A képződő miofibrillumok fokozatosan kitöltik a sejt belsejét, egymáshoz és a miocita sejtorganellumokhoz Dezmin gazdag intermedier filamentumokon keresztül kapcsolódnak addig, amíg az összes rendelkezésre álló helyet el nem foglalják, csak keskeny részeket hagyva a szarkoplazmatikus retikulum, a mitokondriumok és a sejtmagok számára. További mioblasztok egyesülnek a miotubulusok növekvő végeivel addig, amíg a soksejtmagvú szincícium egy érett, teljesen differenciálódott izomrosttá nem válik (Sanger és mtsai. 2010), amelyben felnőtt miozin izoformák helyettesítik az embrionális, korai izoformákat (Rosser és mtsai. 1998; Agbulut és mtsai. 2003). Az izomrostok végei a vázrendszerhez az izom-ín átmeneten keresztül csatlakoznak, vagy a szívizom esetében egy hálózatos membránrendszeren (intercalated discs) keresztül kapcsolódnak szorosan egymáshoz. A heterodimerikus Integrinek, amelyek a vékony filamentumokat az ECM-hez kapcsolják, a fő strukturális és funkcionális komponensei az izomín átmeneteknek. A periferiális miofibrillumok a Z-korongok szintjén oldalirányban is ki vannak 7

9 horgonyozva az ECM-hez, a gerincesekben és a gerinctelenekben egyaránt (Moerman és Williams 2006; Hudson és mtsai. 2008; Pardo és mtsai. 1983) (4. ábra). 4. ábra A harántcsíkolt izomrost vázlatos áttekintése. Egy harántcsíkolt izomrost szagittális metszeti képe, amely két miofibrillumot, a közöttük levő kapcsolódást és a szarkolemmát ábrázolja. Csak a fő szarkomerikus alkotóelemek az aktin, a miozin és a Titin lettek feltüntetve. A gerincesek esetében, a miofibrillumok egymáshoz és a kosztamerekhez intermedier filamentum fehérjék (világoskékkel jelölve) és más citoszkeletális fehérjék (sárga körökkel jelölve) segítségével kötődnek. Az izom-ín átmenetek szintjén, a transzmembrán Integrinek a miofibrillumokat adapter fehérjéken (zöld oválisokkal jelölve) keresztül rögzítik az ín mátrixhoz (narancs oválisokkal jelölve). A kosztamerek a Z-korongokat kapcsolják a környező kötőszövethez vagy más miofibrillumokhoz. Forrás: Sparrow és Schöck Ezeket az adhéziós helyeket nevezik kosztamereknek, és ezek az izom-ín átmenetekhez hasonlóan egy sor olyan alkotóelemből állnak, mint a fokális adhéziók a nem-izom sejtek esetében (Pardo és mtsai. 1983; Ervasti és mtsai.2003; Quach és mtsai. 2006) (4. ábra) Szarkomer összeszerelődési modellek Az izom differenciációt érintő fontos kérdés, hogy a harántcsíkolt izomsejt hogyan képes egy ilyen szabályosan ismétlődő, szigorúan rendezett szarkomerekből álló szerkezetet létrehozni a miofibrillogenezis során, más szóval, hogyan zajlik a szarkomer összeszerelődés? Ezzel kapcsolatban többféle elképzelés létezik, a legfontosabbak közülük: a független összeszerelődési-, a titin mint szarkomerikus váz - és a premiofibrillum modell. Az alábbiakban 8

10 ezeket foglalom röviden össze, szem előtt tartva azt a tényt, hogy az itt felsorolt elképzelések a különböző modellszervezetek vad típusú és mutáns szarkomerikus struktúráinak megfigyelése alapján születtek, és ha a szarkomerogenezis folyamatának egészét tekintjük, a felsorolt modelleknek nem feltétlenül kell kizárniuk egymást. A független összeszerelődési modell alapja, hogy a miofibrillogenezis kezdeti lépései során bipoláris miozin filamentumok és úgynevezett I-Z-I komplexek szerelődnek össze egymástól függetlenül (Holtzer és mtsai. 1997), amelyek aztán később integrálódnak a jól ismert szarkomerikus szerkezetekbe. Az I-Z-I komplexek ellentétes irányítottságú vékony filamentumokból és az azokat egyesítő Z-korong kezdeményből álló struktúrák, amelyek elektronmikroszkópos felvételeken sűrű α-aktinin nyalábokként jelennek meg, amelyekből aktin filamentumok ágaznak szét. A fő megfigyelés, ami ezt az elméletet alátámasztja az, hogy aktin hiányában a szarkoplazmában szabadon sodródó A-sáv struktúrák láthatók, míg a miozin hiányos izmokban vékony filamentumokkal összekapcsolódott szabálytalan szerveződésű Z-korongok találhatók (Holtzer és mtsai. 1997; Lin és mtsai. 1994) (5. ábra). 5. ábra A független szarkomer összeszerelődési modell. A szarkomerek kialakulását megelőzően, a különböző komplexek, az Integrineket, a feszültség szenzorokat, az I-Z-I komplexeket, a vastag filamentumokat és a Tropomiozin-Troponin komplexeket is beleértve, egymástól függetlenül szerelődnek össze. Ezt követően az Integrin fehérjékkel kölcsönhatva hozzák létre a szigorúan rendezett szarkomer szerkezetet. Ezen komplexek bármelyikének az eltávolítása az egész szerkezet összeomlását vonja maga után. Forrás: Rui és mtsai

11 A Titin mint szarkomerikus váz modell azon alapszik, hogy a szarkomer összeszerelődés vázát a Titin óriásmolekula adja. Mivel ismert, hogy az aktin és a Titin filamentumok már jóval a vastag filamentumok kialakulása előtt megjelennek, felmerült az a lehetőség, hogy az M-vonal és a Z-korongok egymáshoz viszonyított végső távolsága a Titin óriásmolekulától függ, amely szarkomerikus vázként is szolgálhat a két másik miofilamentum rendszer számára. Az óriás fehérjelánc növekedése során képződő új fehérje domének további vastag filamentum és M-vonal alkotóelemeket gyűjtenek maguk köré, és ahogy a Titin fehérje kialakítja végső konformációját, a C-terminális régiója mellett az M-vonal végső struktúrája is létrejön (Ehler és Gautel 2008). A Titin fehérje C-terminális irányból csonkolt formáinak az összehasonlításából az derült ki, hogy a csonkolás mértékével arányosan károsodik a vastag filamentumok és a szarkomerek szerveződése (Miller és mtsai 2003). A miofibrillum képződésre vonatkozó elképzelések harmadik csoportját a premiofibrillum alapú modell alkotja. Ez a differenciálódó csirke kardiomiocita sejttenyészetek tanulmányozásán alapuló modell azt javasolja, hogy a miofibrillogenezis során először de novo módon úgynevezett premiofibrillumok képződnek a sejthártya közelében (Heuson-Stiennon 1965; Kelly 1969), amelyek főként aktinból és aktin asszociált fehérjékből (Tropomiozin/Troponin komplex, -aktinin), illetve nem-izom miozinokból (NMM) állnak. A premiofibrillumok aktin stressz-filamentumokra emlékeztető struktúrák, amelyek szabálytalan periodicitású -aktinin és nem-izom miozin felhalmozódást mutatnak. Később ezekből lesznek az érett miofibrillumok, ahol az érés során a nem-izom miozin izom típusú miozinnal helyettesítődik (Rhee és mtsai. 1994; LoRusso és mtsai. 1997) (6. ábra). 10

12 6. ábra A premiofibrillum modell. A protokosztamerek, amelyek az izomsejt mentén véletlenszerűen helyezkednek el, aktin filamentumokat polimerizálnak (1-2. lépés) (Az egyszerűség kedvéért adhéziós helyenként csak két aktin filamentum van ábrázolva). Az ellentétes polaritású és egymással átfedő aktin filamentumokat az α- aktinin keresztköti (3. lépés). Az oldalirányból fuzionált antiparallel aktin filamentumok nem-izom miozin II-t építenek be, amely kiszorítja az α-aktinint (4. lépés). A nem-izom miozin II bipoláris filamentumok száma a stresszrostokban levő aktin filamentumok számától függ. A protokosztamerek Titint és még több α-aktinint gyűjtenek maguk köré, aminek eredményeként kialakulnak a Z-testek (5. lépés). A következőkben az izom típusú miozin II beépülése történik meg, valószínűleg a Titin segítségével (6. lépés). A kontraktilitás-függő érési folyamat során a Z-testek hosszanti irányban egymáshoz igazodnak (7. lépés). Ezek után a Z-testek oldalirányban Z- korongokká egyesülnek (8. lépés). Forrás: Sparrow és Schöck

13 Ez a modell összhangban van azokkal az elektronmikroszkópos vizsgálatokkal, amelyek során megfigyelték, hogy a Z-korongok először mint kisméretű membrán asszociált aggregátumok jelennek meg. Ezek a már említett, Z-testeknek nevezett kezdemények később növekedésnek indulnak, oldalirányban fuzionálnak egymással, így alakítva ki az érett Z- korongokat (Heuson-Stiennon 1965). Immunofluoreszcens és elektronmikroszkópos felvételek azt mutatták, hogy a Z-testek, az α-aktinin és a Titin (a két legkorábbi Z-korong marker) felhalmozódásának helyei, ezzel bizonyítva, hogy a Z-testek valóban a Z-korongok elődjeinek tekinthetők (Tokuyasu 1989). Összességében a jelenleg ismert kísérleti adatok fényében a premiofibrillum elmélet a legáltalánosabban elfogadott nézet a miofibrillumok összeszerelődésére A miofilamentumok összeszerelődése Az eddig összefoglaltak alapján nyilvánvalónak látszik, hogy a miofibrillogenezis sok lépésből álló, bonyolult folyamat, mindamellett ennek a folyamatnak kitüntetett része a miozin és aktin filamentumok összeszerelődése. Jól ismert, hogy in vitro körülmények között mind a miozin, mind az aktin képes polimerizálódni és olyan filamentáris struktúrákat létrehozni, amelyek hasonlóak a vastag filamentumokhoz (Niederman és Pollard 1975) és a vékony filamentumok F-aktinjához (Cooper és mtsai. 1983). Azt is tudjuk azonban, hogy in vivo körülmények között ezek a folyamatok szigorúan szabályozottan zajlanak és -főként az aktin esetében- számos járulékos fehérje részvételével történnek. Az alábbi fejezetekben a miofilamentumok, különösen az aktin filamentumok kialakulására vonatkozó ismereteket foglalom össze. 12

14 A vastag (miozin) filamentumok kialakulása A nem-izom miozin II-ről tudjuk, hogy képes önállóan összeszerelődni rövid bipoláris minifilamentumokba, amelyek a kortikális sejtvázban és a stressz-rostokban fordulnak elő (Scholey és mtsai. 1980). Ezzel a spontán összeszerelődési képességgel valószínűleg az izom miozin II is rendelkezik, legalábbis mind ez idáig nem azonosítottak olyan fehérjét, ami specifikusan elősegítené a miozin molekulák polimerizációját. Viszont nemrég kimutatták, hogy az izom típusú miozin II globuláris fej régiójának feltekeredéséhez (foldingjához), illetve a magasabb szervezettségű szarkomerikus vastag filamentumok összeszerelődéséhez nélkülözhetetlenek az izom specifikus molekuláris chaperonok (Kim és mtsai. 2008; Chow és mtsai. 2002). A miozin II nem képes a motorfehérje funkcióját megtartani, ha in vitro körülmények között vagy bakteriális rendszerekben expresszáltatják (Chow és mtsai. 2002; Levitsky és mtsai. 1990), ami a chaperonok segítségével megvalósuló fehérje folding fontosságát bizonyítja. Ebben az összefüggésben chaperon -nak tekintünk minden olyan faktort, amely közvetlenül érintett a fehérje folding és stabilitás megteremtésében, függetlenül a fehérje aggregációt megelőző szerepétől. A miozin II megfelelő foldingját olyan hősokk fehérjék végzik, mint a Hsp90, a Hsp70, és az Unc45 (Liu és mtsai. 2008b; Srikakulam és Winkelmann 2004; Willis és mtsai. 2009). Gerincesekben a Hsp90 fehérjecsaládnak két izoformája ismeretes (a Hsp90a1 és a Hsp90a2), amelyek a vastag filamentumok megfelelő kialakulásához szükségesek. Ezek a chaperonok specifikusan a fejlődő szív és vázizomzatban fejeződnek ki (Krone és mtsai. 2003; Etard és mtsai. 2007), míg más izoformák expressziója sokkal általánosabb jellegű (Thisse és mtsai. 2004). Habár az izom specifikus chaperonok lokalizációja az érett miofibrillumokban a Z-korongok szintjére korlátozódik, izom károsodás során áthelyeződnek az A-sávba, oda ahol az újból keletkező miozin filamentumok összeszerelődése történik (Etard és mtsai. 2008). Az ezeket 13

15 a chaperonokat kódoló gének mutációi gyakran társulnak különböző izomszintű megbetegedésekkel, miopátiákkal (Vogel és mtsai. 2009), ami arra utal, hogy a citoszkeletális váz épsége elengedhetetlen a funkcionális miozin motorfehérjék későbbi összeszerelődéséhez Az aktin filamentumok összeszerelődése Az F-aktint felépítő aktin monomerek eredendő polaritásából adódóan az aktin filamentumok szerkezetileg polarizáltak (7. ábra). In vitro körülmények között, kellően magas aktin monomer koncentráció mellett a G-aktinból spontán polimerizációval F-aktin képződik. Az így kialakuló filamentumok mindkét végén történhet monomer addíció és disszociáció is, azonban az úgynevezett szöges (plusz) végen kb. 7-8-szor nagyobb az addíció sebessége, mint a hegyes (mínusz) végen. 7. ábra Az aktin filamentumok taposómalom modellje. Az (A) panelen látható a monomer aszimmetrikus, polarizált szerkezete, aminek következtében a filamentumok is szerkezetileg polarizáltak. (B) Ez a sematikus modell szemlélteti, hogy az aktin filamentumnak ebben az egyensúlyi állapotában az alegységek beépülési aránya a plusz végen megegyezik a mínusz végen zajló depolimerizáció arányával. Ennek következtében a polimer képes egy állandó hossz megtartására, annak ellenére, hogy az őt felépítő alegységek állandó áramlásban vannak. Forrás: Alberts és mtsai In vivo körülmények között egy még nyilvánvalóbb kinetikai polarizáltság jellemző az aktin filamentumokra, amit az úgynevezett taposómalom (treadmilling) modellel jellemeznek. Ennek az a lényege, hogy sejtekben monomer addíció kizárólag a filamentumok plusz végén történik, míg a hegyes vég a monomerek disszociációjának, a filamentum depolimerizálódásának 14

16 a helye (7. ábra). Az aktin filamentumok kialakulásának kritikus első lépése az aktin nukleáció, amelynek során néhány aktin monomer egyesül, hogy egy nukleációs magot, azaz egy olyan 3-4 monomerből álló filamentum kezdeményt hozzon létre, amely kiindulópontként szolgálhat a további polimerizáció számára. In vitro körülmények között a nukleációs magok kialakulását a magas G-aktin koncentráció biztosíthatja, a nukleációhoz szükséges koncentrációt kritikus koncentrációnak nevezzük. In vivo körülmények között azonban a szabad G-aktin koncentráció alacsonyabb, mint a kritikus koncentráció, ezért a spontán nukleáció kinetikailag gátolt és így a sejtek elkerülik az anarchikus filamentum képződést. Annak érdekében, hogy az aktin filamentumok képződése térben és időben szabályozott módon történjen, olyan fehérjék vannak jelen a sejtekben, amelyek képesek közvetlen módon elősegíteni az aktin nukleációs magok kialakulását. Ezeket a fehérjéket összefoglalóan aktin nukleációs vagy aktin összeszerelő faktoroknak nevezzük. Amennyiben egy nukleációs mag már kialakult, a filamentum növekedése in vivo is kinetikailag előnyössé válik, ám ilyenkor nem G-aktin, hanem annak ATP-vel és egy aktin momomer-kötő fehérjével, a Profilinnel alkotott komplexe épül be a növekvő filamentum plusz végén. Irodalmi adatok alapján az eddig azonosított aktin nukleációs faktorokat molekuláris működésmódjuk alapján három csoportba sorolhatjuk (Chesarone és Goode 2009). Az első csoport tagjai nukleációs magok strukturális imitálásával, a második csoport tagjai aktin monomerek megkötésével és nukleációs maggá való alakításával, végül a harmadik csoport tagjai a spontán kialakult polimerizációs intermedierek stabilizálásával hozzák létre a nukleációs magot. A három nagy csoportba viszonylag kisszámú fehérje tartozik: az Arp2/3 komplex az első, a WASP-Homológia 2 (WH2) domént tartalmazó fehérjék a második, míg a forminok a harmadik csoport tagjait alkotják (8. ábra A). Megjegyzendő, hogy a forminok nem csak 15

