Miért egyedi molekulák?

Átírás

1 Soroljon fel 3 olyan tulajdonságot, ami csak a vízre jellemző! Biomolekulák és sejtek mechanikai tulajdonságai Kellermayer Miklós Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Élő sejtben: molekulagépezetek sokasága Miért egyedi molekulák? 1. Egyének azonosíthatók a tömegben Microtubuláris rendszer Egyedi mikrotubulusok - treadmilling Tovakúszó keratinocita Mikrotubulus dinamikus instabilitás Vezikulum transzport kinezinnel Fehérjeszintézis riboszómán

2 Miért egyedi molekulák? 2. Véletlenszerű eseményeket fedezetünk fel Miért egyedi molekulák? 3. Párhuzamos útvonalon haladó folyamatokat ismerhetünk meg Kigombolyodott állapot Kvantumpont pislogás Yao et al. PNAS 12, Konformációs tér Natív állapot Miért egyedi molekulák? Rövid anyagtudomány Merev testek rugalmassága: Hooke törvény 4. Biomolekulák mechanikáját jellemezhetjük Hajlítási rugalmasság Motor fehérje működés F A = E ΔL L F = erő A = test keresztmetszete L = nyugalmi hossz ΔL = megnyúlás F/A = feszültség ΔL/L = relatív megnyúlás E=Young féle vagy elasztikus modulus (Pa) T2 bakteriofág Kinezin lépegetés Anyag Youngmodulus (GPa) Gyémánt 12 Acél 211 Üveg 73 Plexi 3 Gumi.2 Selyem 5-1 Keratin 2.4 Aktin 2.3 Kollagén 2 Tubulin 1.9 Elasztin.2

3 Merevségi (vagy rugó-) állandó Merevségi (vagy rugó-) állandó (k=f/δl) nem anyagfüggő paraméter. A merevségi állandó (k) függ a test alaki paramétereitől, az erő irányától, és azt mutatja meg, hogy egységnyi megnyúlást mekkora erő idéz elő. A polimerlánc és a bolyongó mozgás (random walk) közötti kapcsolat A polimerlánc alakja hasonlítható a Brown mozgáshoz (random) Longitudinális merevség: A L F 2r Hajlítómerevség: F Egyenesvonalú mozgás esetén: Bolyongó mozgás esetén: R = vt ( 2 t 1 ) R = l 12 [ vt ( 2 t 1 )] 12 κ = F ΔL = EA L κ = 4π 3 Er 4 L 3 R=elmozdulás, v= átlagos sebesség, t 1, t 2 =mérési időpontok, l=átlagos korrelált lépéshossz A Kuhn szegmens ( freely jointed chain ) és a perzisztencia hossz ( wormlike chain ) FJC (freely jointed chain): Kuhn segmens = l eff WLC (wormlike chain): θ(s ) ha s elég nagy, cosθ () s s függvényében lecseng: cosθ () s = exp s l p =perzisztencia hossz l p ha s<<l p, akkor cosθ () s ~1, és a θ(s) szög körül fluktuál. Ha s>>l p, akkor cosθ () s ~, azaz θ(s) és 36 közötti értékeket ugyanolyan valószínûséggel vehet fel. A perzisztencia hossz értelme: az a hossz, amelyen belül a lánc megtartja irányát (emlékszik rá). A perzisztencia hosszon túl a lánc elfelejti irányítottságát. s Termikus rugalmasság A polimerlánc átlagos alakja leírható egyszerű paraméterek segítségével: R 2 = 2L p L A perzisztenciahossz a lánc hajlítómerevségével áll összefüggésben: minél rövidebb Lp, annál hajlékonyabb a lánc, és megfordítva. L p = EI k B T EI = hajlítómerevség E=Young modulus I=hajlítási tehetetlenségi nyomaték (körkeresztmetszetű rúd esetében I=r 4 π/4) k B =Boltzmann állandó T abszolút hőmérséklet. Merev Szemiflexibilis Flexibilis L p >>L L p ~L L p <<L

