Történeti áttekintés. Eukarióta. Prokarióta. A citoszkeletális rendszer. Motorfehérjék. A biológiai mozgás molekuláris mechanizmusai.

Átírás

1 A citoszkeletális rendszer. Motorfehérjék. A biológiai mozgás molekuláris mechanizmusai. Előadásvázlat TK oldal citoszkeleton története polimer mechanika vizsgálómódszerek polimerizáció aktin 10 perc szünet LEHETSÉGES releváns szigorlati tételek A citoszkeletális rendszer. Citoszkeletális filamentumok polimerizációja. Az aktin filamentális rendszer. Aktinfüggő mozgások. Kiss Balázs MTA-SE Molekuláris Biofizikai Kutatócsoport, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet február 19. mikrotubulusok intermedier filamentumok motorfehérjék típusok munkaciklus animációs bemutató A mikrotubuláris rendszer. Mikrotubulus-függő mozgások. Az intermedier filamentális rendszer. Motorfehérjék. Munkaciklus. Processzivitás. 2 Történeti áttekintés régi megközelítés: Prokarióta Eukarióta sejt: kolloidális rendszer membránhoz kapcsolt képletek, organellumok citoszkeleton: 1-2% térfogatarány a sejten belül? nagy nevek : Nyikolaj Koltszov (1903): tubuláris fehérjehálózat: sejt alakja Rudolph Peters (1929): fehérje-mozaik: biokémia Paul Wintrebert (1931): cytosquelette 3 prokarióta citoszkeleton : analóg az eukarióta citoszkeletonnal 4

2 A citoszkeleton eukarióta sejtek dinamikus vázrendszere nagy vég-vég távolság (= filamentum ): hálózatképzés már kis koncentrációban is A citoszkeleton filamentumai (fluoreszcencia-mikroszkópiával láthatóvá téve) VÉKONY (aktin) INTERMEDIER MIKROTUBULUS három fő filamentum-osztály: A. vékony (aktin) (d ~ 7 nm) B. intermedier (d ~ 10 nm) C. mikrotubulus (d ~ 25 nm) + asszociált fehérjék polimerizáció: monomer alegységekből Mikrotubulus Aktin szerep: A. mozgás, alakváltozás B. mechanikai stabilizálás C. sejtosztódás, transzport DNS Aktin (rodamin-falloidin) Vimentin (anti-vimentin) Mikrotubulusok (GFP-tubulin) 5 6 Polimer mechanika: Hooke-rugalmasság Polimer mechanika: FJC, WLC a rugóállandó (D = F/ l) nem csak anyagfüggő Hajlítómerevség: l Freely Jointed Chain Worm-Like Chain a rugóállandó (D) függ a test alaki paramétereitől, az erő irányától s R R Longitudinális merevség: A l D E: rugalmassági modulus (Young-modulus) F F D θ: hajlítási tehetetlenségi nyomaték Torziós merevség: Φ D G: torziómodulus M 7 elemi vektorokból (N db, irányukat tartó kis egységből) felépülő polimer l = korrelációs hossz (az elemi vektorok átlagos hossza) Nl = L = kontúrhossz R = vég-vég távolság L p = perzisztenciahossz (milyen hosszú szakaszon belül tartja meg irányát a molekula) cosφ p () s = e s s L ϕ(s) ha s<<l p : cos(ϕ)~1, és ϕ(s)~0 ha s>>l p :cos(ϕ)~0, tehát φ(s) 0 és 360 közötti 8

3 Kitérő: Brown-mozgás 1 3 mv 2 = kbt (ideális gázokra) 2 2 A különböző sebességgel mozgó kis részecskék (fekete molekulák) ütközése következtében a nagyobb, sárga részecske rendezetlen véletlenszerű mozgást végez. Kitérő: Entrópia ld.: termodinamika blokk később a szemeszter során a rendezetlenséget / adott állapot termodinamikai valószínűségét jellemzi termikus gerjesztés munkavégzés L Polimer mechanika: termikus rugalmasság p EΘ = k T B merev lánc L p >> L szemiflexibilis lánc L p ~ L rugalmas lánc L p << L Θ : hajlítási tehetetlenségi nyomaték (másodrendű nyomaték) - körkeresztmetszetű rúd esetén: Θ=r 4 π/ Mechanikai vizsgálómódszerek (sejtmagra, sejtre alkalmazhatók) A polimerizáció szakaszai 1. Lag fázis: nukleáció 2. Növekedés fázisa 3. Equilibrium (egyensúly) fázisa szubsztrát nyújtása Polimer mennyiség equilibrium (egyensúly) aspiráció mikropipettával aktív- növekedés passzív- AFM mikroreológia 11 lag Idő 12