17 nukleációs faktorként működnek, hanem a növekvő filamentumok plusz végéhez kötődve elősegítik további aktin monomerek beépítését is, tehát elongációs szerepük is van (Pollard 2007; Goode és Eck 2007; Higgs 2005). Jelenlegi ismereteink szerint az Ena/Vasp fehérjék is elongációs faktorokként szerepelnek (Haffner és mtsai. 1995; Ahern-Djamali és mtsai. 1999) (8. ábra B). 8. ábra Aktin nukleációs és elongációs faktorok. Az (A) panelen az említett három nukleációs faktor feltételezett működési mechanizmusa látható. A nukleációban szerepet játszó domének különböző színekkel, azok az aktin alegységek, amelyek nukleációs magként szolgálnak, pedig feketével jelöltek. (B) A forminok és az Ena/Vasp fehérjecsalád befolyásolják az aktin filamentumok elongációját. Az Ena/VASP fehérjecsalád működésmódja még nem teljesen ismert. Forrás: Chesarone és Goode

18 Az Arp2/3 komplex szerkezete és működése Elsőként az Arp 2/3 (Actin-related protein) típusú fehérjék nukleációs aktivitását mutatták ki (Goley és Welch 2006). Ez egy 220 kda-os fehérje komplex, amely hét, eukarióta szervezetekben magasan konzervált polipeptidláncból áll. Az Arp2 és Arp3 mellett ide tartoznak az ARPC1-ARPC5 alegységek is. Ez a komplex elágazó aktin filamentumokat alakít ki azáltal, hogy egy meglévő filamentum oldalához kapcsolódik, és ott egy újabb filamentum képződését indítja el, amely a kiindulási filamentummal 70 -os szöget fog bezárni. Az Arp2/3 komplex önmagában inaktív, aktiválódásához szükség van az Arp2 alegység treonin és tirozin aminosavainak a foszforilálására (LeClaire és mtsai. 2008) és bizonyos nukleációt elősegítő fehérjékkel (NPFs, Nucleation Promoting Factors) való kölcsönhatásra. A legtöbbet tanulmányozott NPF-ek a WASP/SCAR/WAVE és Cortactin fehérjecsaládokba tartozó fehérjék. Ezek a faktorok olyan konformációs változásokat idéznek elő az Arp2/3 komplexben, amelyek az Arp2 és Arp3 alegységeket közelebb hozzák egymáshoz, így imitálva egy aktin dimer szerkezetét. Emellett, az NPF-ek a WH2 doménjeiken keresztül egy vagy két aktin monomert is megkötnek, ami kulcsfontosságú a nukleáció szempontjából, mivel az Arp2/3 komplex önmagában csak nagyon gyengén képes monomereket kötni. Ennek az utóbbi monomernek a bekötődésével létrejön egy olyan trimer, amely a nukleációs magok struktúrájához hasonlít, így elindulhat az aktin polimerizáció (Blanchoin és mtsai. 2000) (8. ábra A) WH2 domén tartalmú aktin nukleációs faktorok Ebbe a csoportba olyan fehérjék tartoznak, amelyek aktin monomereket kötnek meg, majd ezekből nukleációs magokat alakítanak ki. Ezek a fehérjék tandem ismétlődésként három vagy több G-aktin kötő domént tartalmaznak, amely a legtöbb esetben WH2 domént jelent, innen 17

19 a család elnevezése. A Spire, Cordon-bleu (Cobl), és Leiomodin (Lmod) fehérjecsaládok tartoznak ide, valamint néhány bakteriális nukleációs faktor (Qualmann és Kessels 2009) (8. ábra A). A WH2 domének jelenléte miatt ezek a fehérjék evolúciós rokonságban állnak a fent említett NPF-ekkel (Dominguez 2009), habár ezek a nukleációs faktorok nem kötődnek az Arp2/3 komplexhez, és az Arp2/3 komplexszel ellentétben ezek a faktorok nem elágazó aktin filamentumok képződését katalizálják. A csoportból elsőként a Spire-t azonosították, mint a Drosophila peték és az embriók fejlődéséhez szükséges faktort (Manseau és Schüpbach 1989), később az aktin nukleációs képességét is kimutatták (Quinlan és mtsai. 2005). Az aktin polimerizációért felelős szekvencia négy tandem ismétlődő WH2 doménből és egy járulékos aktin monomer kötő linkerből áll (8. ábra A). Fontos megjegyezni, hogy az aktin összeszerelődés során a Spire együttműködik a forminokkal, ahogy ezt a Drosophila Spire és Capuccino fizikai kölcsönhatása bizonyította (Rosales-Nieves és mtsai. 2006). Végül, a Spire részt vesz a mikrotubulusok kötegelésében is, ami által közvetítő szerepet tölt be az aktin és a mikrotubulus rendszer közötti kölcsönhatásban (Quinlan és mtsai. 2007). A Cobl fehérjét élesztő két-hibrid módszerrel azonosították patkány agyi extraktumból, ahol az ABP1-gyel (Actin-Binding Protein 1) és a Syndapin-nal mutatott kölcsönhatást. A Cobl eggyel kevesebb WH2 doménnel rendelkezik, mint a Spire. A polimerizáció létrejöttéhez mindhárom WH2 doménjére szükség van, annak ellenére, hogy a harmadik WH2 domén G-aktin iránti affinitása tízszer alacsonyabb, mint az első kettőé. Érdekes módon, az utolsó két WH2 domént összekötő linker hosszúsága szintén fontos az aktin összeszerelődés szempontjából. Ez arra enged következtetni, hogy az egymáshoz közeli helyzetű WH2 domének egy aktin dimert 18

20 hoznak létre, míg a távolabb eső WH2 domén egy harmadik monomerrel lép kölcsönhatásba, így hozva létre egy olyan trimer konfigurációt, amely elősegíti a polimerizációt (8. ábra A). A WH2 csoport harmadik tagja, a Leiomodin fehérje szívizom szövetben található. Az Lmod egyetlen WH2 domént, és két másik típusú, a Tropomodulin (Tmod) fehérjében szintén előforduló aktin kötő domént tartalmaz (Chereau és mtsai. 2008). Az Lmod ezeknek az aktin kötő doméneknek a segítségével hozza létre a 3 monomerből álló nukleációs magot, amelyet a Tmod-hoz hasonlóan valószínűleg a mínusz vég felől stabilizál (8. ábra A). Említésre méltó, hogy in vitro körülmények között a Tropomiozin serkentette az Lmod nukleációs aktivitását, akárcsak a forminok esetében (Wawro és mtsai. 2007) A forminok A Formin-1-et először 1990-ben egérben azonosították, az elnevezés a limb deformity (ld) mutáció nevéből ered. Ez a mutáció homozigóta formában súlyos végtagfejlődési rendellenességeket eredményezett (Woychik és mtsai. 1990). Későbbi kísérletekben kimutatták, hogy az ld mutánsokra jellemző végtagfejlődési defektusok tulajdonképpen a szomszédos gremlin nevű gén mutációjához köthetők (Zuniga 2004). Ennek ellenére az ld gén időközben és később azonosított homológjaira a tudományos közösség megtartotta a formin elnevezést, mert bebizonyosodott, hogy ennek a fehérjecsaládnak a tagjai kulcsfontosságú szerepet játszanak számos sejten belüli aktin struktúra létrehozásában. Későbbi kísérletekben kimutatták, hogy a forminok jelen vannak az összes eukarióta szervezetben, ahol nagyszámú sejten belüli folyamat szabályozásában vesznek részt, beleértve a sejtpolarizáció, adhézió, osztódás és a sejtmozgás jelenségeit is (Evangelista és mtsai. 2003; Wallar és Alberts 2003). Az eukarióta szervezetek több formin gént tartalmaznak: a gombafajok 2 vagy 3, a Drosophila 6, az emlősök 15, néhány 19

21 növényfaj pedig több mint 20 formin génnel rendelkezik (Higgs 2005; Grunt és mtsai. 2008; Chalkia és mtsai. 2008). A forminok nagyméretű ( kda) fehérjék, számos konzervált domént tartalmaznak, melyeken keresztül sokféle fehérjével hatnak kölcsön. Akárcsak a WH2 domén tartalmú aktin nukleációs faktorok a forminok is az el nem ágazó (hosszanti lefutású) aktin struktúrák kialakulását katalizálják, közvetlenül nukleálva az aktin filamentumokat (Evangelista és mtsai. 1997; Pruyne és mtsai. 2002; Sagot és mtsai. 2002). Minden formin fehérje legjellemzőbb doménje az FH2 (formin homológia 2) domén, amely az aktin filamentumok összeszerelődésében játszik szerepet. Az FH2 domének aminosav szekvenciájának elemzése alapján a metazoák formin génjeit hét alosztályba sorolták: Diaphanous (Dia); leukocitában azonosított formin-szerű fehérjék (formin-related proteins identified in leukocytes, FRLs); DAAM (Disheveled-associated activators of morphogenesis); formin homológia domént tartalmazó fehérjék (formin homology domain-containing proteins, FHOD); forminok (FMN); Delphilin; fordított forminok (inverted formins, INFs) (Higgs és Peterson 2005) (9. ábra A). A legjobban tanulmányozottak ezek közül a Diaphanous-szerű forminok (DRFs), ide tartoznak a Dia, a DAAM és az FRL forminok. Ezek szerkezeti szempontból két fő funkcionális régióra oszthatók: az N-terminális szabályozó régióra (amelynek a fehérje in vivo lokalizációjában van szerepe, és befolyásolni képes a C-terminális rész működését) és a C- terminális aktív régióra (amely elősegíti az aktin filamentum összeszerelődést, és bizonyos forminokban mikrotubulusokkal is kölcsönhat). A forminok N-terminális régiójában a GTP-áz kötő (GBD) és a Diaphanous inhibíciós (DID) domének után egy dimerizációs domén (DD) és a központi helyzetű coiled-coil domén (CC) következik. A DD és CC doméneknek az N-terminális 20

22 régió dimerizációjában van szerepük, mivel biofizikai módszerekkel sikerült kimutatni, hogy a formin fehérjék dimer formában aktívak (Li és Higgs 2005; Moseley és mtsai. 2004; Harris és mtsai. 2004; Harris és mtsai. 2006). Emellett a CC régiónak további szerepe lehet a forminok lokalizációjában a specifikus ligandokkal való kölcsönhatások során. 9. ábra A forminok doménszerkezete és a DRF forminok szabályozása. Az emlős formin családok doménszerkezete. Rövidítések: GBD, GTP-áz kötő domén; DID, diaphanous inhibíciós domén domén; DD dimerizációs domén; CC, coiled-coil domén; FH1 és FH2, formin homológia 1 és 2 domének; DAD, diaphanous autoregulációs domén; FSI, formin Spire interakciós domén; PDZ, Postsynaptic density protein, Discs large, Zona occludens 1 domén; W, WASP homológia 2 domén. (B) A Diaphanous szerű forminok dimer formában aktívak, szabályozásukkor pedig az autoinhibíció a C-terminális DAD és az N-terminális DID domének kölcsönhatásával jön létre. A Rho fehérjecsaládba tartozó kis GTP-ázok GBD doménhez történő kapcsolódásával az autoinhibíciós kapcsolat megszűnik, így a formin aktív állapotba kerül. Forrás: Campellone és Welch A C-terminális rész a DRF forminok esetében a Diaphanous autoregulációs domént (DAD) hordozza, amely az N-terminálison levő Diaphanous inhibíciós doménnel (DID) összekapcsolódva inaktív konformációt alakít ki. Speciális esetekben ez az autoinhibíció megszüntethető egy Rho kis GTPáznak az N-terminálison elhelyezkedő GTPáz-kötő doménhez 21

23 (GBD) való kötődésével (Li és Higgs 2003; Liu és mtsai. 2008a) (9. ábra B). De egyre több bizonyíték szól amellett, hogy egyéb járulékos faktorok is közrejátszanak az aktiválásban. Emellett, úgy tűnik, hogy néhány formin képes aktiválni a Rho kötőpartnereit, ezáltal teremtve meg a kölcsönös aktiváció lehetőségét (Habas és mtsai. 2001; Kitzing és mtsai. 2007). Ugyancsak a C-terminális régióban található az aktin filamentum összeszerelődést megvalósító FH1-FH2 doménekből álló modul. A prolin-gazdag FH1 doménnek nincs stabil másodlagos szerkezete, viszont ismert, hogy kötőhelyeket tartalmaz a Profilin-aktin komplexek számára. A Profilin a sejtekben az ATP asszociált aktin monomereket köti meg (Kaiser és mtsai. 1999), következésképpen a Profilin-aktin komplexek az in vivo aktin összeszerelődés meghatározó építőkövei. A Profilin és az FH1 domén közötti kölcsönhatás kulcsfontosságú az aktin monomereknek az FH2 katalitikus régióhoz való szállításában (Kovar és mtsai. 2003; Yonetani és mtsai. 2008; Sagot és mtsai. 2002; Paul és Pollard 2009). A Profilinen kívül az FH1 domén kötőhelyül szolgálhat SH3 és/vagy WW doméneket tartalmazó fehérjék számára (Chang és mtsai. 1997; Evangelista és mtsai. 1997; Imamura és mtsai. 1997). Ez a domén, annak ellenére, hogy a Profilinen keresztül képes aktin monomereket megkötni, önmagában nem segíti elő az aktin nukleációt (Paul és Pollard 2009). Az FH1 doménnel szomszédos, de annál jóval nagyobb méretű FH2 domén (kb. 450 aminosav) tekinthető a forminok katalitikus doménjének. Az FH2 doménre jellemző, hogy gyűrűszerű homodimereket alkot, amelyek körbeveszik az aktin filamentum gyorsan növekvő végét. A nukleációs lépés után a forminok az FH2 dimeren keresztül a plusz véghez kapcsolódva maradnak, így megvédik a filamentum véget a sapkázó (capping) fehérjék hozzákötődésétől, és emellett, ha szükséges, további monomerek beépülését segítik elő (ennek a jelenségnek a leírására az angol nyelvű szakirodalomban a processive capping kifejezést használják). Az 22

24 mdia1 és mdia2 esetében az FH2 domén a környező szekvenciákkal együtt a mikrotubulusokhoz is kötődik, és három mikrotubulus kötő fehérjével hat kölcsön: az endbinding protein 1-el (EB1), az adenomatous polyposis coli-val (APC), és a cytoplasmic linker protein 170-nel (CLIP170) (Wen és mtsai. 2004; Lewkowicz és mtsai. 2008; Bartolini és mtsai. 2008). Az FH2 homodimerek önmagukban is képesek katalizálni a tisztított aktin monomerek nukleációját in vitro körülmények között (Sagot és mtsai. 2002; Pring és mtsai. 2003), ugyanakkor a dimerizáció feltétlenül szükséges, mert azok a mutációk, amelyek megzavarják a dimerizációt, megszüntetik a polimerizációs aktivitást is (Moseley és mtsai. 2004; Copeland és mtsai. 2004; Xu és mtsai. 2004). Az élesztő Bni1 (Xu és mtsai. 2004) és az emlős FH2 domének (Lu és mtsai. 2007; Shimada és mtsai. 2004) kristályszerkezetének tanulmányozása azt mutatta, hogy a dimerizáció során a két FH2 domén rugalmas, pányva-szerű aminosavak segítségével kötődik egymáshoz, és így alkot egy gyűrűszerű struktúrát. A Bni1 FH2 doménjét tetrametil-rodaminnal jelölt aktinnal együtt is sikerült kristályosítani, és azt figyelték meg, hogy a dimerizált FH2 gyűrű két aktin monomert köt, és ezeket olyan konformációba hozza, ami hasonlít az F-aktinra jellemző aktin dimerek szerkezetéhez (Otomo, Tomchick és mtsai. 2005). Ez arra utal, hogy az FH2 mediálta nukleáció magában foglalja az aktin dimerek stabilizációját is. A fent említett FH2-aktin szerkezet, továbbá heterodimerikus FH2 mutánsok viselkedése alapján állították fel a forminok általános működési modelljét. Eszerint az FH2 dimer kezdetben két aktin monomert köt, mely a későbbiekben nukleációs magként szolgál a további aktin polimerizáció számára. Az FH2 dimer két különböző állapotban létezik a gyorsan növekvő végen. A zárt konformációban a további monomer beépülés nem lehetséges. A beépülés csak nyitott konformáció esetén történhet meg, és ez úgy valósul meg, hogy a plusz vég felé 23