4 A polimérek alakja a bolyongó mozgásra emlékeztet Biopolimérek mechanikája Entrópikus rugalmasság Brown-mozgás - random walk Négyzetgyök törvény : r N R 2 = Nl 2 = Ll Termikus gerjesztésre a polimerlánc random, ide-oda hajló fluktuációkat végez. r 1 R R = vég-vég távolság N = elemi vektorok száma l = r i = korrelációs hossz r i = elemi vektor Nl = L = kontúrhossz l összefüggésben van a hajlítómerevséggel. Nő a lánc konformációs entrópiája (elemi vektorok orientációs rendezetlensége). Az entrópiamaximumra törekvés miatt a polimerlánc rövidül. Bolyongó (diffúzióvezérelt) mozgás esetén R=elmozdulás, N= elemi lépések száma, L=teljes megtett út, és l=átlagos szabad úthossz. Biopolimérek rugalmassága Vizsgálható paraméterek: erő Titin (lézercsipesz) 8 6 dsdns (lézercsipesz) 1 l = korrelációs hossz (hajlítómerevséget jellemzi) L = kontúrhossz Merev lánc l>>l Mikrotubulus Megnyúlás (μm) Megnyúlás (μm) Szemiflexibilis lánc l~l Aktin filamentum 5 4 Amiloid fibrillum (AFM) Rekombináns titin fragmentum (AFM) pn Flexibilis lánc l<<l DNS molekula Megnyúlás (nm) 5 nm Megnyúlás (nm) RUGALMASSÁG SZERKEZETI VÁLTOZÁS ("ÁTMENET")

5 Molekuláris szingularitás: nanomechanikai ujjlenyomat Egyedi molekulák vizsgálata: manipuláció rugólapka technikákkal DNS fogantyú Rekombináns poliprotein I27 Vizsgált fehérje 8 6 dsdns (lézercsipesz) Rekombináns titin fragmentum (AFM) pn 5 nm Megnyúlás (μm) Kooperatív átmenet 65 pn-nál DNS-RNS hibrid Megnyúlás (nm) Fűrészfog alakú átmenetek Egyenlő távolság a fogak között Egyedi molekulák vizsgálata: manipuláció mező alapú technikákkal Hogyan fogjunk meg egyetlen molekulát? Lézerrel! Fénytörő mikrogyöngy Belépő fénynyaláb P 1 P 2 ΔP F=ΔP/Δt Tractor beam, Star Trek Enterprise A mikrogyöngyöket mint fogantyúkat alkalmazzuk.

6 MOLEKULA - FOGANTYÚ GEOMETRIA HOGYAN RAGADJUNK MEG EGY MOLEKULÁT? Például "molekulahegesztéssel"! Fotoreaktív keresztkötők mikrogyöngy ~ 1 µm Nem-specifikus Fotoreaktív N 3 (azid) csoport UV megvilágítás molekula ~ 1 nm Csomókötés egyetlen molekulafonálra lézercsipesszel A lézercsipesszel erőt is lehet mérni! Aktin filamentum DNS Fáziskontraszt kép Fluoreszcencia kép Lézercsipesz: virtuális rugó molekula Latex gyöngy Mozgatható mikropipetta Fluoreszcencia kép Két lézersugaras optikai csipesz berendezés Arai et al. Nature 399, 446, 1999.

7 A lézercsipesz virtuális rugó "Pikotenziométer" Egyedi titinmolekulák vizualizálása AFM-mel AFM Random coil filamentum globuláris fejjel (C-terminális) Doméncsoportok korrelált organizációja fej farok Δx nanométer tartomány K.1-1 pn/nm F pikonewton tartomány 1 nm 1.6 Topografikus magasság (nm) Autokorreláció függvény Axiális távolság (nm) Egyedi miozin filamentumok vizualizálása Miozin filamentumok nanomechanikája Atomerő mikroszkópia Szintetikus miozin filamentum Egyedi miozinmolekulák feloldhatóak vizes közegben Egymolekula erőspektroszkópia = Rugóállandó (pn/nm) * Elhajlás (nm) Periodicity of repetitive force peaks correlates with spacing of charged regions along backbone Reverzibilis átmenetek (#) Nyújtás - Relaxáció Periodicitás miozin molekula # # # # 4.15 nm 8.3 nm Erő 14.3 nm 2 nm 43 nm Megnyúlás

8 AFM történelem AFM Rugólapkák és hegyek Oxigén atomok rhodium egykristály felületén Richard P. Feynman: There is plenty of room at the bottom december 29. a "nanovilág" léptéke: 1 nanométer Atomerő mikroszkóp (Atomic Force Microscope = AFM) Piezoelektromos hatás fotodetektor bakteriorodopszin DNS Inverz piezoelektromos hatás Piezoelektromosság (Pierre és Jacques Curie, 188): "nyomáselektromosság" rugólapka lézer Direkt piezoelektromos hatás: bizonyos kristályokban mechanikai deformálásra fellépő elektromos polarizáció (P): minta Inverz piezoelektromos hatás: bizonyos kristályokban potenciálkülönbség hatására fellépő deformáció: DNS titin

