Rövid anyagtudomány. Biomolekulák és sejtek mechanikai tulajdonságai ÉL SEJT: MOLEKULAGÉPEZETEK SOKASÁGA MIÉRT EGYEDI MOLEKULÁK?

Átírás

1 Egészségügyi Mérnök MSc ÉL SEJT: MOLEKULAGÉPEZETEK SOKASÁGA Biomolekulák és sejtek mechanikai tulajdonságai Tovacsúszó keratinocita Mikrotubulus dinamikus instabilitás Kellermayer Miklós Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Vevikulum transzport kinesinnel Fehérjeszintézis riboszómán 1. Térbeli kiátlagolódás kiküszöböl dik párhuzamos útvonalakon haladó folyamatok, pl. fehérjegombolyodás 3. Biomolekuláris mechanika Molekuláris rugalmasság, motorfehérje funkció G MIÉRT EGYEDI MOLEKULÁK? Konformációs tér Kitekeredett állapot Natív állapot Kinesin motorfehérje 2. Id beli kiátlagolódás kiküszöböl dik Sztochasztikus folyamatok, pl. fluorofór pislogás GFP pislogás (Moerner) 4. Egyedek azonosítása, követése sokaságban Térbeli és id beli transzport útvonalak (pl. víruspartikulumok celluláris mozgása, citoszkeletális filamentumok dinamikája) Jel (a.u.) Id (s) GFP Egyedi mikro- Tubulusok (Borisy) A Rövid anyagtudomány Húzás L Merev testek rugalmassága 1 F A = E L L F=er A=keresztmetszet E=Young-féle modulus L=megnyúlás L=kiindulási hossz = F A Húzófeszültség F = L L Fajlagos megnyúlás Anyag Young modulus (GPa) Gyémánt 12 Acél 211 Üveg 73 Plexi 3 Gumi.2 Selyem 5-1 Keratin 2.4 Aktin 2.3 Kollagén 2 Tubulin 1.9 Elasztin.2 = F L Rugóállandó Bakteriofágból kiszabadult DNS Aktin "speckle" mikroszkópia (Small)

2 Rövid anyagtudomány 2r Merev testek rugalmassága 2 Hajlítás (lehajlás) F = 4 3 Er 4 L 3 F=er =hajlítási rugóálandó E=Young-féle modulus r=sugár L=kiindulási hossz Rövid anyagtudomány Termikus (entropikus) rugalmasság termikus gerjesztésre a polimerlánc random, ide-oda hajló fluktuációkat végez n a lánc konformációs entrópiája (elemi vektorok orientációs entrópiája). Termikus rugalmasság 1 Az entropikus lánc alakja és rugalmassága FL ( p R k B T ~ R 2 ) átlag = 2L p L L Korrelációs hossz Vég-vég távolság (R) Er (F) = F A Húzófeszültség = L L Fajlagos megnyúlás = F L Rugóállandó F=er L p =korrelációs hossz (perzisztenciahossz, mely a hajlítómerevséget jellemzi) k B =Boltzmann állandó T=abszolút h mérséklet L=kontúrhossz R/L=relatív megnyúlás Rövid anyagtudomány Termikus rugalmasság 2 HOGYAN FOGJUNK MEG EGY MOLEKULÁT? Lézerfénnyel!? Merev lánc L p >>L Mikrotubulus Szemiflexibilis lánc L p ~L Aktin filamentum Flexibilis lánc L p <<L Titinmolekula StarTrek Enterprise rhajó a vontató lézernyaláb ( tractor beam ) fogságában. L p = perzisztenciahossz (hajlítómerevséget jellemzi) L = kontúrhossz

3 MOLEKULA - FOGANTYÚ GEOMETRIA HOGYAN RAGADJUNK MEG EGY MOLEKULÁT? Például "molekulahegesztéssel"! Fotoreaktív keresztköt k mikrogyöngy ~ 1 m Nem-specifikus Fotoreaktív N 3 (azid) csoport UV megvilágítás molekula ~ 1 nm HOGYAN MANIPULÁLJUK A MOLEKULÁT? Belép fénynyaláb P1 Lézercsipesszel! Polistirol mikrogyöngyök lézercsipeszben Fénytör mikrogyöngy szabad mikrogyöngyök P 2 F= P/ t P F Fénytör mikrogyöngy Lézer Mikroszkóp objektív F Grádiens er EGYENSÚLY megfogott mikrogyöngy Szórási er (fénynyomás)