25 elhelyezkedő hemidimer nyitottá válik és megtörténik az új aktin alegység hozzáadása, míg a mínusz vég felé eső hemidimer zárt állapotban található. A monomer beépülése után viszont az FH2 domén ismét zárt konformációt vesz fel. Az FH2 hemidimerek váltakozó nyitott és zárt állapotai eredményeképpen az FH2 dimer a beépülő monomereken való továbblépéssel (stair stepping mechanism) lehetővé teszi az új aktin alegységek hozzáadását (Otomo és mtsai. 2005) (10. ábra). 10. ábra A forminok általános működési modellje. Az FH2 dimer az aktin-filamentumok plusz végéhez kötődik, az aktin polimerizációhoz szükséges monomereket az FH1 domén biztosítja a Profilin-G-aktin megkötésével (1). Az FH1 domén a Profilin-G-aktint a plusz vég közelébe szállítja, ahol az FH2 dimer egyik funkcionális fele építi be az aktin monomert a filamentum végére (2). A második FH2 domén megismétli ugyanezt a folyamatot (3). A formin zárt konformációja megóvja a filamentum véget a capping fehérjék hozzákötődésétől (4). Forrás: Campellone és Welch Néhány formin a nukleációs és elongációs aktivitáson kívül más szerepet is betölt. Például az élesztő formin Bni1, az egér mdia2, FRL1, FRL2, FRL3, a Drosophila DAAM és az Arabidopsis FORMIN-LIKE 1 az aktin filamentumok kötegelésére is képesek (Moseley és Goode 2005; Harris és mtsai. 2006; Michelot és mtsai. 2005; Vaillant és mtsai. 2008; Barkó és mtsai. 2010). Az egér FRL1, INF2 és az Arabidopsis FH8-ról pedig kimutatták, hogy a filamentumok feldarabolásában vagy depolimerizációjában is szerepet játszanak (Harris és Higgs 2004; Chhabra és Higgs 2006; Yi és mtsai. 2005). A filamentumok kötegekbe rendezése az olyan párhuzamos lefutású aktin struktúrák kialakításakor lehet különösen fontos, mint amilyenek a filopódiumok és a stressz-rostok. A filamentum feldarabolásnak az aktin struktúrák gyors 24

26 átrendezésében lehet szerepe, de ez a formin szerepkörnek egy olyan aspektusa, amit in vivo körülmények között még nem vagy alig tanulmányoztak Aktin összeszerelődés és filamentumhossz szabályozás a harántcsíkolt izmokban A harántcsíkolt izmok vékony filamentumainak elongációját patkány kardiomiocita és Drosophila primer embrionális sejttenyészetekben is tanulmányozták, és a nem-izom sejtekkel ellentétben azt találták, hogy in vivo monomer beépülés nem csak a plusz végen történik, hanem a mínusz vég irányából is (Bai és mtsai. 2007; Littlefield és mtsai. 2001; Mardahl-Dumesnil és Fowler 2001; Pollard és mtsai. 2007). Ráadásul arra is fény derült, hogy a miofibrillumok fejlődése során jelentősen nagyobb az elongáció sebessége a mínusz végen, mint a plusz végen. Ez mindenképpen meglepő megfigyelés volt, hiszen a mínusz végi elongáció in vivo teljesen ismeretlen a szakirodalomban, és mivel eddig nem írtak le mínusz vég elongáló faktorokat, annak mechanizmusa egyáltalán nem nyilvánvaló. Mindemellett az elmúlt években több olyan fehérjét is jellemeztek, ami kapcsolatba hozható a miofibrilláris vékony filamentumok kialakulásával. Az egyik első jelölt az Lmod aktin nukleációs faktor volt, amelyről kimutatták, hogy sejtkultúrákban nélkülözhetetlen szerepet játszik a miofibrillogenezisben. Az Lmod a vékony filamentumok mínusz végeinél lokalizálódik, az érett miofibrillumok M-vonalához közel (Chereau és mtsai. 2008). A Lmod fehérjeszintjének RNS interferenciával való csökkentése súlyos zavarokat okoz a szarkomer összeszerelődésben, de az α-aktinin periodikus elrendeződése az aktin filamentumok mentén fennmarad. Ezért valószínű, hogy egy másik aktin nukleációs faktor is szükséges a szarkomerogenezis kezdeti lépéseihez. Később azt is kimutatták, hogy sejttenyésztett kardiomiocitákban az Lmod expressziós szintje az izomrostok kialakulásának későbbi stádiumában növekszik csak meg, és a fehérje csak a differenciálódott 25

27 miofibrillumokban halmozódik fel. Ezek alapján feltételezik, hogy az Lmod-nak csak a végső szarkomer szerkezet kialakításában és fenntartásában van szerepe, de nem szükséges a miofibrillogenezis kezdeti lépéseihez (Skwarek-Maruszewska és mtsai. 2010). A másik aktin összeszerelő faktor, amit kapcsolatba hoztak a szarkomerikus aktin filamentumok kialakulásával, a forminok közé tartozó Formin Homology 2 Domain Containing 3 (Fhod3) volt. Az emlős Fhod3 fehérjéről kimutatták, hogy kardiomiocita sejttenyészetben részt vesz a szarkomer szerveződésben. A Fhod3 fehérje szintjének RNS interferenciával való csökkentése a filamentáris aktin jelentős megfogyatkozását és a rendezett szarkomerikus struktúra felbomlását eredményezte. A Fhod3 azonban in vitro körülmények között még Profilin jelenlétében is gátló hatással volt az aktin polimerizációra. Másrészt a homozigóta fhod3 mutáns egerek szívében is fejlődtek miofibrillumok, így a Fhod3 szerepe a miofibrillogenezisben hasonlónak tűnik az Lmod-hoz: valószínűleg nem a kezdeti lépésekben van szerepe, hanem inkább a már kialakult szerkezet fenntartásában (Taniguchi és mtsai. 2009; Kan-O és mtsai. 2012). Az aktin nukleációs faktorokon kívül a Drosophila SALS (Sarcomere Length Shortening) fehérjét is kapcsolatba hozták az aktin filamentum növekedéssel. A SALS egy esszenciális fehérje, a sals mutánsok nagy része a lárvális fejlődési stádiumban elpusztul. Ezeknek a mutánsoknak az izmai normális számú, de jelentősen megrövidült szarkomerből állnak, ami arra utal, hogy bennük rövidebbek a vékony filamentumok, mint a vad típusban. Genetikai adatok alapján a SALS in vivo funkcionálisan antagonizál a mínusz vég sapkázó (lásd alább) Tmod fehérjével, ezáltal segítve elő a filamentum elongációt. Meglepő módon azonban, in vitro körülmények között a SALS kölcsönhatást mutat az aktinnal, de gátolja az aktin polimerizációt. Ezek alapján feltehetően ennek a fehérjének sincs szerepe a miofibrillogenezis kezdeti lépései 26

28 során (nem szükséges a szarkomerek kialakulásához), csak a szarkomerek növekedésében játszik szerepet (Bai és mtsai. 2007). A szarkomerikus aktin filamentumok képződésének a kezdeti lépéseken túl a hossz szabályozás is egy fontos eleme, hiszen a szarkomerek hosszát döntően az aktin filamentumok hossza határozza meg. A hossz-szabályozás vonatkozásában ismert, hogy a filamentum végeket sapkázó (capping) fehérjék tartják lezárva. Ezek megakadályozzák a további monomer beépülést, illetve disszociációt, ily módon stabilizálják a filamentumok hosszát. Az eddig leírt sapkázó fehérjék közül a CapZ a plusz, míg a Tmod a mínusz végeket képes lezárni (Au 2004). Irodalmi adatok alapján (Littlefield és mtsai. 2001) ez a két fehérje harántcsíkolt izmokban is képes kötődni az aktin filamentumok végéhez, és hozzájárulnak a vékony filamentumok hosszának szabályozásához. Összefoglalva elmondható, hogy a szarkomerikus aktin filamentumok kialakulásáról és hosszának szabályozásáról már vannak ismereteink, de a kezdeti aktin összeszerelő faktor és a molekuláris mechanizmus egyelőre ismeretlen. Jelen dolgozatban arról számolok be, hogy a formin fehérje család egy másik tagjáról, a DAAM alcsalád Drosophila képviselőjéről sikerült bizonyítanunk, hogy szükséges a vékony filamentumok kezdeti összeszerelődéséhez, és eredményeink alapján javaslatot teszünk egy új mínusz vég elongációs mechanizmusra. Saját egér sejtkultúrákban végzett kísérleteink és mások genetikai vizsgálatai alapján feltételezhető, hogy a DAAM alcsalád szerepe a miofibrillogenezisben evolúciósan konzervált. Az eredmények ismertetése előtt a bevezetés utolsó fejezetében áttekintem a DAAM alcsaládba tartozó forminok legfontosabb jellemzőit A DAAM formin alcsalád A DAAM alcsaládba tartozó formin típusú fehérjéket először a citoplazmatikus foszfoprotein Dishevelled-like (Dvl) kölcsönható partnereként azonosították, innen ered az 27

29 elnevezésük is: Dishevelled associated activator of morphogenesis (Habas és mtsai. 2001). A Dishevelled (Dsh/Dvl) fehérje család tagjai a Wnt/Frizzled jelátviteli út jól ismert elemei. Különböző modellrendszereken végzett kutatások alapján tudjuk, hogy a Wnt ligandok által aktivált Frizzled receptorok több, sejten belüli szignál transzdukciós utat is aktiválhatnak. Ezek közül a -katenin függő utat kanonikus Wnt/Frizzled jelátviteli útnak nevezzük, míg az úgynevezett szöveti polaritási vagy planar cell polarity (PCP) fehérjéktől függő útvonalat Wnt/PCP vagy nem-kanonikus útnak nevezzük (Komiya és Habas 2008). Ellentétben a Dsh fehérjével, ami mind a kanonikus, mind pedig a nem-kanonikus Wnt/Frizzled jelátviteli rendszer működéséhez szükséges, a DAAM fehérje család szerepe kizárólag a Wnt/PCP útvonal működéséhez köthető, de nem szükséges a kanonikus Wnt jelátvitelhez. Ahogy fentebb már utaltam rá, a DAAM alcsalád szekvencia homológia és működésmód alapján is a DRF alcsaládhoz tartozik. Ezek a forminok a DID és DAD doménjükön keresztül autoinhibícióval szabályozódnak, amit Rho GTPázok képesek megszüntetni. Az egér és humán DAAM fehérjék FH2 doménjének in vitro vizsgálatával kimutatták (Lu és mtsai. 2007, Yamashita és mtsai. 2007), illetve csoportunk Nyitrai Miklós (PTE, Biofizikai Intézet) kutatócsoportjával együttműködve a Drosophila DAAM biofizikai vizsgálatával megállapította, hogy a DAAM FH2 domén bona fide forminként viselkedik az aktin nukleációs és polimerizációs kísérletekben. Azt is sikerült megmutatnunk, hogy a ddaam FH1 doménje az aktin összeszerelődés során kölcsönhat a Profilin-aktin komplex-szel (Barkó és mtsai. 2010). Szekvencia analízis alapján a gerinces fajok genomja három DAAM ortológot kódol, amelyek kifejeződési mintáját egérben, karmos békában és csirkében is tanulmányozták. Az expressziós minta az embriogenezis során térben és időben is dinamikusan változik. Az expresszió a fejlődő központi idegrendszer (CNS) területén, a szomitákban, a dermomyotomok 28

30 szintjén és a szívben a legmagasabb az összes vizsgált fajban. Érdekes módon az embrionális CNS-en belül az agy, a gerincvelő és a retina területén a Daam1 és a Daam2 gének egymást kiegészítő génexpressziós mintázatot adnak (Kida és mtsai. 2004; Nakaya és mtsai. 2004). A DAAM fehérje család funkcionális jellemzése során azt találták, hogy a Daam1-nek kulcsszerepe van a Wnt/PCP jelátvitelben a Xenopus gasztruláció során. Később gerinces szövettenyészeteken a DAAM-nak egy sor olyan, a sejtműködésben végzett szerepét tárták fel, ami összhangban van a forminok általános, a citoszkeletális szabályozásban betöltött funkcióival. Ide tartozik a Daam1 által a sertés-aorta endoteliális sejtek alakjának és elágazódásainak a szabályozása; résztvétel a vérlemezkékben zajló RhoA-függő aktin összeszerelődésben (Higashi és mtsai. 2008); az endoteliális sejtek vándorlásának és proliferációjának a gátlása, és a mikrotubulusok stabilizációja ezekben a sejtekben (Ju és mtsai. 2010); a stressz-rostok kialakulásának és a centroszóma reorientációjának a szabályozása COS-7 és U2OS sejtekben (Ang és mtsai. 2010). Az mdaam1 egér mutánsok vizsgálatával arra derítettek fényt, hogy ez a fehérje fontos szerepet játszik a szívfejlődésben és a szarkomerek kialakulásában. Elképzelhető, hogy a szívfejlődési rendellenességek eredendően bal-jobb aszimmetria zavarokat tükröznek, ami összhangban lenne azokkal a további megfigyelésekkel, melyek szerint a DAAM fehérjék hozzájárulnak az idegrendszeren (Lee 2012; Colombo 2013) és a bélrendszeren (Welsh, 2013) belüli aszimmetriák kialakításához csirke és zebrahal modellrendszerekben. A fentiek alapján világos tehát, hogy a sejtváz szabályozó fehérjék evolúciósan nagymértékben konzerváltak. Ezért a ddaam fehérjével végzett kísérletek tovább bővíthetik az emlős DAAM és a vele rokon forminokra vonatkozó ismereteinket. 29

31 2. CÉLKITŰZÉSEK A Drosophila DAAM jellemzése során csoportunk megfigyelte, hogy a gén erős expressziót mutat a 12. embrionális stádiumban a fejlődő szívcső kardioblasztjaiban, majd később a fejlődő testfal izmokban is. Ezek után kimutattuk, hogy a fehérje jelen van az adult szívcsőben és az indirekt repülőizomban is. Embrionális és adult korú egér izommetszetek immunfestése után azt tapasztaltuk, hogy a mdaam1 a Drosophila izmokban tapasztalt lokalizációs mintázathoz hasonló képet ad egér izmokban. Tekintve, hogy a szarkomerikus aktin filamentumok kialakulásának mikéntje munkánk kezdetén jórészt ismeretlen volt, előzetes eredményeink alapján úgy gondoltuk, érdemes részletesen is megvizsgálni milyen szerepet tölthet be a ddaam fehérje a miofibrillogenezis során. Mivel a forminok a nem-elágazó, hosszú aktin filamentumok összeszerelődését katalizálják, és a harántcsíkolt izomsejtek egyik fő alkotóeleme éppen az ilyen típusú filamentum, mindenképpen elképzelhető volt, hogy egy formin családba tartozó fehérje kulcsszerepet játszik a vékony filamentumok összeszerelődésében. Első lépésként a ddaam fehérje lokalizációját kívántuk még alaposabban vizsgálni a muslica indirekt repülőizmainak szarkomerjeiben. Szándékunkban állt a vizsgálatokat a vad típuson kívül kiterjeszteni a fehérje funkcióvesztéses mutánsaira, valamint fehérje túltermeléses mutánsokra is. Funkcióvesztéses mutánsok és RNS csendesítő konstrukciók segítségével terveztük vizsgálni, hogy van-e szerepe a ddaam-nak az aktin filamentumok kialakulásában és a szarkomerek összeszerelődésében. További tervünk volt a ddaam molekuláris funkciójának vizsgálata, és a ddaam-mal együttműködő izomfehérjék azonosítása, genetikai interakciós kísérletek, illetve biokémiai kísérletek során. Mindezek alapján reméltük, hogy a ddaam működésmódjának jobb megértése egyben a szarkomer összeszerelődés mechanizmusáról is értékes információkat szolgáltat majd. 30

32 3. EREDMÉNYEK 3.1. A ddaam mutáns izmok fenotípusa és élettani jellemzése Az indirekt repülőizom szerkezete és fejlődése Dolgozatom legnagyobb része a ddaam génnek az indirekt repülőizom (Indirect Flight Muscle, IFM) fejlődése során betöltött szerepével foglalkozik. Emiatt a bemutatott eredmények jobb megértése érdekében szükségesnek tartom, hogy elöljáróban ennek az izomnak a fejlődéséről és szerkezetéről egy rövid összefoglalót adjak. A Drosophila IFM-et (11. ábra A) szerkezeti, élettani és fejlődési sajátosságai együttesen kiváló izom modellé teszik. Az alábbiakban ezeket az előnyöket ismertetném. Ebben az izomban a bábállapot túlnyomó részében a miofibrillumok egyidőben nagymértékű hossznövekedésen mennek keresztül. E növekedés minden stádiumában az izom szerkezete szigorúan rendezett, így a szerkezeti hibák könnyen detektálhatóak. Az izom állapota nem befolyásolja az életképességet, de a legkisebb változás is a szarkomer morfológiájában, amely még elektronmikroszkóppal sem detektálható, adult állapotban a röpképesség megszűnését vonhatja maga után. Ezeket a röpképtelen egyedeket pedig könnyen ki lehet szűrni egy egyszerű repülési tesztben. Ha a repülési tesztben nincs szignifikáns eltérés a vad típushoz képest, akkor értelmetlen molekuláris szintű vizsgálatokat végezni. A kétszárnyúakban (Diptera), és így Drosophilában is, az IFM-nek egyedi a szerkezete. Anatómiailag a legjobban a gerinces szívizomra hasonlít (Maughan és Vigoreaux 1999), egyedi rostokra szedhető szét, és ily módon különbözik a tubuláris szerkezetű egyéb adult és lárvális rovarizmoktól. Arra a kérdésre, hogy ennek az izomnak miért alakult ilyen rendhagyóvá a szerkezete és a fejlődése, a válasz a muslica repülési mechanizmusában keresendő. A direkt szárnymozgató izmoknak csak a manőverezésben van szerepük repülés közben. A konkrét erőt, 31