9 Pásztázó tűszondás mikroszkópia (Scanning Probe Microscopy = SPM) Rugólap méretei 1-4 μm,3-2 μm 1-2 μm Rugólapkák készítése AFM alapok Pásztázó képalkotás Emberi hajszál fotodetektor rugólapka lézer 2 µm Oszcillációs vezérlő jel rugólapka Detektált jel minta Magasság kontraszt Amplitudó kontraszt Fázis kontraszt

10 Képalkotási módok Oszcillációs mód biológiai minták esetében ideális. Kontakt mód Ideális képalkotás feltételei Felszín: kösse a mintát Nem specifikus kötés: csillám, grafit. Specifikus kötés: keresztkötőkkel (amino-, carboxil-, SH-csoportok) Amplitudó f=5-4khz A felszín legyen sima (lehetőleg atomi simaságú csillám, grafit) Rugólap: legyen kellően flexibilis, k 5,3 N/m. Rugólap tűje: nem alakulhat ki erős interakció a minta és a tű között átmérője legyen minél kisebb : 5-8nm. Z-piezo: vertikális mozgatás Minta: legyen minél laposabb ne legyen viszkózus Az AFM hátrányai A tű a felszínt követi, konstans amplitudó mellett. Időfelbontás: perces nagyságrendbe esik Csak felszínhez kötött minta vizsgálható Csak felszínen zajló folyamat követhető nyomon Képalkotási hibák, felbontás Béta-amyloid fibrillumok DNS

11 HeLa sejtek Vvt kenet Fibrin hálózat Képek: ATP-szintáz Képek: endotél sejtek

12 Nanolitográfia Lithos: kő, gráfia: rajzolni Nanolitográfia fotodetektor lézer rugólapka felszín Pablo Picasso: "Don Quixote" polikarbonát felszínbe rajzolva 1 μm Nanolitográfia Szekvenciális két-hullámhossz STIRF-AFM Height Amplitude Actin Cytokeratin 1 µm Pancreas carcinoma cells 1µm

13 Lágy minta manipulációja STIRF- AFM segítségével Sejt abláció Filamentum hasítás Molekulanyújtás atomerőmikroszkóppal alapelvek Előtt Után Előtt Után * * * 1 µm 5 µm Termikus rugólapka-kalibráció Termikusan gerjesztett rugólapka: harmonikus oszcillátor Titin: rugalmas molekuláris gyöngyfüzér Izomköteg PEVKdomén Izomrost Miofibrillum m Szarkomer Rezgés (Amplitudó) 2 Termikusan gerjesztett rugólapka kitérésének Fourier spektruma Összehúzódás Z Vékony filamentum M Vastag filamentum Z Titin I-szakaszbeli szegmens tandem Ig-régió tandem Ig-régió Frekvencia (khz) Ig-domén (7-szálú ß-hordó)

14 Titinmolekula nanomechanikája lézercsipesszel ~28 nm Erőválasz Nemlineáris rugalmasság Domén kitekeredés C A F Megnyúlás (µm) B E D Nemlineáris rugalmasság A domének egymás után, a mechanikai stabilitásuk növekvő sorrendjében tekerednek ki. Erővezérelt szerkezetváltozások: Nemlineáris rugalmasságra szuperponált domén kitekeredés A-B C D E F Szívizom N2-B NH 2 NH 2 A titin nanomechanikai boncolása Alternatív hasítás: I1 I15 N2-B I27 I84 I15 Vázizom (soleus) I1 I15 Konstitutívan kifejeződő tandem Ig régió I27 I79 N2-A PEVK I84 I15 Differenciálisan kifejeződő tandem Ig régió Ig domén PEVK domén I55-62 I II III Klónozott és mechanikailag manipulált titin fragmentumok Egyedi szekvencia Konstitutívan kifejeződő tandem Ig régió COOH COOH Titin PEVK: hangolható rugó Titin I55-62: viszkoelasztikus elem Force (pn) 12 pn 1 PEVKI nm Entrópikus (féregszerű) lánc Perzisztenciahossz (Lp) Az összehúzódást az entrópiamaximumra törekvés vezérli Effektív perzisztenciahossz (nm) Lp PEVKI Lp PEVKII Lp PEVKIII Ionerősség (mm) Elektrosztatikus merevedés - Flexibilitás nő: ionerővel a C-terminális felé Kontrakció Kitekeredési események Gyakoriság ΔL = 29.8 ± 3.5 nm 5 nm Kitekeredési erő (pn) 4 2 pn

