Az élő sejt fizikai Biológiája: motorfehérjék, egyensúlytól távoli folyamatok

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Az élő sejt fizikai Biológiája: motorfehérjék, egyensúlytól távoli folyamatok"

Attila Németh
7 évvel ezelőtt
Látták:

Tematika Az élő sejt fizikai Biológiája:

Kellermayer Miklós Motorfehérjék működése.

Az atomerőmikroszkóp. Titin kitekerés AFM-mel.

1 Tematika Az élő sejt fizikai Biológiája: motorfehérjék, egyensúlytól távoli folyamatok Kellermayer Miklós Motorfehérjék működése. A munkaciklus Egyensúlytól távoli folyamatok. Erővezérelt fehérjegombolyodás. Bemutatások: in vitro motilitási próba. Az atomerőmikroszkóp. Titin kitekerés AFM-mel. Termikus kilincskerék MOTORFEHÉRJÉK Brown-féle kilincskerék mechanizmus m 1. Specifikus citoszkeletális filamentumhoz kapcsolódnak (DE ) k be k ki F Diffúzió 2. Elmozdulást és erőt generálnak 3. Kémiai energiát használnak fel

A motorfehérjék típusai In vitro aktomiozin motilitás 1.

nem-konvencionális Miozin szupercsalád (I-XXIV

Kinezinek: Kinezin szupercsalád: konvencionális és

A mikrotubulus mentén a plusz vég irányába mozognak. c.

vakuoláris fehérjeválogatás (pinchase enzimek)? 3.

kapszid csomagoló motor, kondenzinek A DNS fonal mentén

Rotációs motorok F1F-ATP szintetáz Bakteriális

$Microscope coverslip Immobile fraction Mobile fraction$ (1.3 μm/s) HMM 1 mm ATP 3 mm MgCl2 A miozin szupercsalád

2 A motorfehérjék típusai In vitro aktomiozin motilitás 1. Aktin alapú Miozinok: Konvencionális (miozin II) és nem-konvencionális Miozin szupercsalád (I-XXIV osztályok). Plusz vég irányába mozognak. 2. Mikrotubulus alapú a. Dineinek: Ciliáris (flagelláris) és citoplazmáris dineinek. A mikrotubulus mentén a minusz vég irányába mozognak. b. Kinezinek: Kinezin szupercsalád: konvencionális és nem-konvencionális. A mikrotubulus mentén a plusz vég irányába mozognak. c. Dinaminok: MT-függő GTPáz aktivitás Biológiai szerep: vakuoláris fehérjeválogatás (pinchase enzimek)? 3. DNS alapú mechanoenzimek DNS és RNS polimerázok, vírus kapszid csomagoló motor, kondenzinek A DNS fonal mentén haladnak és fejtenek ki erőt 4. Rotációs motorok F1F-ATP szintetáz Bakteriális flagelláris motor 5. Mechanoenzim komplexek Riboszóma Myosin Actin filament Microscope coverslip Immobile fraction Mobile fraction (1.3 μm/s) HMM 1 mm ATP 3 mm MgCl2 A miozin szupercsalád 5% homológia a tagok között A miozin II processzív 2 db alfa-hélixből coiled-coil könnyűláncok nyaki v. pánt régió "konvencionális" 2-fejű Regulatórikus ATP-kötő zseb csupasz zóna miozin fejek Minusz vég irányába mozog miozin fejek Nyak Esszenciális Aktin-kötő hely miozin farok Konverter

3 Dineinek A miozin fej (Subfragment-1) Típusok: axonemális és citoplazmáris. Sok alegységes fehérjék (Mr~5 kda) A minusz vég irányába mozognak. Koordinált működésük meghajlítja a ciliumot. A motor domén mutációi hipertroﬁás kardiomiopátiához vezetnek. Processzív motorok. Plusz vég irányába mozognak. Vesicular transport minusz vég irányába mozog Dinaminok Vakuoláris fehérjeválogatás GTPázok Switch domén: hasonlóság a miozinhoz és G-fehérjékhez. pinchase funkció

4 DNS Motorok Vírus portális motor Különleges DNS motor Processzív motorok T7 DNS Polimeráz φ29 bacteriofág portális motor RNS Polimeráz RNS Polimeráz, Wang et al DNS mechanoenzimek Kondenzinek MukBEF nanomechanika és kondenzációs model SMC fehérjecsalád SMC = "structural maintenance of chromosomes"

5 ROTÁCIÓS MOTOROK I: F1F-ATP SZINTETÁZ ROTÁCIÓS MOTOROK II: Bakteriális flagellum motor 2 nm ATP 2 nm ATP Diszkrét 12 rotációs lépések Kinosita Fordulatszám: > 2 rpm Fogyasztás: 1-16 W Hatásfok: > 8% Energiaforrás: protonok Mechanoenzim komplex Riboszóma Erővezérelt fehérje-kitekeredés Titin I55-62 rekombináns fragmentum kitekerése k off G Fx ß Tranzíciós állapot 3 2 Natív állapot Kitekert állapot Reakció koordináta 1 ΔL x ß F unf = k BT x β ln rx β k B T k unf Wen et al. Nature 28 Kitekerési erő 2.7 nm-es lépések (egy triplett).78 s transzlokációs idő Transzlokációval csatolt helikáz aktivitás 2 pn 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm

Titin I55-62: viszkoelasztikus molekulaszakasz A mechanikai stabilitás biológiai logikája Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása Nagy kitereredési erő Az

csatolása Alacsony kitereredési erő 2 pn 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm Az Ig domén első és utolsó ß-láncait összetartó, párhuzamosan csatolt H-hidak Titin nanomanipulálás