33 ami a szárnyak felemeléséhez és lecsapásához szükséges, azt az indirekt repülőizom biztosítja. Ez az erő nem annyira a szárnyak alapjára hat, hanem a tor alakját változtatja. Az IFM két fő izomcsoportból, a dorzoventrális (DVM) és a dorzolongitudinális (DLM) izomcsoportból áll. A dorzoventrális izomcsoport összehúzódásával lapítja a tor kitinvázát és ezáltal a szárnyakat emeli. A dorzolongitudinális izomcsoport antagonistaként működik: a tor kitinvázának a felső részét emeli és ezáltal a szárnyak lefelé irányuló mozgását biztosítja (11. ábra B és C) (Fernandes és mtsai. 1991). 11. ábra Az IFM szerkezete. (A) Az adult állatok torának nagy részét az indirekt repülőizom nagy tömege tölti ki. Az IFM két antagonista izomcsoportból áll. A dorzoventrális (DVM) 7 izomrostból álló izomcsoport (B), összehúzódásával lapítja a tor kitinvázát és ezáltal a szárnyakat emeli. A 6 izomrostból álló dorzolongitudinális (DLM) izomcsoport (C) a tor kitinvázának a felső részét emeli és ezáltal a szárnyak lefelé irányuló mozgását biztosítja. Forrás: Maughan és Vigoreaux 1999; Vigoreaux Az izom összehúzódása független az idegi impulzusoktól (aszinkron aktiválódású izom), az antagonista izomcsoportok folyamatosan ingerelt állapotban vannak, összehúzódásaikat az idegi utasításokon kívül a megfeszülésük is kiválthatja. Ebben az állapotban ezek az antagonista izomcsoportok egymást feszítve kölcsönös összehúzódási és elernyedési ciklusokon mennek keresztül, így érve el egy bizonyos összehúzódási frekvenciát. Ezt a frekvenciát nem az idegi impulzusok szabják meg, hanem a tor vázának a tulajdonságai. Így a szárnycsapások száma jóval magasabb értéket érhet el, mint ha folyamatos idegi impulzusok biztosítanák külön-külön az antagonista izmok összehúzódását (Bate és Arias 1993). Az izomműködésnek ez az aszinkron 32

34 módja kizárólag csak a rovaroknál előforduló találmány, a legnépesebb rovarrendek (Diptera, Hymenoptera, Heteroptera és Coleoptera) tagjaira jellemző, mint evolúciós adaptáció a magas frekvenciájú szárnycsapások eléréséhez. Tekintve, hogy a muslica átlagos szárnycsapási frekvenciája másodpercenként ~240, az IFM a leggyorsabban összehúzódó izmok közé tartozik (Maughan és Vigoreaux 1999; Swank és mtsai. 2006). Az IFM fejlődése a mioblasztok vándorlásával kezdődik, melyek a korai bábban elvándorolnak a szárny imágókorong notum régiójából és megtelepednek a lárvális ferde izmok maradékán (Larval Oblique Muscles, LOM). Ezek a lárvális szomatikus testfal izmok mintaként szolgálnak a dorzolongitudinális izomcsoport kialakulásához. A mioblasztok itt fuzionálnak és létrehozzák az IFM dorzolongitudinális és dorzoventrális izomcsoportját. A fúzió idején az izmok hosszanti növekedésen mennek keresztül, kitöltik a fejlődő tort, az ínsejtekhez kapcsolódnak, és ezek után a harmadára csökken a méretük. Erre az időszakra az adult szarkomer vázfehérjék magas expressziója jellemző. A szarkomer összeszerelődése ebben az időszakban történik, ezután az izmok újból megnyúlnak, az ínsejtek visszahúzódnak, az izmok kitöltik a rendelkezésükre álló teret (12. ábra), és kialakulnak a funkcionálisan aktív miofibrillumok. A szarkomer fejlődésében a kritikus kezdeti időszak a bábállapot harmincadik és negyvenedik órája közötti időszakra esik. Ezután a szarkomerek száma már nem változik, csak a méretük növekszik, amíg el nem éri a ~3,2 µm végleges hosszúságot (Nongthomba és mtsai. 2004; Weitkunat és mtsai. 2014). Ennek megfelelően, látványos izomfejlődés zajlik le ebben az időszakban. Az IFM dorzolongitudinális izomcsoportjában a miofibrillumok ~310 szarkomerből állnak, a bábállapot kialakulásától számított 48 órás muslicákban a szarkomerek hossza ~1,7 µm, az általuk alkotott izom hossza ~500 µm. A fiatal adultokban ugyanaz a ~310 szarkomer már 3,2 33

35 µm hosszú, az izom hossza pedig eléri az 1000 µm-t. Tehát a szarkomerek szintjén a növekedés majdnem kétszeres, és hogy ez megvalósulhasson, ahhoz a vékony és vastag filamentum rendszer egyidejű növekedésére van szükség a miofibrillum összeszerelődése során (Reedy és Beall 1993). 12. ábra A DLM fejlődése során bekövetkező rostképződés és sejtosztódásos folyamatok. (A) A DLM az olyan mioblasztok fúziójából jön létre, amelyek a LOM-on telepedtek meg. (B) A LOM nem megy át a teljes hisztolízisen és a továbbiakban templátként (TEM) szolgál. (C) Az IFM a mioblaszt fúziónak köszönhetően megnyúlik, és az ínsejtekhez (tendon cells, TC), kapcsolódik. (D) Az izomrostok megrövidülését követően elkezdődik a miofibrillogenezis. (E) Az egymásba kapcsolódó izom és ínnyúlványok (TCM) visszahúzódnak ahogy az izmok mérete növekszik, addig amíg a funkcionálisan aktív miofibrillumok (F) ki nem alakulnak. Forrás: Nongthomba és mtsai A ddaam-nak az izomfejlődésben betöltött szerepét vizsgáló kísérletek előzményei Az elmúlt néhány évben csoportunk egy formin alcsaládba tartozó fehérjének, a ddaam-nak (Habas és mtsai., 2001) a funkcionális vizsgálatával foglalkozott. Szekvencia analízis alapján ez az egyetlen Drosophila DAAM ortológ, és a CG14622 jelű annotált génnek felel meg, ami az X kromoszóma csúcsán az 1F citológiai régióban található. A Drosophila genetikai adatbázis (FlyBase) több ddaam transzkript lehetőségét felveti, ezek közül csoportunk elsősorban a CG14622-RB jelűre fókuszált, melyet az RE67944 jelzésű EST klón kódol. Megszekvenálva ezt a teljes hosszúságú cdns klónt, egy 1153 aminosavból álló fehérje prediktálható. További vizsgálatok kimutatták, hogy az ORF valóban tartalmazza a forminokra jellemző konzervált doméneket, úgy mint az FH1, FH2, GBD és DAD domént (13. ábra A). A ddaam funkcionális analíziséhez csoportunk funkcióvesztéses mutánsokat hozott létre két 34

36 transzpozon inszerciót EP(1)1336 és EP(1)1542 felhasználva, melyek a ddaam lokusz közvetlen közelében találhatóak (13. ábra A). Ezen inszerciók remobilizációjával sikerült izolálni deléciós allélokat, melyek közül kettő a ddaam 5 régiójára térképeződött, öt pedig a 3 régiót érintette. A nagyméretű 5 deléciók csak 5 UTR exonokat és intronikus szekvenciákat érintenek. A 3 allélok jóllehet kisebb deléciókat ( bp) hordoznak, de a ddaam ORF-et is érintik. A deléciók közül a legkisebb, a ddaam Ex1 12 aminosavat távolít el a prediktált fehérje C- terminális részéről, a legnagyobb, a ddaam Ex68 pedig 457 aminosavat (13. ábra B). Mind az 5, mind a 3 deléciók letálisak homo-, illetve hemizigóta formában, kivéve a ddaam Ex1 -et, amely homozigóta életképes és fertilis allél (a vad típushoz viszonyított életképessége viszont csak 17%-os). A letális 5 és 3 deléciók nem komplementálják sem egymást sem ezt a régiót átfedő deléciókat [Df (1)AD11, Df(1)AC7, és Df(1)sta]. Komplementálhatók azonban két transzpozíciós duplikációval [Dp(1;3)sta és Dp(1;Y)Sz280], amelyek hordozzák az 1F2-3 citológiai régiót, ahová a ddaam lokalizálódik. A két legnagyobb deficiencia allél, a ddaam Ex68 és a ddaam Ex36 kivételével minden letális allél életképes a ddaam Ex1 felett. Annak bizonyítására, hogy a letalitás a ddaam fehérje hiányának köszönhető, létrehoztak olyan transzgenikus muslicákat, melyek hordozzák az UAS-FL-DAAM konstrukciót, amelybe a teljes hosszúságú RE67944 cdns-t klónozták. Ezt a konstrukciót aztán menekítési kísérletben tesztelték. Ha az UAS-FL- DAAM-ot Actin-Gal4 vagy tubulin-gal4 szabályozás alatt expresszálták mutáns háttéren, a letalitás menekíthető volt még a ddaam Ex68 esetében is. Összegezve, ezek az eredmények bizonyították, hogy minden letális allél ddaam allél, és ezek a mutációk nem érintenek más esszenciális genetikai elemet. 35

37 13. ábra A ddaam gén szerkezete, a ddaam homológia doménjei, és a deléciós allélok helyzete. (A) Az 1F2-3 citológiai pozícióban található a CG14622 annotációs számnak megfelelő egyetlen Drosophila DAAM ortológ. A funkcióvesztéses allélok előállítására használt két P elem, az EP(1)1336 és az EP(1)1542 pozícióit piros háromszögek jelzik. Ex249 és Ex184 a neve a két nagyméretű 5 deléciónak. (B) A teljes hosszúságú ddaam cdns-e egy 1153 aminosavat tartalmazó fehérjét kódol, melyben megtalálhatóak a DRF forminokra jellemző homológia domének. Az ábra alján a 3 deléciók pozícióját tüntettük fel. A funkcióvesztéses (Loss of Function, LOF) vizsgálatokat megkönnyítendő, csoportunkban előállítottak egy T129M nevű RNS interferencia konstrukciót is. Embriókon végzett RNS in situ hibridizációs kísérletek alapján a ddaam fehérje több szövetben is kifejeződik. Ezeken a szövetspecifikus funkciókon kívül azt is észrevettük, hogy a gyenge hipomorf ddaam Ex1 allélt hordozó, ezért hemizigóta formában is életképes adult hímek röpképessége gyengébb a vad típusnál. Mivel a röpképtelenséget leggyakrabban az IFM szerkezetében bekövetkezett változások okozzák, immunhisztokémiai módszerekkel vizsgáltuk tovább az izmot. Megállapítottuk, hogy a ddaam fehérje az IFM szarkomerein belül a Z-korongok és az M-vonal környékén lokalizálódik. Mivel ez a lokalizációs eredmény egy érdekes, eddig nem 36

38 tanulmányozott szerepre utalt, elhatároztuk, hogy részletesebben is megvizsgáljuk, vajon mi módon vehet részt a ddaam fehérje az indirekt repülőizom fejlődésében A ddaam mutáció befolyásolja a röpképességet és az indirekt repülőizom fejlődését A Drosophila DAAM forminnal végzett kísérleteink során kimutattuk, hogy a homozigóta életképes ddaam Ex1 -es allélt hordozó muslicák 16%-a röpképtelen szemben a vad típusnál tapasztalt 4,5%-os röpképtelenségi aránnyal. Ez a röpképtelenségi arány gyenge, moderált fenotípusnak számít, de ez nem meglepő adat egy hipomorf allél esetében. Mivel a ddaam null allélok homozigóta formában letálisak, úgy próbáltunk erősebb funkcióvesztéses fenotípusokat létrehozni, hogy RNS interferenciás kísérletekkel csökkentettük a ddaam fehérje szintjét vad típusú és ddaam Ex1 -es állatokban, és így vizsgáltuk a röpképességben bekövetkezett esetleges változásokat. Az RNS interferenciás kísérletekhez kétféle RNS interferencia konstrukciót használtunk. A T129M nevű konstruktot a csoportunk már korábban létrehozta (RNSi T129M ). A KK nevű RNS interferenciás konstrukciót pedig a bécsi RNS interferencia törzsgyűjteményből (VDRC) szereztük be (RNSi VDRC ). A két konstrukt a ddaam génről képződő mrns nem átfedő részeit célozza meg. Az RNS interferenciás kísérletekhez indirekt repülőizom specifikus Gal4 meghajtó elemet (UH3-Gal4) (Katzemich és mtsai. 2012) és UAS-Dicer2-t használtunk. A Dicer2 túltermelése posztmitotikus sejtek esetén célszerű, mert szignifikánsan javítja az RNS interferencia hatékonyságát. (Dietzl és mtsai. 2007). Mindkét RNS interferenciás vonal használata erős röpképtelen fenotípust eredményezett: a KK kontrukt (RNSi VDRC ) esetében 94% míg a T129M (RNSi T129M ) vonal esetében 87% volt a röpképtelenek aránya. Végül a ddaam fehérje szintet tovább csökkentettük az említett módon úgy, hogy ddaam Ex1 -es háttéren végeztük el az RNS interferenciát (ddaam Ex1, UH3-Gal4; UAS-Dicer2; UAS- 37

39 ddaam RNSi-T129M, rövidítve: ddaam Ex1, UDT). Ebben az esetben a röpképtelen muslicák aránya 98%-ra emelkedett (14. ábra A). A röpképtelen fenotípus erőssége megegyezett a ddaam fehérje szintjének az IFM-ben tapasztalt csökkenésével mind a ddaam Ex1 -es, mind pedig az RNS interferenciás genotípusú állatok esetében (14. ábra B). Western blot analízis segítségével a ddaam fehérjeszintet vizsgálva az IFM-ben azt találtuk, hogy a ddaam-nak két izoformája expresszálódik ebben az izomban: egy 130 kda-os rövid, és egy163 kda méretű hosszú izoforma. 14. ábra A ddaam befolyásolja a röpképességet. (A) A vad típusú és ddaam mutáns legyek röpképességének mérése a megfelelő genotípusok feltüntetésével. Az oszlopok az átlagértéket ábrázolják, melyek fölött a szórások értéke található. (B) Western blot analízissel mutattuk ki, hogy a vad típusú IFM-ben kétféle ddaam izoforma expresszálódik: egy 130 kda és egy 163 kda méretű izoforma. A hosszú izoforma nagyobb mennyiségben expresszálódik. A ddaam Ex1 -es allélben a 130 kda-os rövid izoforma szintje, míg az RNS interferenciás vonalakban a 163 kda-os hosszú izoforma szintje csökken le számottevően. Belső kontrolként a glikogénfoszforiláz ellenanyagot használtuk (100 kda). A rövid izoforma méretben megfelel a Flybase által prediktált PB izoformának, míg a hosszú izoforma a mérete alapján a PD izoformának felel meg. Az 14. ábra B paneljén látható, hogy a PD, hosszú izoforma nagyobb mennyiségben expresszálódik. A ddaam Ex1 -es allélben a 130 kda-os rövid izoforma szintjében mutattunk ki csökkenést, míg az RNS interferenciás vonalak esetében a 163 kda-os hosszú izoforma szintjében sikerült nagymértékű csökkenést 38

40 kimutatnunk (14. ábra B). A ddaam Ex1 -es és az RNS interferenciás röpképtelen fenotípust menekíteni tudtuk mind a ddaam-pb mind pedig a PD izoforma túltermelésével. A röpképtelenek aránya 4%-ot tett ki a ddaam Ex1 -es menekített hímek esetében, ami megegyezett a vad típuséval, míg ez az érték a menekített ddaam Ex1, UDT esetében 7%-os volt. 39