4 1. valódi equilibrium: Polimerizációs egyensúlyok Erőkifejtés a polimerizációval (Brown-féle kilincskerék vagy racsnis kerék) 2. dinamikus instabilitás: folyamatos, lassú növekedést követő katasztrofális depolimerizáció 3. treadmilling: taposómalom m beépülő monomer csak akkor működőképes, ha T 1 >T 2 polimer részecske a sejtben aktin: összfehérje 5%-a (eukarióta sejtekben), Aktin monomer (G-aktin) nukleotidkötő zseb Aktin filamentum (F-aktin) alegység: globuláris (G) aktin, 43 kda molekulasúly, 4 szubdomén (kovalens kötésekkel kapcsolódnak) Koncentrációja a sejtben: 2-8 mg/ml ( μm): 25 nm átlagos molekulák közötti távolság, ha oldatban lennének szerkezete, tulajdonságai: ~7 nm vastag, hossza in vitro több 10 µm, in vivo 1-2 µm; jobbmenetes dupla hélix; balmenetes alacsony emelkedésű hélix, szemiflexibilis polimerlánc (L p : ~10 µm), szöges (+) vég hegyes (-) vég 1 molekula kötött adenozin nukleotid (ATP vagy ADP). szerkezeti polarizáció: szöges vég: +, hegyes vég: - 15 aszimmetrikus polimerizáció: ATP sapka (a + végen). ATP sapka 16

5 Aktin nukleációját szabályozó fehérjék Aktin filamentum előfordulása nukleáció: trimer kialakulása spontán nukleáció valószínűtlen (az aktin dimer instabil) Arp2/3: egy dimert/trimert utánoz, elágazások létrejöttéért felelős Spire: 4 alegységet stabilizál hosszanti irányban Formin: dimerizálva aktin dimert vagy trimert stabilizál, + végen marad ( formin sapka ) cortex (a sejt pereme), stresszrostok: keresztkötött aktinháló motorfehérjékkel (korábbi elképzelés: feszülés hatására jelenik meg); mechanikai erő az adhézióhoz sejtnyúlványok: lamellipodium: álláb : 2D aktinháló a sejt mobilis oldalán, a sejtet hajtja előre, filopodium: fokális adhéziót alakít ki a felülettel, mikrovillus: a sejt fajlagos felületét növeli; adszorpció; jelátvitel 17 stresszrostok cortex filopodium 18 Aktin-vezérelt sejtmozgás Baktériumok intracelluláris mozgása (az aktinhálózatot használják a közlekedésre ) baktérium: kötőfehérje: 1. protrusio (sic): aktin polimerizáció és álláb kitüremkedés 2. letapadás: fokális kontaktusok (integrinek és aktinkötegek) 3. tractio + retractio 4. az álláb további növekedése 19 Listeria monocytogenes WASP + Arp2/3-funkcionalizált mikrogyöngyök 20

6 Aktin, mint orvosi célpont vegyület célpont kórkép / alkalmazás falloidin (gyilkos galóca) cytochalasin (chalasis: relaxáció) latrunculin (hatásmechanizmus: aktin dinamika gátlása) F-aktint köt, depolimerizációt gátol monomer beépülést gátol aktin monomer (nukleotidkötő-zseb) gombamérgezés kísérleti daganatterápia kísérleti daganatterápia A mikrotubuláris rendszer alegység: tubulin (α- és β-tubulin), ~ 50 kda idegszövetben az összfehérje 10-20%-a 1 kötött guanozin nukleotid (GTP vagy GDP) / alegység a nukleotid lehet kicserélhető (β), illetve nem kicserélhető (α) A mikrotubulus A mikrotubulusok dinamikája, előfordulása -vég α β + vég katasztrófa megmentés Hol található az eukarióta sejtben? interfázisos sejt citoplazmája, axon, cilium, flagellum, osztódó sejt húzóorsója. ~25 nm vastag, üreges, helikális interfázisos sejt osztódó sejt 13 protofilamentum a filamentum tengelyében merev polimerlánc (L p : néhány mm!) balmenetes hosszú szerkezeti polarizáció: cilium idegsejt +vég: polimerizáció gyors, β-alegység zárja le -vég: polimerizáció lassú, α-alegység zárja le jobbmenetes rövid GTP-sapka 23 24

7 A mikrotubulusok elhelyezkedése, funkciója Polaritás a sejten belül: centroszómában -vég, a periférián +vég, centroszóma: 2 centriólum, centroszóma mátrix, benne γ-tubulin, sejt polaritás fenntartása asszociált fehérjék segítségével. Mikrotubulus, mint terápiás célpont (hatásmechanizmus: MT dinamika gátlása) vegyület célpont kórkép / alkalmazás vinblasztin mikrotubulus + vége daganatok kolhicin tubulin dimer köszvény paclitaxel mikrotubulus belseje daganatok Funkciók: 1. autópályák motorfehérjék számára, 2. érzékeli, monitorozza és megtalálja a sejt geometriai középpontját, 3. motilitási funkciók (sejtosztódás) Intermedier filamentumok 8-10 nm átmérő kémiailag ellenálló fibrózus monomer, polimerizáció ATP/GTP nélkül a szövetspecifikus monomerek egymástól a végeik szerkezetében különböznek: Intermedier filamentumok polimerizációja a sejtben többnyire teljesen polimerizált állapotban vannak, nem mutatnak polimerizációs-depolimerizációs dinamizmust, foszforiláció hatására depolimerizálódhatnak. hám izom kötőszövet glia ideg keratinok dezmin vimentin gliális fibrilláris savanyú fehérje neurofilamentum Intermedier filamentum dimer: Fej 1A 1B 2A 2B Farok 2 μm 27 28