4 Polistirol mikrogyöngyök lézercsipeszben A lézercsipesz virtuális rugó "Pikotenziométer" F = K x x nanométer tartomány K.1-1 pn/nm F pikonewton tartomány CSOMÓKÖTÉS MOLEKULAFONÁLRA MEKKORA ER KELL A MOLEKULANYÚJTÁSHOZ? Anélkül, hogy a fonál végeit elengednénk! A lézercsipesszel er t is lehet mérni! Aktin filamentum DNS Lézer fókusz Kétsugaras lézercsipesz berendezés Lézercsipesz Lézer #1 Lézer #2 molekula MCP CCD Fluor. Latex gyöngy CCD Megvilágítás Fluor. Exc. Arai et al. Nature 399, 446, Mozgatható mikropipetta

5 EGYEDI MOLEKULÁK MECHANIKAI MANIPULÁLÁSA AFM történelem "Rugólapka alapú" módszer: atomer -mikroszkóp (AFM) Lézernyaláb kitérés "Mez alapú" módszer: lézercsipesz Lézer fókusz Oxigén atomok rhodium egykristály felületén Lézer molekula Rugólapka elhajlás = F/k Latex gyöngy z Kellermayer, Physiol. Meas. 26, R119, 25 molekula Mozgatható mikropipetta Kett s szálú DNS molekula megnyújtása Richard P. Feynman: There is plenty of room at the bottom december 29. a "nanovilág" léptéke: 1 nanométer AFM mint pásztázó szondás mikroszkóp AFM Rugólapkák és hegyek Lézernyaláb kitérés Lézer Rugólapka pásztázás molekula 5 nm 5 nm 2 nm

6 Atomer mikroszkóp (Atomic Force Microscope = AFM) Piezoelektromos hatás fotodetektor bakteriorodopszin DNS Inverz piezoelektromos hatás Piezoelektromosság (Pierre és Jacques Curie, 188): "nyomáselektromosság" rugólapka lézer Direkt piezoelektromos hatás: bizonyos kristályokban mechanikai deformálásra fellép elektromos polarizáció (P): minta Inverz piezoelektromos hatás: bizonyos kristályokban potenciálkülönbség hatására fellép deformáció: DNS titin Pásztázó t szondás mikroszkópia (Scanning Probe Microscopy = SPM) Rugólap méretei 1-4 μm,3-2 μm 1-2 μm

7 Rugólapkák készítése AFM alapok Pásztázó képalkotás Emberi hajszál fotodetektor rugólapka lézer 2 m Oszcillációs vezérl jel rugólapka Detektált jel minta Magasság kontraszt Amplitudó kontraszt Fázis kontraszt Képalkotási módok Oszcillációs mód biológiai minták esetében ideális. Kontakt mód Ideális képalkotás feltételei Felszín: kösse a mintát Nem specifikus kötés: csillám, grafit. Specifikus kötés: keresztköt kkel (amino-, carboxil-, SH-csoportok) Amplitudó Z-piezo: vertikális mozgatás f=5-4khz A felszín legyen sima (lehet leg atomi simaságú csillám, grafit) Rugólap: legyen kell en flexibilis, k 5,3 N/m. Rugólap t je: nem alakulhat ki er s interakció a minta és a t között átmér je legyen minél kisebb : 5-8nm. Minta: legyen minél laposabb ne legyen viszkózus Az AFM hátrányai A t a felszínt követi, konstans amplitudó mellett. Id felbontás: perces nagyságrendbe esik Csak felszínhez kötött minta vizsgálható Csak felszínen zajló folyamat követhet nyomon

8 Képalkotási hibák, felbontás Béta-amyloid fibrillumok DNS HeLa sejtek Vvt kenet Fibrin hálózat

9 Képek: ATP-szintáz Képek: endotél sejtek Nanolitográfia Lithos: k, gráfia: rajzolni Nanolitográfia fotodetektor lézer rugólapka felszín Pablo Picasso: "Don Quixote" polikarbonát felszínbe rajzolva 1 μm