41 Atomerő-mikroszkópiás mérések az indirekt repülőizom miofibrillumain Az atomerő mikroszkóp (Atomic Force Microscope, AFM) alapelve: egy speciálisan kialakított tű alakú szondát atomi méretű lépésekkel mozgatunk a vizsgált felülettől igen kis távolságra, mintha csak egy miniatürizált lemezjátszótűvel tapogatnánk le a felületet. Egy mechanikus rendszer érzékeli az atomi vonzó és taszító kölcsönhatási erőket, a vele összeköttetésben lévő lézeroptikai rendszer jeleiből pedig rekonstruálható a felület atomi mintázata. Az atomerő-mikroszkóp képalkotása a felületet pásztázó tű és a felület atomjai között fellépő erő mérésén alapul. Az AFM tűjével atomi méretekben módosíthatjuk a felületet. A mechanikus rendszer, ami az atomi erőket érzékeli, arra is használható, hogy mikroszkopikus szinten meg tudjuk mérni bizonyos anyagok rugalmasságát (Young modulusát). Annak érdekében, hogy kiderítsük a ddaam mutánsokra jellemző szerkezeti hibák befolyásolják-e az izom mechanikai tulajdonságait, olyan AFM elemzéseket végeztünk, amelyek során a miofibrillumok rugalmasságát mértük összehúzódott állapotukban (15. ábra). 15. ábra A vad típusú és ddaam mutáns miofibrillumok haránt irányú tugalmasságának mérése atomerőmikroszkóp segítségével. Hogy a miofibrillumok mechanikai tulajdonságait jellemezni tudjuk, a haránt irányú rugalmasságukat a Young féle modulusz segítségével számoltuk ki. Mintánként a különböző pontokon felvett több erő-benyomódás görbéből számolt átlagot, valamint a standard deviációt ábrázoltuk. A ddaam Ex1 és a ddaam Ex1, UDT mutáns miofibrillumok rugalmassága szignifikánsan alacsonyabb, 6±1,63 kpa (n=35) illetve 4±1,24 kpa (n=15), a vad típushoz: 22±4.91 kpa (n=25) képest. A miofibrillumok hosszanti irányú rugalmasságának a mérése adja a legpontosabb képet az izom mechanikai tulajdonságairól, viszont ez a módszer túlságosan idő és munkaigényes, ezen kívül külön felszerelést és szaktudást igényelt volna, ami az adott keretek között nem állt 40

42 rendelkezésünkre. Ezért a technikailag jóval könnyebben kivitelezhető haránt irányú rugalmassági méréseket végeztük el. Ezzel a módszerrel sikerült kimutatnunk, hogy a ddaam Ex1 és a ddaam Ex1, UDT mutánsok miofibrillumainak haránt irányú rugalmassága szignifikánsan alacsonyabb a vad típusénál. A Young modulusz értékei a következőek: 6±1,63 kpa (n=35) a ddaam Ex1 -es, 4±1,24 kpa (n=15) a ddaam Ex1, UDT mutánsok valamint 22±4,91 kpa (n=25) a vad típus esetében. Fontosnak tartom megjegyezni, hogy míg a konfokális mikroszkópiás elemzéssel a ddaam Ex1 mutáns IFM csak moderált fenotípusos elváltozást mutatott, addig a rugalmassági mérésekből kitűnik, hogy az itt meghatározott érték sokkal közelebb állt a súlyos RNS interferenciás fenotípus esetében mért értékhez, mint a vad típuséhoz. A konfokális adatokat kiegészítve sikerült kimutatni, hogy ha látszólag a szerkezet nem is sokban változott, az még nem jelenti azt, hogy az izom mechanikai tulajdonságai súlyosabban ne károsodtak volna. A fenti eredményeinkből következik, hogy a ddaam funkció csökkenése maga után vonja az izom szerkezetének és mechanikai tulajdonságainak a gyengülését. Ezek alapján ez a formin típusú fehérje fontos regulátora az izomfejlődésnek, sokoldalúan befolyásolva az ecetmuslicákban a miofibrillum képződést A ddaam hatással van a lárvális szomatikus izmok és a szívcső fejlődésére Az előbbi eredmények után arra a kérdésre szerettünk volna választ találni, hogy a ddaam fehérjének az IFM fejlődésében betöltött szerepe általánosan érvényes-e minden más típusú izomra is. E célból a lárvális testfal izmokon és a lárvális szíven végeztünk kísérleteket A lárvális szomatikus testfal izmok Az embrió fejlődésének 13. stádiumában a csírasáv visszahúzódása után egy bonyolult izom mintázat kezd kifejlődni az epidermisz belső oldalán. Ezek az izmok szincíciálisak, 41

43 harántcsíkoltak, és bizonyos helyeken kapcsolódnak a kialakuló lárva testfalához. Mindegyik izom rendkívül egyedi felépítésű, a szomszédjától megkülönböztethető a mérete, alakja, kapcsolódási pontjai és a beidegzése alapján. Habár az izmok mintázata első látásra bonyolultnak tűnik (16. ábra A), a mintázat szelvényenként ismétlődő egyszerűbb egységekre bontható. Az A2-A7 abdominális szelvények között egy szabályosan ismétlődő, 30 izomból álló minta látható (16. ábra B, C) (Bate 1990). Az A1-es szelvény egy kissé eltér ettől, mert csak 29 izmot tartalmaz. Az A8-as szelvényben pedig az izmok mintázata különbözik. 16. ábra A lárvális testfal izmok mintázata. Az (A) panelen egy L3- as stádiumú lárva testfal izomzata látható rodamin-falloidin jelölés segítségével. Ez a mintázat szelvényenként ismétlődő egyszerűbb egységekre bontható. Az abdominális szelvényekben, az A2-től az A7-ig, egy szabványos, 30 izomból álló minta látható belülről (B) és kívűlről (C) nézve. A felső rész a dorzális résznek, míg az alsó a ventrális középvonalnak felel meg. A skála mérete: 250 μm. Forrás: Bate A megközelítőleg 5 napig tartó lárvális életszakasz során a testfal izmok látványos növekedésen mennek keresztül szarkomerek összeszerelődése és új miofibrillumok hozzáadása által, miközben a sejtmagvaik száma nem változik, bár ezek a sejtmagok DNS replikáción és növekedésen mennek keresztül (Bate és mtsai. 1991; Demontis és Perrimon 2009). A báb metamorfózisának kezdetén a lárvális izmok többsége hisztolízis útján lebomlik mielőtt az adult izmok differenciációja megtörténne, de néhányuk fennmarad, és ezek templátként szolgálnak az adult izmok összeszerelődésénél. Ebben az időszakban alakulnak ki az új adult izmok olyan mioblasztokból, amelyek differenciálatlanok maradtak az embrionális és a lárvális élet során (Currie és Bate 1991). A mioblasztok fúziójának a száma határozza meg a kialakuló izom egyedi 42

44 méretét, míg az izom alakját alapvetően az ínsejtekhez való kapcsolódása szabja meg. Az izmok nem csak ezekhez az ínsejteknek nevezett specializálódott epidermális sejtekhez kapcsolódhatnak, hanem egymáshoz is (Schnorrer és Dickson 2004), így alakítva ki a felnőtt izomzatra jellemző összetett mintázatot A lárvális testfal izmok nevezéktana A Bate féle nomenklatúrában az izmokat három fő csoportra osztják: dorzális (dorsal), laterális (lateral) és ventrális (ventral) csoportokra. Ezeken belül az izmok tovább kategorizálhatók irányítottságuk szerint hosszanti (longitudinal), átlós (transverse), ferde (oblique) vagy hegyesszögű irányú (acute) izmokra. A ferde és hegyesszögű megnevezést annak az elkülönítésére használják, hogy ha az izom iránya a dorzális elülső résztől a ventrális hátulsó rész felé tart akkor ferde, míg ha a dorzális hátulsó résztől a ventrális elülső rész felé, akkor hegyesszögű irányítottságú. Mindegyik alkategórián belül, mint például dorzális ferde izmok, az izmokat a további megkülönböztetés érdekében számozzák is a dorzális résztől a ventrális, valamint az elülső résztől a hátulsó felé (17. ábra) (Bate és Arias 1993). 17. ábra A lárvális testfal izmok nomenklatúrája. Az A2-től az A7-ig tartó abdominális szelvények sematikus ábrája belső (A) és külső (B) nézetben. A DA rövidítés a dorsal acute -nak, DO a dorsal oblique -nek, a DT a dorsal transverse -nek, az LL a lateral longitudinal -nak, az LO a lateral oblique -nek, az LT a lateral transverse -nek, a VA a ventral acute -nak, a VL a ventral longitudinal -nak, a VO a ventral oblique -nek, végül az SBM a segment border muscle -nek felel meg. Forrás: Bate és Arias

45 ddaam mutánsokban megváltozik a lárvális testfal izmok szerkezete ddaam mutáns lárvák vizsgálata során azt találtuk, hogy a peterakástól (After Egg Laying, AEL) számított 72 órás ddaam Ex68 as null mutáns harmadik stádiumú (L3) lárvák testmérete és szomatikus testfal izomzata a vad típuséhoz hasonló. Azonban egy későbbi időpontban, 100 órával a kikelés után már nagy különbség volt a mutáns és a vad típusú lárvák testmérete között. A mutáns lárvák sokkal rövidebbek (2,08±0,31mm; n=30) voltak a vad típusú lárvák testhosszához (3,24±0,25mm; n=30) képest (20. ábra A, E). Annak ellenére, hogy a mutáns lárvákban súlyos szerkezeti változásokat a teljes testfal izomzat szintjén nem láttunk, a mutáns izmok kisebb méretűeknek bizonyultak, egyes izomrostokban szakadások voltak megfigyelhetőek, és a miofibrillumok egymáshoz viszonyított elhelyezkedése is sokkal lazább volt, mint a vad típusban (18. ábra B, D). 18. ábra A ddaam mutáns lárvális testfal izmok általános szerkezete. Falloidinnal festett vad típusú (A, C) és ddaam Ex68 null mutáns (B, D) lárvális testfal izmok. A mutáns izmok kisebbek, bizonyos izomrostokban szakadásos rések keletkeztek (a D panelen nyíllal jelöltük), és az általános felépítésüket tekintve az izmok sokkal lazább szerkezetűek a vad típushoz képest. A skála mérete: 100 μm. A megfigyeléseink számszerűsítésére kiválasztott 3-as számú ventrális hosszanti testfal izom (VL3) hossza a mutáns lárvákban 53%-kal, a szélessége pedig 38%-kal csökkent a vad típushoz képest (20. ábra G, H). A VL3-as izmok ddaam mutánsokban megfigyelhető rövidülése két okra vezethető vissza, egyrészt a szarkomer hossz, másrészt a szarkomer szám is csökken ezekben a mutánsokban (20. ábra I, J). Az átlagos szarkomer hossz a vad típusú VL3- as izmokban a petéből való kikeléstől számított 100. óra után 6,2±1,6μm (n=477 szarkomer), 44

46 ezzel szemben a ddaam mutánsokban 3,8±0,7μm-re (n=241 szarkomer) csökkent. A ddaam mutáns esetében a VL3-as izom szarkomer száma is lecsökkent (30,1±2,1; n=8) a vad típushoz (39,7±4,3; n=12) képest. Ahhoz, hogy ki tudjuk mutatni, hogy az izomszerkezetben bekövetkező defektusok milyen fiziológiai elváltozásokkal járnak, a ddaam mutáns lárvák mozgásképességét is megvizsgáltuk egy lárvális mászási sebességet mérő tesztben. A strukturális elemzéssel összhangban a 72 órás AEL ddaam mutáns lárvák egyenes vonalú mászásának a sebessége nem különbözött a vad típusétól (20. ábra B). Ez nagy valószínűséggel az anyai hatásra vezethető vissza, mert a ddaam Ex68 as lárvák ~10%ában még 100 órával a petéből való kikelés után is kimutatható a fehérje (19. ábra B). 19. ábra A ddaam Ex68 mutáns lárvák egy részében kimutatható a fehérje. (A-B) A fejlődő vad típusú 72 órás lárvális testfal izomban (A) jól látható kettős sávot alkot a ddaam fehérje (ciánkékkel jelölve). Egy hasonló, de gyengébb mintázatot figyelhetünk meg a ddaam Ex68 -as mutáns lárvák ~ 10%ában (B). A kettin (zöld) a Z-korongokat jelöli. A skála mérete: 5 μm. A 100 órás mutáns lárvák sebessége azonban ~60%-kal csökkent a vad típushoz képest (20. ábra B). Annak ellenére, hogy szoros összefüggés van a lárvák testhossza és mászási sebessége között, a ddaam mutáns lárvák jóval lassabban mozogtak, mint ahogy csökkent méretük indokolta volna (20. ábra C, D). A menekítési kísérletek, amelyekben az általános izomdriver Dmef2-Gal4 segítségével fejeztettünk ki különböző UAS-DAAM konstrukciókat, igazolták, hogy a megfigyelt fenotípusok a ddaam funkció hiányának tulajdoníthatóak. 45

47 A fent említett menekítési kísérleteket külön elvégeztük mindkét izoformával. Az UAS- DAAM-PB expresszió a ddaam Ex68 as lárvák sebességvesztését csak részben, míg a testhosszát és izomméretét majdnem teljes mértékben menekíteni tudta. Az UAS-DAAM-PD expressziónak pedig sikerült majdnem teljesen helyreállítani a vad típusra jellemző testhossz és sebesség értékeket (20. ábra E-H). Ráadásul a PB és PD izoformák izom-specifikus túltermelése nem csak a lárvális izom károsodásait menekítette, hanem részben képes volt a ddaam Ex68 as null mutáns lárvák életképességét is egészen az adult stádiumig menekíteni (a túlélők aránya a vad típushoz képest 3% a PB, 6,1% a PD izoforma által menekített muslicák esetében). Ezek után a mutáns menekítési kísérleti rendszert felhasználva azt a kérdést vizsgáltuk, hogy a ddaam fehérje aktin összeszerelő aktivitásának van-e lényeges funkcionális szerepe a fehérje in vivo működésében. Ezek a kísérletek azt mutatták, hogy a vad típusú konstrukciókkal ellentétben az aktin polimerizálásra képtelen mutáns formák, az UAS-DAAM-PB I732A és az UAS- DAAM-PD I1042A, melyek a Bni1 élesztő formin fehérje FH2 doménjét érintő I1431A mutációt utánozzák (Xu és mtsai. 2004), nem menekítették a fenotípust (20. ábra E-J). Sőt, az UAS- DAAM-PD I1042A mutáns háttéren túltermelve domináns negatív formaként viselkedett a testhossz és a sebesség menekítése esetében. Azaz, a testhossz és sebesség értékei alacsonyabbak voltak a ddaam Ex68 as mutánsénál. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy a forminok csakis dimerként működőképesek és mind a fehérje N-terminális fele, mind az FH2 domént hordozó C- terminális fele képes dimerizálódni, illetve részt vesz a dimerizációban (Otomo, Tomchick és mtsai. 2005; Rose és mtsai. 2005; Shimada és mtsai. 2004; Xu és mtsai. 2004). Ezek alapján az várható, hogy az aktin polimerizációra képtelen mutáns forma is alkothat dimert egy endogén teljes hosszúságú fehérjével, ami azonban egy inaktív heterodimer lesz, hiszen a formin aktivitás szempontjából esszenciális FH2 dimernek csak az egyik tagja lesz működőképes. Tekintve, hogy 46

48 ilyen heterodimerek képződése egyben a vad típusú fehérje termék szintjének csökkenéséhez vezet, a domináns negatív hatás érthetővé válik. A fenti adatok tehát azt igazolják, hogy a ddaam-nak a lárvális izomszerkezet és motilitás kialakításában betöltött szerepe a fehérje aktin összeszerelő aktivitására vezethető vissza. Úgy tűnik, hogy a két izom-specifikus ddaam izoforma, ha nem is teljes egészében, de részben redundáns szerepet játszik a lárvális izmok fejlődésében. A mutáns háttéren végzett kísérleteken kívül a ddaam konstrukciók vad típusú genetikai háttéren való túltermelését is elvégeztük. Figyelemre méltó módon az UAS-DAAM-PB és az UAS-DAAM-PD vad háttéren végzett izom-specifikus túltermelése a vad típusú lárvák testhosszánál szignifikánsan hosszabb lárvákat eredményezett. Az UAS-DAAM-PB-vel végzett túltermelés esetében ez az érték: 4,26±0,15 mm; n=10; az UAS-DAAM-PD-nél: 4,24±0,19 mm; n=10, szemben a vad típusnál mért 3,24±0,25 mm; n=30, értékkel. A túltermelések hatására kimutatható volt a VL3-as izmok meghosszabbodása, annak ellenére is, hogy mindkét esetben kissé rövidebb átlagos szarkomer hosszt mértünk, mint a vad típusnál (20. ábra E, G, I). Ezeknek az izmoknak a meghosszabbodásához az vezetett, hogy a szarkomerek száma szignifikánsan megnőtt a vad típushoz képest. A vad típusban a szarkomerek száma: 39,7±4,3; n=12, az UAS-DAAM-PB túltermelésnél 56±2,8; n=14, míg az UAS-DAAM-PD-nél ez az érték 54±2,5; n=12 (20. ábra J). 47