8 Intermedier filamentum nyújtása (dezmin) Az intermedier filamentumok feltételezett szerepe: mechanikai stabilizálás nemlineáris rugalmasság: nagy erők esetén felkeményedés polimer hálózat: terhelésre merőlegesen összehúzódás Δs ~ molekulahossz Δd ~ erő 500 nm erő aktin IF MT 29 megnyúlás 1 Pa = 10 dyne/cm 2 30 Intermedier filamentumok szöveti funkciói epiteliális (hám-) sejtekben: kórkép: epidermolysis bullosa simplex. Enyhe mechanikai hatásra (pl. dörzsölés) fellépő hólyagos hámszétesés. oka: mutáció a keratin génben Érdekesség: prokarióta citoszkeleton sejtosztódás sejt polaritása alak eukarióta tubulin aktin intermedier filamentum prokarióta FtsZ MreB CreS szívizomban: kórkép: cardiomyopatiha (szívizom-elfajulás) oka: mutáció a dezmin génben 31 32

9 elmozdulást előállító, ciklikusan működő erőgép E x : Motor E x W mechanikai energia kémiai energia villamos energia hőenergia Motorfehérjék nemegyensúlyi rendszerek (kémiai reakcióhoz csatolt elmozdulás irányított) sebesség: μm/s lépésnagyság: nm erő: 1-60 pn üzemanyag : ATP vagy egyéb makroerg vegyület hidrolízise, (polimerizációhoz kapcsoltan is): 54 kj/mol energia = 22 k b T hatásfok: % (!!!) 33 A motorfehérjék típusai 1. Aktin alapú: miozinok: konvencionális (miozin II) és nem-konvencionális; miozin szupercsalád (I-XXIV osztályok), plusz vég irányába mozognak. 2. Mikrotubulus alapú: dineinek: ciliáris (flagelláris) és citoplazmatikus típusok; -vég irányába mozognak. kinezinek: kinezin szupercsalád: konvencionális és nem konvencionális; +vég irányába mozognak. dinaminok: MT-függő GTP-áz aktivitás; biológiai szerep: vakuoláris fehérjeválogatás 3. DNS alapú mechanoenzimek: DNS és RNS polimerázok, vírus kapszid csomagoló motor; a DNS fonal mentén haladnak és fejtenek ki erőt. 4. Rotációs motorok: F1F0-ATP szintetáz, bakteriális flagelláris motor. 5. Mechanoenzim komplexek riboszóma 34 A motorfehérjék munkaciklusa 1. A motorfehérjék munkaciklusa 2. N-terminális: globuláris fej: motordomén (nukleotidot köt és hasít), citoszkeletális polimer kötőhelye ATP hidrolízis ciklus kapcsolt τ on C-terminális: működést biztosító kötőhely szoros csatolás: 1 ciklusban 1 ATP hidrolizálódik munkacsapás δ = munkatávolság munkaciklus-arány (r): csúszási sebesség: ciklusidő: r = τ v = on δ τ on τ total = τon + τ 1 V off τ = τ kapcsolt idő: on total τ on δ = v r = δ=munka- vagy lépéstávolság; V=ATP-áz sebesség; v=motilitási sebesség δv v szétkapcsolt τ off konformációváltozás ideje: ~µs kapcsolás visszacsapás szétkapcsolás 35 Processzív motor: r ~ 1 pl. kinezin, DNS, RNS-polimeráz egymaga képes a terhét továbbítani Nem processzív motor: r ~ 0 pl. miozin sokaság működik együtt 36

10 Nem-processzív motorok: miozin-ii Pihenő: mi alapján készülnek az animációk? aktin miozin szélső mikrogyöngy elmozdulása idő sokaságban dolgozó miozin molekulák: vastag filamentum 200 nm lépéstávolság: 5,5 nm (szomszédos aktin alegységek közötti távolság) szintetikus vastag filamentum AFM felvétele 37 EM krisztallográfia 38 Processzív motorok Nukleinsav-alapú motorok miozin-v séta az aktinon: nagy sebességű AFM felvétel: 36 nm lépéstávolság RNS polimeráz: transzkripció állandó sebességgel, majd pihenés kinezin: 8 nm-es lépéstávolság (minden második tubulin alegység közötti távolság) dinein: sztochasztikus és koordinált lépegetés ( részeg tengerész ) 39 portális motor: bakteriofág vírus DNS-t teker fel a kapszidba 40

11 Rotációs motorok F1F0 ATP szintetáz bakteriális flagellum motor Köszönöm a figyelmet! diszkrét, 120 -os fordulatok: fordulatszám: > rpm teljesítmény: W hatásfok: > 80% energiaforrás: protonok 41 42