10 Nanolitográfia Szekvenciális két-hullámhossz STIRF-AFM Height Amplitude Actin Cytokeratin 1 m Pancreas carcinoma cells 1 m El tt Lágy minta manipulációja STIRF- AFM segítségével Sejt abláció Után Filamentum hasítás El tt Után Molekulanyújtás atomer mikroszkóppal alapelvek * * * 1 m 5 m

11 Termikus rugólapka-kalibráció Termikusan gerjesztett rugólapka: harmonikus oszcillátor TITIN: MOLEKULÁRIS RUGÓ AZ IZOMSZARKOMERBEN Izomköteg m K = m Kx2 = 1 2 k B T Izomrost Szarkomer Miofibrillum Rezgés (Amplitudó) 2 Termikusan gerjesztett rugólapka kitérésének Fourier spektruma Z Vékony filamentum M Vastag filamentum Z Ig-domén (7-szálú ß-hordó) Titin I-szakaszbeli szegmens tandem Ig-régió PEVKdomén tandem Ig-régió Frekvencia (khz) DOMÉNSZERKEZET A TITINBEN Ig domén PEVK szegmens egyedi szekvenciák Az er hiszterézis elt nik kémiailag denaturált molekulában 8 szívizom N2-B I1 I15 N2-B I27 I84 I15 NH 2 COOH 7 6 GuCl 4 M GuCl vázizom (soleus) NH 2 I1 I15 konstitutívan expresszálódó tandem Ig régió I27 I79 N2-A PEVK I84 I15 differenciálisan expresszálódó tandem Ig régió I55-62 I II III Klónozott és mechanikailag manipulált titin fragmentumok konstitutívan expresszálódó tandem Ig régió COOH Molekulahossz (μm)

12 TITIN NANOMECHANIKA ATOMER -MIKROSZKÓPPAL TITIN NANOMECHANIKA Egyedi molekula er spektroszkópia Er -f részfogak: mechanikailag stabil domének nem-kooperatív kitekeredése Er mérés AFM-mel Egyedi molekula er spektroszkópia Kitérés 5 Lézer Megnyúlás ( m) Rugólapka Titin üveg Er = x x Vég-vég távolság Megnyúlás ( m) 1 A titin muzsikája Megnyúlás (nm) Kellermayer et al. BBA 164, 15, 23 Molekuladinamika szimuláció, K. Schulten Doménkitekeredés hangspektruma Megnyúlás (nm) REKOMBINÁNS TANDEM-IG FRAGMENTUM MECHANIKÁJA REKOMBINÁNS PEVK FRAGMENTUMOK MECHANIKÁJA Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje E k off Fx ß Tranziciós állapot AFM rugólapka A PEVK domén elektrosztatikusan hangolható molekula-teleszkóp 2 pn L 5 nm L = 29,8 ± 3,5 nm Grama et al. Croat. Chem. Acta 78, 45, Gyakoriság Natív állapot x ß Kitekert állapot Reakció koordináta Kitekeredési er (pn) Er Force (pn) (pn) Nagy et al. Biophys. J. 89, 329, 25. Au S PEVK szegmens His 6 Glymo-NTA-Ni PEVKI Reverzíbilis nemlineáris er válasz Megnyúlás Extension (nm) (nm) Effective persistence length (nm) Effektív perziszenciahossz (nm) Lp PEVKI Lp PEVKII Lp PEVKIII Ionic strength (mm) Ioner sség (mm)

13 AMILOID FIBRILLUMOK NANOMECHANIKÁJA AZ AMILOID SZÉTZIPPZÁROZÁS REVERÍBILIS R Amiloid ß1-4 peptid Megnyúlás (nm) Kellermayer et al. JBC 28, 8464, 25 Gyakoriság Count Amiloid protofilamentum 1 A pn Plató er (pn) F Megnyúlás (nm) Plató er (pn) Nyújtási sebesség ( m/s) Kellermayer et al. JBC 28, 8464, 25; Karsai et al. J. Chem. Inf. Mod. 45, 1641, Megnyúlás (nm) Megnyúlás (nm) MECHANIKAI STABILITÁS HANGOLÁSA Mechanikai stabilitás alapja: nyíróer irányába álló H-híd csoport NANOTECHNOLÓGIAI ALKALMAZÁS Effektív ragasztók a párhuzamos csatolás elvén Er spektrum Er spektrum Gecko talp tapadása: Párhuzamosan csatolt sertékkel Mesterséges gecko talp