49 20. ábra A lárvális testfal izmok strukturális és funkcionális analízise. A lárvális életkor és a testhossz közötti összefüggés (A), és a lárvális életkor és mászási sebesség közti összefüggés (B) a vad típusú (fekete vonallal jelölt), és a ddaam Ex68 mutáns (szürke vonallal jelölt), lárvák esetében. A lárvális testhossz és mászási sebesség közötti összefüggés a vad típusú (C), és a ddaam Ex68 mutáns (D) lárvák esetében. A lárvális testhossz (E), mászási sebesség (F), a VL3-as izom hossza (G), szélessége (H), valamint az átlagos szarkomer hossz (I) és az össz szarkomer szám (J) adatainak ábrázolása a 100 órás AEL lárvákban a következő genotípusok szerint: wt (vad típus), Ex68 (ddaam Ex68 ), Ex68PB (ddaam Ex68 ; DMef2-Gal4; UAS-dDAAM-PB), Ex68PD (ddaam Ex68 ; DMef2-Gal4; UAS-dDAAM-PD), Ex68PB*(dDAAM Ex68 ; DMef2-Gal4; UAS-dDAAM-PBI732A), Ex68PD* (ddaam Ex68 ; DMef2- Gal4; UAS-dDAAM-PDI732A), UASPB (DMef2-Gal4; UAS-dDAAM-PB) and UASPD (DMef2-Gal4; UASdDAAM-PD). Az I-N paneleken az oszlopok átlagértékeket ábrázolnak a szórások feltüntetésével. A statisztikai szignifikancia érték: * esetén 0,05>p<0,001; ** esetén p 0,001. A vad típusú és a menekítési kísérletek adatait mindig a ddaam Ex68 mutáns adatokhoz hasonlítottuk, a kivételeket a szövegben jeleztük. A fent említett strukturális változások tehát majdnem azonosak voltak mindkét izoforma túltermelése esetén. Viszont megemlítendő, hogy míg a PB izoformát túltermelő lárvák sokkal gyorsabban mozogtak (~55%-kal gyorsabban) a vad típusú társaiknál (20. ábra F), addig a PD izoformát túltermelő lárvák mozgása csak ~5%-kal volt gyorsabb, tehát szignifikánsan nem különbözött a vad típustól (20. ábra F). Ezen kívül megfigyeltük, hogy annak ellenére, hogy a PB és PD izoformát túltermelő lárvák testhossza nem különbözött lényegesen, a PB-t túltermelő 48

50 lárvák VL3-as izma szignifikánsan szélesebb volt, mint a PD-t túltermelő lárváké. Ezek alapján a ddaam izoformák szintjének emelkedése önmagában elégségesnek tűnik a szarkomer szám megnöveléséhez, de a megfelelő szarkomer hossz eléréséhez szükség lehet a kétféle izoforma közötti együttműködésre és a kettő közötti arány pontos szabályozására is, ami erősíti azt, hogy csak részben átfedő a funkciójuk A lárvális szívcső szerkezete Drosophila lárvákban a gerincesek szívével analóg szerv a szívcső. Ez egy mezodermális sejtekből álló cső alakú képlet, amely dorzálisan az epidermisz középvonala alatt fut az A7-es szelvénytől a fej felé, és a két agyfélteke között ér véget. Az A4/A5-ös szelvényhatártól hátrafele kiszélesedő részt nevezik szívnek, ez a szívcső összehúzódásra képes része (21. ábra). Az A1- es és A7-es szelvények között a szívcső kétféle sejtből áll: a kardiális sejtekből, melyek a szívcső belső, izmos falát alkotják, és a hozzájuk csatlakozó külső, perikardiális sejtekből. A perikardiális sejteket helyhez kötött makrofágoknak tartják (Rizki és Rizki 1978). A lárvális szív falát a testtengelyhez képest spirális lefutású vékony miofibrillumokból álló réteg alkotja. A szívcső falában párosával oldalsó billentyűk (ostia) helyezkednek el, melyeken keresztül az elernyedési fázisban a hemolimfa beáramlik. Az A4/A5-ös szelvényhatártól előbbre eső keskenyebb részt aortának hívják. Az aortát a szívtől a kardiovaszkuláris billentyű választja el. 21. ábra A lárvális szívcső szerkezete Ezen a sematikus ábrán látható a szívcső és a hozzá tartozó izmok. Baloldalt a megfelelő szelvények vannak feltüntetve. Forrás: Mandal és mtsai

51 Ezen kívül, hét pár legyező alakú izom, úgynevezett szárnyas izom is kapcsolódik a szívhez. Ezek a szívtől távolodva fokozatosan vékonyodnak és végül az epidermiszben érnek véget. Szerepük a szívnek a lárvális testfalhoz való rögzítése. Kapcsolódási pontjaik a torakális (T) 3- tól az A7-esig terjedő részen a szelvényhatároknál találhatók, és egy további izom pár a szív hátulsó végét rögzíti az A7-es szelvény dorzális epidermiszéhez. Az A1-es szelvénytől előbbre az aorta egyszerű csőként folytatódik, és ott nagy valószínűséggel csak kardiális sejtekből áll. Áthalad az agyi komisszúrákon és a gyűrűmirigytől körülvéve ér véget (21. ábra) (Molina és Cripps 2001; Bate és Arias 1993) A ddaam funkcióvesztéses mutáns szívcső fenotípusa A ddaam Ex68 mutánsok lárvális szívcsövének mérete kisebb volt a vad típuséhoz képest (~40%-os átmérő csökkenés). A 100 órás vad típúsú lárvákban a szívcső legszélesebb részén mért átmérő: 100,33±7,39μm; n=9. Ezzel szemben a ddaam Ex68 mutánsokban ez az érték: 60,44±6,18μm; n=9, és a szívcső F-aktin szintje is kevesebbnek látszik (22. ábra). Számos mutáns miofibrillum vékonyabbnak tűnik a vad típusnál, és az orientációjuk gyakran eltér a normálistól (22. ábra). 22. ábra A ddaam hatással van a szívcső fejlődésére. Vad típusú (A) és ddaam Ex68 mutáns (B) lárvális szívcsövek F-aktin immunhisztokémiai festése rodamin-falloidinnal, (zölddel jelölve). A vad típushoz viszonyítva a ddaam Ex68 -as mutáns szívcsövének átmérője kisebb, F-aktin tartalma kevesebb. Ezenkívül, a mutáns miofibrillumok vad típusú megfelelőiknél vékonyabbnak tűnnek és orientációjukban is különböznek. A skála mérete: 40μm. 50

52 Ezek a megfigyeléseink azt sugallják, hogy a ddaam forminnak kulcsszerepe van a Drosophila izomfejlődésében, hatása nem csupán az IFM-re korlátozódik, hanem minden fontosabb izomtípusban és fejlődési stádiumban megnyilvánul A ddaam hiányos miofibrillumok vizsgálata A ddaam hiányos IFM szarkomerikus fenotípusa Következő lépésként immunhisztokémiai módszerekkel próbáltuk meghatározni azokat az IFM szerkezetében bekövetkezett változásokat, amik a ddaam mutánsokban a röpképtelenséget okozhatták. A vad típusú vagy a szülői kontrollként használt UH3-Gal4; UAS- Dicer2 genotípusú állatokban az IFM-ben rendkívül szabályos szarkomer szerkezet figyelhető meg. Immunhisztokémiai festéseknél rodamin-falloidin segítségével az F-aktin kötegeket lehet jelölni, míg Z-korong markerként anti-kettin ellenanyagot használtunk. A szarkomerek hosszát illetően minden esetben, az állat méretétől függetlenül, ~3,2 μm-t mértünk az adult legyek IFMjében, hímben és nőstényben egyaránt. A röpképtelen ddaam Ex1 -es mutánsok IFM-je moderált fenotípust mutatott, ahogyan ez egy gyenge hipomorf alléltól várható. Csak a miofibrillumok ~25%-ban találtunk fenotípust, itt a szarkomerek hossza ~19%-kal volt rövidebb a vad típusál, a miofibrillumok átmérője pedig ~17%-kal volt kisebb (24. ábra A). 23. ábra ddaam mutáció hatása az IFM izomrostjainak a morfológiájára. (A-B) Konfokális mikroszkópiás kép az IFM struktúrájáról a vad típusú (A) és ddaam Ex1, UDT mutáns (B) esetében. Ezeknek a szagittális tormetsze-teknek az esetében rodamin-falloidint használtunk az izmok F-aktinjának a jelöléséhez. Megfigyelhető, hogy a mutáns dorzolongitudinális izmok (DLM) rostjai rövidebbek (nyílakkal jelöltük) és vékonyabbak a vad típusnál, és az izmok egy része elsorvadt. A skála mérete: 100μm. 51

53 A ddaam Ex1, UDT IFM esetében a fenotípus súlyosbodását figyelhettük meg, kezdve az izomrostok egy részének az elsorvadásával (23. ábra B). A megmaradó miofibrillumok pedig nem csak vékonyabbak a vad típusnál (az átmérő csökkenés eléri a ~31%-ot), hanem a szervezettségüket is elvesztették (24. ábra C-C ; 25. ábra B-C ). Immunfestés alapján az F- aktin szint is csökkentnek látszik, viszont a G-aktin mennyiségében nem találtunk változást a vad típushoz képest (24. ábra D). Rodamin-falloidin festés alapján kimutattuk, hogy a vékony (aktin) filamentumok hossza nem egyenletes. A szarkomer hosszának rövidülése ezekben a miofibrilumokban elérheti a 38%-ot. Az M-vonal nehezen mutatható ki miozin immunfestés segítségével (24. ábra C), míg a Z-korongok szabálytalan és delokalizált festődést mutattak (25. ábra B-C ). 24. ábra A ddaam mutánsok IFM fenotípus komponensei. (A-A ) A röpképtelen ddaam Ex1 -es mutánsok IFM miofibrillumai nagyjából normálisnak tűnnek, csak a szarkomerek egy részének rövidebb a hossza. (2,5 μm a 3,2 μm helyett;a kettint zölddel, az aktin pirossal jelöltük). (B-C ) Vad típusú (B-B ) és a ddaam Ex1, UDT mutáns (C-C ) miofibrillumok immunhisztokémiai festése, amelyben a miozint (zöld) és az aktint (piros) jelöltük. A ddaam mutánsban megfigyelhető a károsodott miozin és M-vonal szerveződés, és a jelentős F-aktin szint csökkenés. (D) Coomassie festéssel nem találtunk különbséget a vad típusú és a ddaam Ex1, UDT mutáns IFM-ek G- aktin tartalma között. A skála mérete: 5 µm. A bábállapot kialakulásától (After Puparium Formation, APF) számított 48 órás ddaam Ex1, UDT mutánsok IFM-jében (29 C-on) már megfigyelhetőek ugyanazok a fenotípusos elváltozások, amelyeket a fiatal felnőtt állatok esetében tapasztaltunk. (Az UAS/Gal4 rendszer 52

54 hatékonysága hőmérséklet függő, ezért minden RNS interferenciás kísérletet 29 C-on végeztünk). Látható volt a szabálytalan miofibrillum szerveződés, az M-vonalak hiánya, valamint a Z-korongok rendszertelen elhelyezkedése (25. ábra E-E ). 25. ábra További ddaam mutáns IFM fenokópiák. (A-A ) A vad típusú IFM miofibrillumaiban egy rendkívül szabályos szarkomer szerkezet figyelhető meg. (B-C ) Két különböző ddaam Ex1, UDT mutáns egyedből származó miofibrillum fenokópia. Jól láthatóak az összetett szarkomer defektusok (B-C ) beleértve a csökkent F-aktin szintet (piros színnel jelölve), a szabálytalan rostvastagságot, kettin ellenanyaggal festett rendezetlen Z-korongok jelenlétét (zölddel jelölve), és a szarkomer hossz csökkenést (C-C ). (D-E ) 48 órás bábok IFM miofibrillumai vad típusú (D- D ) és ddaam Ex1, UDT mutáns (E-E ) állatok esetében. A mutáns IFM súlyos Z-korong és M-vonal szerveződési hibákat mutat. A skálák mérete: az A-C paneleken 5μm, a D-E paneleken 2 µm. Ezek alapján kijelenthetjük, hogy a ddaam fehérje hiánya az izomrostok, a miofibrillumok és a szarkomerek szintjén is szerkezetbeli változásokat okoz az izom morfológiájában A ddaam mutánsok elektronmikroszópos (EM) analízise A ddaam Ex1, UDT mutánsok elektronmikroszkópiás analízisével igazoltuk és kiegészítettük a konfokális mikroszkópia által nyert eredményeket. A hosszanti izommetszetek 53

55 elemzésével (26. ábra A-D) olyan vékony, szabálytalan alakú miofibrillumokat tudtunk kimutatni, melyek szélső részei felbomlóban voltak. Emellett a fenotípusos jegyek közül itt is az erős Z-korong defektusok, az M-vonal teljes hiánya, és a megrövidült hosszúságú szarkomerek voltak a legjellemzőbbek. Fontos megfigyelés, és ezt a konfokális mikroszkópiával készült képeken nem láthattuk, hogy a vékony filamentum rendszeren kívül a vastag filamentum rendszer szerveződése is súlyosan érintett. A vastag filamentumok ritkán párhuzamos lefutásúak, és számuk kisebb a vad típushoz képest, ugyanakkor lazább szerveződésűek (26. ábra B, D). Feltűnő módon, a vad típusra jellemző váltakozó vastag és vékony filamentumok szabályos elrendeződése helyett (26. ábra A, C), a vastag filamentumok közötti teret több vékony filamentum tölti ki, bizonyos helyeken hálózatot alkotva (26. ábra B, D). Annak ellenére, hogy a mutáns filamentumok szerveződése nagyon különbözik a vad típusétól, méretük alapján rendezetlen vékony (aktin) filamentumoknak tűnnek. Egy másik lehetőség szerint, de ennek kisebb a valószínűsége, olyan összekötő filamentumokról lenne szó, amelyek Sallimus/Kettin fehérjét tartalmaznak és a Z-korongokat kötik össze a vastag filamentumokkal a rovar indirekt repülőizomban. Szabálytalan alakú miofibrillumok láthatóak a mutáns IFM-ek keresztmetszeti képén is. A vastag filamentum csoportokat szürke színű anyag veszi körül. Egyedi vékony filamentumok ritkán fordulnak elő (26. ábra H). A vad típusú miofibrillum kristályrácsra emlékeztető szerkezete még nyomokban sem fedezhető fel. Keresztmetszeti képeken a vad típus esetében a vastag filamentumok belseje üregesnek látszik, ez alól csak az M-vonal környéke jelent kivételt, ahol sötét színűek (26. ábra G) (Reedy és mtsai. 1993). Ezzel szemben a ddaam mutánsban a vastag filamentumok keresztmetszete az esetek többségében nem tűnik üregesnek, hanem nagyon sötét színű, és emellett a vad típushoz képest szabálytalan alakú (26. ábra H). A 48 órás mutáns báb izmok EM analízisével is kimutatható volt a szarkomerhossz csökkenés (ami 54

56 elérte a 33%-os csökkenést a vad típushoz képest), az M-vonal hiány, a rosszul szerveződő filamentumok és a súlyos szerkezetbeli defektus a Z-korongok szintjén (26. ábra J). 26. ábra A ddaam mutáns IFMek elektronmikroszópos analízise. Vad típusú (A, C, E, G, I) és ddaamex1; UDT mutánsok IFMjeiről készült elektronmikroszkópos felvételek (B, D, F, H, J). Az adult IFM-ek hosszanti metszeteiről készült felvételeken látható, hogy a vad típusú (A, C) szigorúan rendezett szarkomer szerkezethez képest a ddaam mutánsok miofibrillumaiban (B, D) különböző defektusok figyelhetők meg a Zkorongok és M-vonalak szintjén, továbbá a megrövidült szarkomerekben a vékony és vastag filamentumrendszer sokkal lazábban szerveződött. A vad típusú izmok keresztmetszeti képein (E, G) az IFM-re jellemző módon egy vastag filamentumot hexagonálisan 6 vékony filamentum vesz körül. Ez a rendezettség a mutáns miofibrillumokban teljesen megszűnt (F, H). Ehelyett a mutáns rostok szabálytalan alakúak, a vastag filamentumok csoportosulásokat alkotnak, alig fedezhetőek fel egyedi vékony filamentumok. Megjegyzendő, hogy a vad típusú vastag filamentumok belseje üreges (G), míg a ddaam mutánsoké nagyon sötét színű, szabálytalan alakú, és csak nagyon ritkán üreges belsejű (H). A báb IFM (48 órás APF) hosszanti metszeti képeken (I, J), látható, hogy a vad típushoz képest (I) a mutáns izmokban (J) súlyos Zkorong és M-vonal defektusok, szarkomerhossz rövidülés és szabálytalan filamentum szerveződés van jelen. A képeken nyilakkal jelöltük a Z-korongokat, csillaggal az M-vonalakat, és m -el a mitokondriumokat A skála mérete: 500 nm. Ezek az adatok azt igazolják, hogy a ddaam mutánsokban tapasztalt izomdefektusok már az izomfejlődés korai szakaszában megjelennek. 55