15 A titin doméneket párhuzamosan csatolt H-hidak stabilizálják A mechanikai stabilitás biológiai logikája Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása Nagy kitereredési erő Erő Erő Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása Alacsony kitereredési erő Erő Makroszkópikus mechanikai stabilitás Effektív ragasztóanyag a párhuzamos csatolás elvén A megnyújtott titin bejárja a gombolyodási fázisteret Vajon milyen útvonalon? Mesterséges gecko talp Nanotechnológiával készítve Gecko talp felületi tapadása: Párhuzamosan csatolt Van der Waals kötések a serték és a felület között Force (pn) Erő Natív Native Feltekert Folded WLC WLC Partially Részlegesen unfolded gombolyodott Unfolded WLC Kitekert WLC 2 Unfolded Kitekert Extension (µm) Megnyúlás Spontán gombolyodási folyamat: Diffúzió az energiaprofilon? Konformációs tér Natív állapot

16 Titin nanomanipulálás erővisszacsatolt lézercsipesszel sulfo-sanpah keresztkötővel bevont latex gyöngy mozgatható mikropipetta T12 anti-titin ellenanyaggal bevont gyöngy titin Mért jel (/-) (erő) Vezérelt kimenet (/-) (piezo mogás) Referencia jel (erő) Σ Feedback vezérlés Csapdázott gyöngy Mozgatott gyöngy Megnyúlás (nm) Konstans-erő kísérlet egyetlen titinmolekulán Kvázi erőrámpa High-force clamp Low-force clamp Kiteredési görbe Visszatekeredési görbe x1 6 Idő (1 3 s) ~2-perces adatsor Megnyúlás (nm) Titin kitekeredés konstans erőnél Monoexponenciális Singleexponential görbeillesztés fit Megnyúlás (nm) ~28 nm lépcsők x1 3 Idő (s) x1 3 Idő (s) A várttól eltérések mutatkoznak a lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben. Freqency Rate constant (s -1 ) Lépcsőméret eloszlás 28.2 ± 14.6 SD Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény Step size (nm) Erőfüggő sebességi állandók Feedback force (pn) Megnyúlás (µm) Doménkitekeredés hirtelen ugrásokban Idő (s) Kitekeredési ugrások Doméncsoportok korrelált szerkezeti elrendeződést mutatnak fej farok 1.6 Topografikus magasság (nm) Autokorreláció függvény Axiális távolság (nm) Kellermayer et al. BBA Bioenergetics doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki.

17 Szerkezeti átmenetek alacsony erőnél Megnyúlás (µm) Nagy lépcső (>1 nm) Elsimult átmenet Idő (s) Az elsimult és nagy, lépcsőszerű átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai fáradás alapjául szolgálnak. 8 pn 7 pn 6 pn 5 pn 4 pn 3 pn 2 pn 1 pn 5 pn Molekuláris fáradás Sima Nagy lépcső T12 9D1 (PEVK) Domén kitekeredés Megnyúlás (μm) Z Trombitás et al. J. Struct. Biol Titin T12 és 9D1 ellenanyagokkal megragadva Megnyúlás (μm) Megnyúlás (nm) Titin gombolyodás konstans erőnél Kitekert állapot Gyors kontrakció (entrópikus kollapszus) Szerkezeti fluktuációk (A fázis időtartama rövidül az erő csökkenésével) Végső kontrakció (ritkán tapasztalható) Teljesen feltekert állapot x1 3 Idő (s) Az erőt ~3 pn alá kell csökkenteni jelentős domén visszatekeredéshez. A fluktuáció diffuzív keresés a konformációs térben. Részleges viszatekeredés: doméncsoportok kooperatívan tekeredhetnek. Kitekeredés Megnyúlás (μm) Megnyúlás (μm) Fluktuációk Domén unfolding ~7 nm Idő (s) Idő (s) 4 pn Fluktuációk Részleges refolding A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula esetén is Megnyúlás (nm) Erővezérelt ki- és visszatekeredés x1 3 Idő (s) Titinben: -Kooperatív kitekeredés -Mechanikai fáradás -Diffuzív keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés -Mechanikai erő és random fehérjeszakaszok modulálhatják a gombolyodás folyamatát