(+/-) (erő) Vezérelt kimenet (+/-) (piezo mogás) Referencia jel (erő) Σ Feedback vezérlés Csapdázott gyöngy Mozgatott gyöngy Megnyúlás (nm) Konstans-erő kísérlet

6 Titin I55-62: viszkoelasztikus molekulaszakasz A mechanikai stabilitás biológiai logikája Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása Nagy kitereredési erő Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje 2 15 Gyakoriság ΔL Kitekeredési erő (pn) 4 Mechanikai stabilitás alapja: Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása Alacsony kitereredési erő 2 pn 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm Az Ig domén első és utolsó ß-láncait összetartó, párhuzamosan csatolt H-hidak Titin nanomanipulálás erővisszacsatolt lézercsipesszel sulfo-sanpah keresztkötővel bevont latex gyöngy mozgatható mikropipetta T12 anti-titin ellenanyaggal bevont gyöngy titin Mért jel (+/-) (erő) Vezérelt kimenet (+/-) (piezo mogás) Referencia jel (erő) Σ Feedback vezérlés Csapdázott gyöngy Mozgatott gyöngy Megnyúlás (nm) Konstans-erő kísérlet egyetlen titinmolekulán Kvázi erőrámpa High-force clamp Low-force clamp Kiteredési görbe Visszatekeredési görbe x1 6 Idő (1 3 s) ~2-perces adatsor

Megnyúlás (nm) Titin kitekeredés konstans erőnél 1 4 38 36 34 32 3 28 26 Monoexponenciális Singleexponential görbeillesztés

lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben.

6 SD Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény 1 2 3 4 5 6 Step size (nm) Erőfüggő sebességi állandók 94 97

szerkezeti elrendeződést mutatnak fej farok 1.6 Topografikus magasság (nm) 1.2.8.

BBA Bioenergetics 23 5-1 doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki.

átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai

8 pn 7 pn 6 pn 5 pn 4 pn 3 pn 2 pn 1 pn 5 pn Molekuláris fáradás Domén kitekered és Sima Nagy lépcső T12 9D1 (PEVK) Megnyúlás

Titin T12 és 9D1 ellenanyagokkal megragadva Megnyúlás (μm) Megnyúlás (nm) Titin gombolyodás konstans erőnél 1 2 15 1 5

7 Megnyúlás (nm) Titin kitekeredés konstans erőnél Monoexponenciális Singleexponential görbeillesztés fit Megnyúlás (nm) ~28 nm lépcsők x x1 3 A várttól eltérések mutatkoznak a lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben. Freqency Rate constant (s -1 ) Lépcsőméret eloszlás 28.2 ± 14.6 SD Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény Step size (nm) Erőfüggő sebességi állandók Feedback force (pn) Megnyúlás (µm) Doménkitekeredés hirtelen ugrásokban Kitekeredési ugrások Doméncsoportok korrelált szerkezeti elrendeződést mutatnak fej farok 1.6 Topografikus magasság (nm) Autokorreláció függvény Axiális távolság (nm) Kellermayer et al. BBA Bioenergetics doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki. Megnyúlás (µm) Szerkezeti átmenetek alacsony erőnél Nagy lépcső (>1 nm) Elsimult átmenet Az elsimult és nagy, lépcsőszerű átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai fáradás alapjául szolgálnak. 8 pn 7 pn 6 pn 5 pn 4 pn 3 pn 2 pn 1 pn 5 pn Molekuláris fáradás Domén kitekered és Sima Nagy lépcső T12 9D1 (PEVK) Megnyúlás (μm) Z Trombitás et al. J. Struct. Biol Titin T12 és 9D1 ellenanyagokkal megragadva Megnyúlás (μm) Megnyúlás (nm) Titin gombolyodás konstans erőnél Kitekert állapot Gyors kontrakció (entrópikus kollapszus) Szerkezeti fluktuációk (A fázis időtartama rövidül az erő csökkenésével) Végső kontrakció (ritkán tapasztalható) Teljesen feltekert állapot x1 3 Az erőt ~3 pn alá kell csökkenteni jelentős domén visszatekeredéshez. A fluktuáció diffuzív keresés a konformációs térben. Részleges viszatekeredés: doméncsoportok kooperatívan tekeredhetnek. Kitekeredés Megnyúlás (μm) Megnyúlás (μm) Fluktuációk Domén unfolding ~7 nm 4 pn Fluktuációk Részleges refolding

A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula

visszatekeredés 6 8 1 12 14 16 18 x1 3 Titinben:

keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés

8 A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula esetén is Megnyúlás (nm) Erővezérelt ki- és visszatekeredés x1 3 Titinben: -Kooperatív kitekeredés -Mechanikai fáradás -Diffuzív keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés -Mechanikai erő és random fehérjeszakaszok modulálhatják a gombolyodás folyamatát

Hasonló dokumentumok

Polimerlánc egyensúlyi alakja. Féregszerű polimermodell (Wormlike chain) WLC (wormlike chain): Entropikus rugalmasság vizualizálása

Polimerlánc egyensúlyi alakja. Féregszerű polimermodell (Wormlike chain) WLC (wormlike chain): Entropikus rugalmasság vizualizálása Polimerlánc egyensúlyi alakja Az a makroállapot, amely a legtöbb mikroállapottal valósítható meg (legvalószínűbb állapot) DNS molekulák fluoreszcencia mikroszkóp alatt Féregszerű polimermodell (Wormlike