57 3.3. A ddaam fehérje szarkomerikus lokalizációja A ddaam fehérjének a miofibrillumok kialakításában betöltött szerepét tovább jellemezve megvizsgáltuk annak IFM-beli lokalizációs mintázatát. Elsőként frissen kikelt adultok indirekt repülőizmában végeztünk immunhisztokémiai festéseket. A ddaam-ra specifikus ellenanyag (Matusek és mtsai. 2006) egy erős sávot jelölt az IFM szarkomereinek M- vonalhoz közeli régiójában és egy gyengébb sávot a Z-korong környékén (27. ábra C). (Ezen kívül a ddaam ellenanyag a szarkolemmát és a sejtmagokat is megjelöli.) Ez a mintázat a legkorábbi vizsgálható időponttól, a bábállapot kialakulása utáni 48 órától egészen a fiatal adult állapotig lényegileg azonos volt (27. ábra A-C). Ugyanakkor az idősödő állatokban az M-vonal környékén a festődés erőssége az idő függvényében fokozatosan csökkent, a Z-korongok környékén viszont erősödött. Ez a tendencia úgy folytatódott, hogy a kikelés után számított negyedik napon az M-vonal és Z-korong környéki sávok erőssége egyformává vált (27. ábra D). A ddaam Ex1, UDT mutánsokban, amelyek közel ddaam fehérje nullnak tekinthetők (27. ábra E), csak háttérfestődést tudtunk detektálni, ami az ellenanyag specifitását is bizonyítja. Hogy az immunfestés eredményeit kiegészítsük, egy in situ C-terminálisan EGFP-vel jelölt ddaam EGFP allélt hoztunk létre. A ddaam EGFP allél életképes és fertilis homo- és hemizigóta állapotban is, és ennek a fehérjének az expressziója az endogén szabályozó régiók ellenőrzése alatt áll. A ddaam::egfp fúziós fehérje immunhisztokémiai festése α-gfp ellenanyaggal nagyjából hasonló erősségű sávokat mutatott mind az M-vonalak, mind a Z- korongok szintjén a fiatal állatokban, a négy napos állatokban pedig a festődés erőssége csökkent az M-vonalak területén (27. ábra F, G). 56

58 Annak ellenére, hogy az α-ddaam ellenanyag az EGFP ellenanyaghoz képest különbséget mutat a korai és késői ddaam festődési mintázat között, végső soron kétféle megközelítésben sikerült igazolnunk, hogy a ddaam fehérje jelen van mindkét helyen: a Z- korongok és az M-vonalak környékén is. 27. ábra A ddaam fehérje szarkomerikus lokalizációja az IFM-ben. Vad típusú 48 órás (A-A ), 72 órás báb (B-B ), frissen kikelt adultok (C-C ) és a 4 napos adultok (D-D ) IFM-jeinek ddaam immunfestése (ciánkékkel jelölve). A ddaam fehérje az M-vonal (nyílheggyel jelölve) és a Z-korongok közelében (nyíllal jelölve), illetve a szarkoplazmában (csillaggal jelölve) lokalizálódik. Megfigyelhető, hogy míg a Z-korong közeli felhalmozódás alacsony szintű a báb és fiatal adultok IFM-jeiben (A-C), addig a 4 napos adultokban a festődés egyforma erősségű az M-vonalak és az Z-korongok szintjén. Ezzel ellentétben, a ddaam Ex1, UDT mutánsok IFM-jeiben csak egy gyenge háttérfestődést detektáltunk (a D és az E panel összehasonlítva). A frissen kelt (F-F ) és a 4 napos (G-G ) ddaam EGFP adultokban az anti-gfp egyértelmű festődést mutat a Z-korongok (nyíllal jelölve) és az M-vonal (nyílheggyel jelölve) közelében. A rodamin-falloidin festést pirossal, a Z-korong marker kettint zölddel, az antiddaam-ot (A-E ) és az anti-gfp-t (F-G ) ciánkékkel jelöltük. A skála mérete: 5 µm. Mivel a vastag és vékony filamentumok a Drosophila IFM esetében szinte teljesen átfednek a szarkomer teljes hosszában, nem tudtuk minden kétséget kizáróan megállapítani, hogy 57

59 a szarkomer közepén megfigyelt ddaam fehérje feldúsulás M-vonal asszociált, vagy a vékony filamentumok végéhez köthető, amelyek az M-vonalhoz közel érnek véget. Hogy választ tudjunk adni erre a kérdésre, egy olyan kísérleti megközelítést alkalmaztunk, amelyben a Tmod fehérje túltermelésével váltakozó mértékben megrövidült vékony filamentumok képződését idéztük elő az IFM-ben. Az UH3-Gal4/+; UAS-Tmod/+ mutáns legyekben a Tmod fehérjetöbblet meggátolja a vékony filamentumokat a növekedésben, aminek eredményeképpen ezek hossza és illeszkedése sem lesz egyenletes (a végek nem állnak szabályos regiszterben az M-vonal két oldalán) (28. ábra A, B), de az M-vonal szerveződése nem változik számottevően, amint ezt az F-aktin és Obscurin festődésből meg tudjuk ítélni (28. ábra B-B ). 28. ábra A ddaam fehérje szarkomerikus lokalizációja Tmod túltermelő mutánsok IFM-jeiben. A Tropomodulin fehérje túltermelése az UH3-Gal4/+; UAS-Tmod/+ genotípusú legyekben a vékony filamentumok megrövidülését eredményezte, melyek hossza nem egyenletes, és az illeszkedésük sem megfelelő, ahogy erre az F- aktin festésből következtetni lehet (A, B). Ezekben az IFM-ekben a ddaam festődés pontozott eloszlást mutat (nyílheggyel jelölve az A panelen), amelyek többsége a vékony filamentumok mínusz végeivel kolokalizálnak (A ). Ezekben a mutánsokban az M-vonal majdnem teljesen épnek tűnik, amennyire azt az Obscurin festés alapján meg tudtuk becsülni (B ). A rodamin-falloidin festést pirossal, az anti-ddaam-ot (A -A ) és az anti-obscurin-t (B -B ) ciánkékkel jelöltük. A skála mérete: 5 μm. Ezekben a mutáns IFM-ekben a ddaam fehérje eloszlása teljesen különbözik a vad típusútól és már nem alkot szabályos alakú sávot az M-vonal közelében. Ehelyett pontozott eloszlású festődést figyelhettünk meg, ahol a ddaam fehérjét jelölő pontok a vékony filamentumok végeivel kolokalizáltak (28. ábra A ). Ez arra utal, hogy a vad típusra jellemző 58

60 szarkomer középi ddaam fehérje feldúsulás nagy valószínűséggel az aktin filamentumokhoz való asszociációt és nem az M-vonalhoz való kötődést jelzi. Az előző konklúzióval összhangban, a fejlődő lárvális testfal izmokban (72 órával AEL után) a ddaam fehérje két különálló sávba tömörül az M-vonal két oldalán (29. ábra A). Érdekes módon, a kifejlődött lárvális miofibrillumokban viszont a ddaam fehérje legnagyobb mennyiségben már a Z-korong környékén mutatható ki (29. ábra B). Ennek a mintázatbeli változásnak a biológiai jelentősége egyelőre nem világos, de figyelemreméltó, hogy két másik izomfehérje, a SALS és a Tmod is hasonló kifejeződési mintát mutat (Bai és mtsai. 2007). 29. ábra A ddaam fehérje szarkomerikus lokalizációja a lárvális testfal izmokban. A fejlődő lárvális testfal izmokban (72 h AEL), a ddaam festődés két sávra különül el az M-vonal két oldalán (nyílheggyel jelölve az A-A paneleken). A teljesen kifejlett lárvális testfal izmokban a ddaam festődés áttevődik a Z-korongok környékére (nyílvesszővel jelölve a B-B paneleken). Csillaggal jelöltük a miofibrillumok közötti tér festődését. A skála mérete: 5μm. A lokalizációs adatok azt jelezték, hogy a ddaam fehérje a növekvő szarkomerekben olyan mintát mutat, amely teljes összhangban van a vékony filamentumok szabályozásában betöltött szerepével A ddaam fehérje kölcsönhat a vékony filamentum mutánsokkal Hogy további bizonyítékokkal szolgáljunk arra nézve, hogy a ddaam-nak fontos szerepe van a vékony filamentum rendszer kialakításában és szabályozásában, genetikai interakciós kísérleteket végeztünk az IFM specifikus aktin (Act88F KM88 ) és az izom specifikus Tropomiozin (Tm2 3 ) mutánsokkal (Karlik és Fyrberg 1985; Okamoto és mtsai. 1986). Az IFM szerkezetét 59

61 heterozigótákban vizsgáltuk vad típusú és ddaam Ex1 mutáns háttéren. Az eredményekből kitűnik, hogy az egyébként gyenge hipomorf ddaam Ex1 -es IFM fenotípust (30. ábra A) nagymértékben súlyosbítják az Act88F KM88 és Tm2 3 mutációk. 30. ábra A ddaam kölcsönhat a vékony filamentum mutánsokkal. (A) ddaam Ex1, (B) Act88F KM88 /+, (C) ddaam Ex1 ; Act88F KM88 /+, (D) Tm2 3 /+ and (E) ddaam Ex1 ; Tm2 3 /+ legyekből származó IFM miofibrillumok (az aktin pirossal, a kettin zölddel jelölt minden panelen). Megfigyelhető, hogy a szarkomer szervezettség a ddaam Ex1 (A) állatokban a vad típushoz hasonló; ugyanígy az Act88F (B) és a Tm2 (D) heterozigótákban a miofibrillumok és a Z-korongok szabályos elrendeződésűek. Ezzel szemben a ddaam Ex1 ; Act88F KM88 /+ (C), ddaam Ex1 ; Tm2 3 /+ (E) genotípusú legyek miofibrillumai rendkívül szervezetlenek. A kontrollként használt kísérletekben pedig az Act5C G0025 /+ (F), ddaam Ex1 ; Act5 C G0025 /+ (G), Tm /+ (H), és a ddaam Ex1 ; Tm /+ (I), mutánsok miofibrillumai a vad típushoz hasonló szervezettséget mutattak. A skála mérete: 5 μm. Az Act88F KM88 heterozigóták miofibrillumai vékonyabbak a vad típusénál, és néhány Z- korong nem egyenletes alakú (30. ábra B), de egyébként a szarkomer szerkezet rendezettsége fennmaradt. Ezzel szemben, a ddaam Ex1 ; Act88F KM88 / + kettős mutánsban egy szerteágazó 60

62 vékony miofibrillum hálózat figyelhető meg, amelyben a Z-korongok és a szarkomerek rendezett szerkezete teljesen megszűnik (30. ábra C). Hasonló módon, a ddaam Ex1 hemizigóta; Tm2 3 / + kettős mutánsokban a miofibrillumok szervezetlenek, a vastagságuk nem egyenletes, a szarkomerek és a vékony filamentumok hossza sem egyenletes és gyakori a nagyon rövid szarkomerek megjelenése (30. ábra E). Kontrollként az egyik legfontosabb nem-izom sejt specifikus aktin izoformának, az Act5C-nek a null mutáns formáját használtuk, a G0025-ös allélt (Fyrberg és mtsai. 1983), és a citoplazmatikus Tropomiozin (Tm1) izoforma egy erős funkcióvesztéses alléljét, a Tm et (Tetzlaff és mtsai. 1996). Az elvárt módon, ezek a mutációk nem súlyosbították a ddaam Ex1 IFM fenotípusát (30. ábra G, I). Az erős genetikai kölcsönhatás a ddaam és az IFM specifikus Act88F KM88 és Tm2 3 allélok között, valamint az interakció teljes hiánya a nem-izom típusú izoformákkal azt jelzi, hogy a ddaam fehérje funkciója az izomfejlődés során valóban a szarkomerikus aktin filamentumok kialakításához kötődik A ddaam fehérje szükséges a vékony filamentumok növekedéséhez In vitro körülmények között a ddaam fehérje FH2 vagy FH1-FH2 doménjei bona fide forminként viselkednek, vagyis rendelkeznek aktin nukleáló és a filamentumok elongációját elősegítő képességgel (Barkó és mtsai. 2010). Az a megfigyelésünk, hogy a vékony filamentumok rövidebbek a ddaam mutánsokban mint a vad típusban, arra enged következtetni, hogy a ddaam pozitív regulátora a vékony filamentum növekedésnek. Az irodalmi adatokkal összhangban, miszerint a vékony filamentumok a mínusz vég felől növekednek, a ddaam jelen van a vékony filamentumok mínusz végeinek a közelében, vagyis az M-vonal környékén. Másrészt, egy formintól elvárt módon a plusz végek közelében is felhalmozódik. Ahhoz, hogy kiderítsük, hogy a ddaam fehérjének van-e szerepe a vékony filamentumok mínusz vég felőli 61

63 növekedésében, genetikai interakciós kísérleteket végeztünk két bizonyítottan mínusz vég szabályozó fehérje mutáns alléljaival, a SALS-szal és a Tmod-dal. A SALS fehérje in vivo körülmények között elősegíti (Bai és mtsai. 2007), míg a Tmod kötődés megakadályozza a v;kony filamentumok elongációját (Littlefield és Fowler 2008). A sals f07849 / + a ddaam Ex1 es mutáns háttéren nem okozott fenotípusbeli változást. Ezzel szemben a tmod mutáció teljes mértékben szupresszálta a ddaam Ex1 mutáns gyenge röpképtelen fenotípusát, visszaállítva a vad típushoz közeli értéket (4,9 %, n=160; a vad típus esetében: 4,5%, n=454), (14. ábra A). Ez arra utal, hogy a filamentum növekedés során a ddaam és a Tmod működésüket tekintve antagonisztikus kapcsolatban lehetnek egymással. Hogy részletesebben elemezni tudjuk a ddaam/tmod kölcsönhatást, először a Tmod IFM-specifikus RNS interferenciás csendesítését vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy az izomrostok többségében a miofibrillogenezis súlyos zavart szenvedett (31. ábra A-B ), de a miofibrillumok hozzávetőleg 10%ában felismerhető volt a Z-korongok jelenléte. Itt elvégezhettük a szarkomer hossz méréseket, és kimutattuk, hogy a tmod csendesítése a szarkomer hossz 18%-os csökkenését (2.62±0.11μm; n=26) eredményezi a vad típushoz képest. Ezen kívül a szarkomerek középső régiójában - ahol normális esetben aktin nem fordul elő - vékony filamentumok jelenlétét mutattuk ki falloidin festés és EM analízis segítségével (31. ábra B, D). Továbbá, az EM analízis segítségével az M-vonal szerkezetében beállt károsodásokat is meg tudtunk figyelni. A miofibrillogenezisre gyakorolt erős hatás összhangban van az előzetes irodalmi adatokkal, melyekben kimutatták, hogy az egér Tmod1 és a C. elegans Unc-94 (tmd-1) Tropomodulin ortológok szükségesek a szarkomer összeszerelődéshez (Fritz-Six és mtsai. 2003; McKeown és mtsai. 2008; Stevenson és mtsai.2007; Yamashiro és mtsai. 2008). Viszont a szarkomer hossz csökkenés meglepő eredménynek számít, mivel előzetes adatok alapján a Tmod 62

64 funkció gátlása meghosszabbodott szarkomereket eredményezett kardiomiocita sejttenyészetekben (Sussman és mtsai. 1998), illetve Drosophila primer izomsejt kultúrákban (Bai és mtsai. 2007). Megjegyzendő azonban, hogy bár az UH3-Gal4; UAS-tmod RNSi legyek indirekt repülőizmában a szarkomer hossz rövidebb volt a vad típusénál, a vékony filamentumoknak egy része jól látható módon áthaladt a H-zóna határain (31. ábra D). Ennélfogva, az egyedi vékony filamentumok mérete hosszabb is lehet a vad típusénál, ez pedig összhangban van a Tmod ismert vékony filamentum hossz szabályozó szerepével. 31. ábra A ddaam és tmod közötti kölcsönhatás. A tmod csendesítése súlyos szarkomer szerveződési rendellenességeket okozott (A-A ), habár a miofibrillumok ~ 10%-ban az RNSi fenokópia gyengébb volt, itt felismerhetőek voltak a Z-korongok, viszont hiányzott a H-zóna (B-B ). A ddaam Ex1, UH3-Gal4; UAS-tmod RNAi legyek izmaiban a miofibrillumok többségének vad típusú volt a szarkomer szerveződése, egymástól szabályos távolságra levő Z-korongokkal és M-vonalakkal, és majdnem normális szarkomer hosszal (C-C ). (D) A tmod RNSi IFM elektronmikroszkópos felvétele. Fekete nyílhegyekkel jelöltük a szarkomer közepének azt a részét, ahol az M- vonal struktúrák nem nyilvánvalóak, de úgy tűnik, hogy a vékony filamentumok áthaladnak ezen a részen, a szaggatott vonalú négyszögnek megfelelő nagyított felvételen. Fehér nyilakkal jelöltük azokat a vékony filamentumokat, amelyek nem érnek véget a H-zónában. A skála mérete: 5 μm (A-C ); 500 nm (D) 100nm (D, nagyított felvétel). 63

65 Ahhoz hogy megvizsgáljuk, hogy a tmod RNSi fehérjeszint változásaira, a tmod csendesítést ddaam Ex1 fenotípus érzékeny-e a ddaam mutáns háttéren végeztük el. A miofibrillumok többsége (~80%) a vad típusra jellemző harántcsíkolt mintázatot mutatta jól kivehető M-vonalakkal és csak kis mértékben megváltozott alakú Z-korongokkal. A szarkomer hossz is a vad típushoz közelebb álló értéket mutatott (2.8±0.13μm; n=30) (31. ábra C-C ). Ez a fenotípus arra enged következtetni, hogy az alacsonyabb ddaam fehérjeszint szupresszálja mind az általános szarkomer szerveződési fenotípust, mind pedig a vékony filamentumok túlnövekedési fenotípusát, amelyet a tmod RNSi muslicák indirekt repülőizmában láttunk. Mindez megerősíti, hogy a két fehérje ellentétes hatással van a vékony filamentumok elongációjára, a Tmod gátolja azt, míg a ddaam elősegíti a növekedést. Habár a ddaam fehérje a szarkomerikus vékony filamentumok mínusz vége közelében is lokalizálódik, korábbi szerkezeti vizsgálatok azt jelzik, hogy a forminok kizárólag plusz vég kötő fehérjék (Xu és mtsai. 2004; Lu és mtsai. 2007; Shimada és mtsai. 2004). Ennek az ellentmondásnak az egyik magyarázata az lehet, ha a mínusz vég felőli elongáció rövid aktin fragmentumok képződésén alapul, amelyek fokozatosan, oligomerként épülnek be a plusz végükkel a Z-koronghoz rögzített növekvő filamentumokba. Ebben a feltételezett modellben (32. ábra) a ddaam rövid aktin fragmentumokat hozna létre, klasszikus plusz vég kötő fehérjeként működve, de emellett vagy aktív módon is elősegítené a fragmentumok beépülését, vagy legalábbis nem gátolná azt. 64

66 32. ábra A ddaam által mediált mínusz vég felőli elongáció modellje. (A) A rövid aktin filamentumok nukleálása és elongálása a plusz vég kötő DAAM formin típusú fehérje által. (B) A vékony filamentumok mínusz vég felőli elongációjának egy lehetséges mechanizmusa a DAAM által összeszerelt rövid aktin filamentumok (narancssárgával jelölt) vég-vég kapcsolódása a Z-koronghoz kapcsolt hosszú, meglévő filamentumokhoz (barnával jelölt). Hogy ezt a feltételezést igazolni tudjuk, egy in vitro F-aktin végillesztő aktivitási vizsgálatot végeztünk, melyben a ddaam plusz vég kötő FH1-FH2 doménjeit használtuk. Azt találtuk, hogy az FH1-FH2 domén 100 nm-os koncentrációban nem gátolta az aktin filamentumok végeinek az összeolvadását (33. ábra D), habár korábbi in vitro vizsgálatokban, hasonló körülmények között a ddaam FH1-FH2 doménjei szignifikánsan csökkentették a filamentumok plusz végeinek az összeszerelődését a pirén-jelölt aktin polimerizációs tesztben (Barko és mtsai. 2010). A korábbi vizsgálatokkal összhangban (Andrianantoandro és mtsai. 2001; Skau és mtsai. 2009), a plusz vég kötő CapZ fehérjének gátló hatása volt, a TM viszont elősegítette az aktin filamentumok vég-a-véghez illesztését, a TM és ddaam együttes hatása pedig kissé még erősebb is volt, mint a TM-é egyedül (33. ábra D). Ebből azt a következtetést vontuk le, hogy a ddaam nem gátolta, sőt kismértékben segítette a TM végillesztő aktivitását, ami meglepő adat egy plusz vég kötő fehérjétől. Fenti modellünk alapján a mínusz véghez közeli 65

67 ddaam lokalizáció bizonyos értelemben félrevezető, valójában a ddaam a mínusz vég közelében is plusz vég kötő fehérjeként viselkedik. Ebből következik, hogy a valódi mínusz vég kötő Tmod és a ddaam között valószínűleg nem lehet direkt kölcsönhatás vagy kompetíció. Ezt a feltevésünket úgy próbáltuk ellenőrizni, hogy megnéztük milyen hatással van a ddaam és Tmod fehérjék együttes túltermelése a szarkomer morfológiájára. Az IFM specifikus Tmod túltermelés a vékony filamentumok megrövidüléséhez vezetett (Mardahl-Dumesnil és mtsai. 2001) (33. ábra A ), míg a ddaam fehérjeszint növelése nem okozott számottevő változást az IFM szintjén (33. ábra B-B ). 33. ábra A ddaam plusz vég kötő fehérjeként viselkedik. (A-A ) Az UH3-Gal4; UAS- Tmod/+ genotípusú legyekben az F-aktin festés alapján a vékony filamentumok többsége rövidebbnek tűnik a vad típusnál, míg az UH3-Gal4; UAS-FLDAAM legyek miofibrillumai nem különböznek a vad típustól (B-B ). Az FLDAAM és a Tmod fehérjék egyidejű túltermelése hasonló fenotípust eredményezett, mint a Tmod önmagában való túltermelése (C- C összehasonlítva A- A -val). Az A-C paneleken a kettint zölddel, az aktint pirossal jelöltük. (D) Aktin filamentum vég-vég kapcsolódás vizsgálata sötét szürkével a 0 perces kontrolt jelöltük, amely az átlagos filamentum hosszat ábrázolja 1μM F-aktin (F-aktin) jelenlétében, világos szürkével a 60 perces inkubáció utáni átlagos filamentum hosszakat ábrázoltuk az alábbiak szerint: 1 μm F-aktin (F-aktin), 1 μm F-aktin+ 10 nm capping fehérje (F-actin+CP), 1 μm F-aktin nm DAAM-FH1-FH2 (F-aktin+DAAM), 1 μm F-aktin+ 1 μm vázizom Tropomiozin (F-aktin+TM), valamint 1 μm F-aktin+100 nm DAAM-FH1-FH2 + 1 μm vázizom Tropomiozin (Factin+DAAM+TM) jelenlétében. Az oszlopok az átlagértéket ábrázolják, melyek fölött a szórások értéke található. A skála mérete: 5 μm. 66

68 A két fehérje együttes túltermelése esetén a fenotipikus hatás megegyezett a Tmod önmagában való túltermelésének hatásával (33. ábra C-C ). Ez az eredmény jó összhangban van a feltételezésünkkel, hiszen jelzi, hogy a mínusz vég kötő Tmod fehérjével a ddaam nem képes direkt módon versengeni, ami logikus, ha modellünknek megfelelően a ddaam valójában a plusz végekhez kötődik. A fenti kísérleti adatok megerősítik elképzeléseinket a feltételezett végillesztési mechanizmusról, amelyben a ddaam fehérje által létrehozott oligomer aktin filamentumok összekapcsolódnak a növekvő filamentumok végeivel Evolúciós konzerváltság Mivel sok izom fehérje esetében magas evolúciós konzerváltságot mutattak ki, és az egér Daam1 (mdaam1) génről kimutatták, hogy részt vesz a szívfejlődésben (Li és mtsai. 2011), ezért úgy döntöttünk, hogy immunfestéses kísérletben megvizsgáljuk az mdaam1 fehérje lokalizációját 15 napos egerekből származó harántcsíkolt izommetszeten. A vizsgált izmok közül az m. tibialis anterior metszeten az mdaam1 fehérje két sávban, az M-vonal két oldalán lokalizálódott, míg az m. vastus lateralis metszeten a legtöbb fehérjét a Z-korongok környékén mutattuk ki (34. ábra A-B ). A következőkben kíváncsiak voltunk arra is, hogyan alakul az mdaam1 lokalizációs mintázata a miofibrillogenezis korai időszakában. Ehhez egy C2C12 nevű egér miogén sejtvonalat (Yaffe és Saxel 1977) és markerként α-aktinint használtunk. Az α- aktinin a miofibrillogenezis egyik korai markerének számít (Kontrogianni-Konstantopoulos és mtsai. 2006). Azokban a C2C12 sejtekben, amelyeket 24 órával az izom irányba történő differenciálódásuk után vizsgáltunk, az mdaam1 fehérjét a szarkomerek szintjén két széles sávban detektáltuk a Z-korong kezdemények (Z-testek) és az M-vonalak között (34. ábra E-E ). A 48 és 96 órás differenciálódott C2C12 sejtekben a 24 óráshoz hasonló festődési mintázatot 67

69 láttunk (34. ábra F-F ). A két, mdaam1 által jelölt szarkomerikus sáv helyének pontosabb meghatározására kettős festés használtunk, az α-titin (9D10) és az α-myomesin (B4) ellenanyagok segítségével 96 órás differenciálódott sejteken. A 9D10 ellenanyag a PEVK régiót jelöli a Titin óriásmolekulán, amely az I-sávban lokalizálódik, közel az I- és A-sáv közötti határhoz (Trombitas és mtsai. 1998; Wang és mtsai. 1988), míg a B4 ellenanyag az M-vonalat jelöli (Grove és mtsai. 1984). 34. ábra Az mdaam1 fehérje szarkomerikus lokalizációja. (A-B ) Egér izom metszetek mdaam1 (ciánkékkel jelölve) immunfestése (a Z-korong marker α-aktinin pirossal jelölt). A m.tibialis anterior szarkomereiben az mdaam1 fehérje az M-vonal két oldalán (A-A ), míg a m vastus lateralis-ban többnyire a Z-korongok környékén lokalizálódik (B-B ). A 96 óráig differenciáltatott C2C12 sejtekben az mdaam1 immunfestés (ciánkékkel jelölve) a szarkomer közepén két széles sávot ad, melyek nem fednek át a Titin festődéssel (sárgával jelölt; 9D10 ellenanyag) (C-C ) sem az M-markernek tekintett miomezin sávokkal (zölddel jelölve) (D-D ). (E-F ) Az mdaam1 (ciánkékkel jelölt) és az α-aktinin (pirossal jelölt), festődési mintázata a 24 (E-E ) és 96 óráig (F-F ) differenciáltatott C2C12 sejtekben. A skála mérete: 5 μm (A-D ); 15μm (E-F ). 68

70 Azt találtuk, hogy az mdaam1 festődés szignifikáns mértékben nem fed át egyik sávval sem, amit az előbb említett ellenanyagok jelölnek (34. ábra C-D ), jelezve, hogy az mdaam1 fehérje nagy része az M-vonal és az I-A határvonala között halmozódik fel, abban a régióban ahol a vékony és vastag filamentumok átfednek egymással. Ezek alapján az mdaam1 fehérje szarkomerikus lokalizációjával kapcsolatban két fontos következtetést vonhatunk le. Egyrészt, az izom specifikus különbségeket leszámítva, az mdaam1 szubszarkomerikus lokalizációja alapvetően megegyezik a Drosophila DAAM fehérjéével a Z- korong és M-vonal környéki lokalizáció vonatkozásában. Másodsorban, az mdaam1 a szarkomer kezdeményekben ugyanolyan korán jelenik meg, mint az aktin keresztkötő α-aktinin, ami összhangban van azzal az elképzelésünkkel, hogy ennek a forminnak korai szerepe van a miofibrillogenezis során A ddaam és a miozin közötti kölcsönhatás Azon kívül, hogy a ddaam fehérjének meghatározó hatása van a vékony filamentumok növekedésre, az EM analízis egy további, részben meglepő eredménnyel is szolgált, miszerint a ddaam hiány a vastag filamentumok alakját és szerveződését is befolyásolja. Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy a ddaam-ra az aktin szabályozó szerepén kívül szükség lehet a vastag filamentumok szerkezetének a kialakításában és/vagy az aktin és miozin filamentum rendszerek összehangolt felépítésében a rendezett szarkomer struktúrán belül. Hogy a ddaam és a miozin közötti lehetséges kölcsönhatást ki tudjuk mutatni, ismét a ddaam Ex1 -es hipomorf mutáns hátteret használtuk genetikai interakciós vizsgálatokhoz. Izomspecifikus miozin nehéz lánc mhc mutánssal, és a zipper (zip) nem-izom miozin izoformát kódoló alléllal is megvizsgáltuk a kölcsönhatást. Azt találtuk, hogy az mhc 1 vagy zip 2 heterozigóta formában nem befolyásolta szignifikánsan az életképességet, viszont a ddaam Ex1 ; mhc 1 /+ és a ddaam Ex1 ; 69

71 zip 2 /+ mutáns hímek életképessége erősen lecsökkent (2.7% illetve 8.1%-os a túlélő hímek aránya az ugyanabból a keresztezésből származó nőstény állatok számához viszonyítva). A ddaam Ex1 ; zip 2 /+ felnőtt túlélő állatok röpképessége nem változott, és ennek megfelelően az indirekt repülőizmuk szerkezete is a vad típuséhoz volt hasonló. Ezzel ellentétben a ddaam Ex1 ; mhc 1 /+ állatok röpképtelenek, ahogy az mhc 1 /+ heterozigóta mutánsok is azok. Az mhc 1 /+ heterozigóták indirekt repülőizmában szerkezeti hibákat mutattunk ki, mint például a miofibrillum átmérőjének és a szarkomer hossznak a csökkenését (a szarkomer hossz csökkenés elérte a ~22%-ot), részben rendezetlen struktúrájú Z-korongokat, és szétváló izomrostok jelenlétét (35.ábra A-A ) (Beall és mtsai. 1989; O'Donnell és Bernstein, 1988). A fent említett fenotípusos elváltozások súlyosbodtak amennyiben az mhc 1 allél ddaam Ex1 -es háttérre került. Különösen a Z-korong szerveződés volt rosszabb, mint az mhc 1 /+ heterozigótában, a szarkomer hossz csökkenés pedig gyakran elérte a 37%-ot, és a miofibrillumok általános szerveződése is sokkal lazább volt mint az mhc 1 /+ heterozigótáknál általában (35.ábra B-B ). Érdekes módon, az Act88F km88 mutáció, a ddaam-mal ellentétben, dominánsan szupresszálja az mhc 1 /+ izom fenotípust (Beall és mtsai. 1989). Ha a ddaam összes izommal kapcsolatos funkciója kizárólag csak az aktin szabályozáshoz kötődne, nem lenne várható egy ilyen, az aktin mutánssal ellentétes hatás az mhc interakció vonatkozásában. Ezért az életképességet és az izomszerkezetet érintő, az mhc és a ddaam közötti domináns genetikai kölcsönhatás arra utal, hogy a ddaam az MHC fehérjével összehangoltan működik az izomfejlődés során, és úgy tűnik, hogy ez a kölcsönhatás a ddaam aktin szabályozó funkciójától független. Ráadásul, említésre méltó, hogy a ddaam Ex1 ; zip 2 /+ kettős mutánsok csökkent életképessége is a legjobban azzal magyarázható, hogy a miozin/ddaam kölcsönhatás a nemizom sejtekben is fontos szerepet játszik. A ddaam/mhc kölcsönhatást tovább elemezve 70

72 megvizsgáltuk a ddaam fehérje lokalizációját az Act88F mutánsok IFM-jében. Az Act88F km88 homozigóta mutánsok IFM-jéből teljesen hiányoznak a vékony filamentumok (Beall mtsai. 1989), ennek ellenére nem találtunk csökkenést a ddaam fehérje szintben az Act88F km88 /Act88F km88 mutáns indirekt repülőizmokban (35. ábra E). 35. ábra A ddaam és a miozin közötti kölcsönhatás. (A-A ) Az mhc 1 /+ legyek IFM-jeiben a szarkomer hossz csökkenés elérte a ~22%-ot, és a Z-korongok struktúrája is részben érintett. Ezek a fenotípusos elváltozások súlyosbodtak a ddaam Ex1 ; mhc 1 /+ legyekben (B-B ). A szarkomer hossz csökkenés itt elérte a 37%-ot. A Z-korong szerveződés gyengébb, a miofibrillumok általános szerveződése pedig sokkal lazább volt. A vad típusú IFM-ben a ddaam a már említett módon, a Z-korongok, az M-vonalak környékén és a szarkoplazmában egyaránt lokalizálódik (C-C ). Az Act88F null homozigóta mutánsok IFM-jében, melyekből teljesen hiányoznak a szarkomerikus vékony filamentumok, a ddaam fehérje viszont az izomrostokkal asszociált formában marad, és egy részleges kolokalizációt mutat a miozinnal (D-D ). (E) A Western blot analízis segítségével nem találtunk különbséget a vad típusú és az Act88F null homozigóta mutáns IFM-ek ddaam fehérje szintje között. A skála mérete: 5 µm. Ezen túlmenően, a ddaam fehérje asszociált maradt a kialakuló izomrostokkal, amelyek az Act88F hiányában képződtek, és ahelyett hogy a festődése egyenletes vagy teljesen véletlenszerű lenne, a fehérje pontozott illetve sávozott eloszlást mutatott az izomrostokban. Ez jelezte, hogy ezeknek a rostoknak a szerveződése nem szűnt meg teljesen, és ezek mentén még mindig léteznek ddaam kötőhelyek (35. ábra D). 71