Egyedi molekula vizsgálatok

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Egyedi molekula vizsgálatok"

Alajos Mészáros
5 évvel ezelőtt
Látták:

Élő sejtben: molekulagépezetek sokasága Egyedi

keratinocita Mikrotubulus dinamikus instabilitás

riboszómán http://multimedia.mcb.harvard.

technikái (fluoreszcencia, mechanika, molekuláris

(egylépcsős bleaching, erőgörbe) Folyamatok az

hatása az aktivációs kinetikára; mechanokémia

thioredoxin, motorfehérjék) Miért vizsgáljunk 1.

Biomolekuláris mechanika Molekuláris rugalmasság,

Kitekeredett Natív Kinesin motorfehérje 2.

Egyedek azonosítása, követése sokaságban Térbeli

1 Élő sejtben: molekulagépezetek sokasága Egyedi molekula vizsgálatok Kellermayer Miklós Tovakúszó keratinocita Mikrotubulus dinamikus instabilitás Vezikulum transzport kinezinnel Fehérjeszintézis riboszómán Egyedi molekula vizsgálatok Miért vizsgáljunk egyedi molekulákat? Az egyedi molekula tudomány rövid története Vizsgálható paraméterek (topográfia, fluoreszcencia, erő) Egyedi molekulák vizsgálati technikái (fluoreszcencia, mechanika, molekuláris fogantyúk problémája) A molekuláris szingularitás (egylépcsős bleaching, erőgörbe) Folyamatok az egyedi molekula skálán (fluktuációk, átmenetek) Szabadentalpia, aktivációs energia, reakciósebesség, reverzíbilitás Mechanikai erő hatása az aktivációs kinetikára; mechanokémia Példák (fehérjetekeredés, RNS tekeredés, thioredoxin, motorfehérjék) Miért vizsgáljunk egyedi molekulákat? 1. Térbeli kiátlagolódás kiküszöbölődik párhuzamos útvonalakon haladó folyamatok, pl. fehérjegombolyodás 3. Biomolekuláris mechanika Molekuláris rugalmasság, motorfehérje funkció G Konformációs tér Kitekeredett Natív Kinesin motorfehérje 2. Időbeli kiátlagolódás kiküszöbölődik Sztochasztikus folyamatok, pl. fluorofór pislogás GFP pislogás (Moerner) Jel (a.u.) 4. Egyedek azonosítása, követése sokaságban Térbeli és időbeli transzport útvonalak (pl. víruspartikulumok celluláris mozgása, citoszkeletális filamentumok dinamikája) Idő (s) GFP Egyedi mikro- Tubulusok (Borisy) Bakteriofágból kiszabadult DNS Aktin "speckle" mikroszkópia (Small)

Egyedi molekula tudomány története Vizsgálható paraméterek:

mikroszkópos felvétele 1986: J. Spudich, T.

Molloy, egyedi miozin mechanika Murvai Ünige Kungl Jusztina Karsai

Svoboda, S. Block, egyedi kinesin mechanika 1996: C.Bustamante, D.

Weiss, egy-molekulapár FRET Amyloid ß1-42 Fibrin protofibrillum

ATPase lépési kinetika Kiss Balázs Brennan Decker 1998: J.

riboszóma mechanika 1 nm Titinmolekula 5 nm Dezmin filamentum 2 nm

Vizsgálható paraméterek: erő 16 14 12 Titin (lézercsipesz) 8 6 dsdns

2 Egyedi molekula tudomány története Vizsgálható paraméterek: topográfia 1976: Egyetlen antitestmolekula fluoreszcencia mikroszkópos felvétele 1986: J. Spudich, T. Yanagida, in vitro motilitási próba 1991: J.Spudich, T.Yanagida, J.Molloy, egyedi miozin mechanika Murvai Ünige Kungl Jusztina Karsai Árpád 1994: T.Yanagida, egyetlen ATP turnover miozinon 1994: K.Svoboda, S. Block, egyedi kinesin mechanika 1996: C.Bustamante, D.Bensimon, DNS molekula megnyújtása 5 nm 2 nm 1996: T.Ha, S.Weiss, egy-molekulapár FRET Amyloid ß1-42 Fibrin protofibrillum Amyloid ß : W.E. Moerner, GFP pislogás 1997: M.Kellermayer, M.Rief, L.Tskhovrebova, titin megnyújtás (első fehérje) 1998: Kinosita, F1F ATPase lépési kinetika Kiss Balázs Brennan Decker 1998: J. Fernandez, genetikai poliprotein mechanika 21: J.Liphardt, C.Bustamante, RNS megnyújtása 24: J.Fernandez, egyedi fehérjemolekula folding 28: Bustamante, Tinoco: riboszóma mechanika 1 nm Titinmolekula 5 nm Dezmin filamentum 2 nm Miozin vastag filamentum Vizsgálható paraméterek: Fluoreszcencia Vizsgálható paraméterek: erő Titin (lézercsipesz) 8 6 dsdns (lézercsipesz) Megnyúlás (μm) Megnyúlás (μm) i i ii 5 4 Amiloid fibrillum (AFM) Rekombináns titin fragmentum (AFM) pn ii nm TRITC-jelölt titinmolekulák RUGALMASSÁG SZERKEZETI VÁLTOZÁS ("ÁTMENET")

3 Egyedi molekulák vizsgálata: fluoreszcencia technikák Egyedi molekulák vizsgálata: manipuláció rugólapka technikákkal Konfokális fluorophore i ii mikroszkópia fluorophore laser laser prism TIRF mikroszkópia evanescent field evanescent field laser optical fiber Epifluoreszcencia mikroszkópia coverslip fluorophores fluorophore NSOM objective lens (focus in objective back focal plane) Egyedi molekulák vizsgálata: manipuláció mező alapú technikákkal A lézercsipesz Belépő fénynyaláb P 1 Fénytörő mikrogyöngy P 2 F=ΔP/Δt ΔP Lézer F Fénytörő mikrogyöngy Mikroszkóp objektív F Grádiens erő EGYENSÚLY Szórási erő (fénynyomás)

4 Csomókötés egyetlen aktin filamentumra lézercsipesszel Csomókötés egyetlen DNS láncra Aktin filamentum manipuláció mikrogyöngy mozgatható lézercsipeszben Fáziskontraszt kép Fluoreszcencia kép mikrogyöngy stacionárius lézercsipeszben Kinosita Group Arai et al. Nature 399, 446, Molekuláris fogantyúk problémája Molekuláris szingularitás: egylépcsős photobleaching TIRFM Kimogram mikrogyöngy ~ 1 μm Idő Alexa-488-PGK molekula ~ 1 nm

Molekuláris szingularitás: nanomechanikai ujjlenyomat DNS fogantyú Rekombináns poliprotein 8 6 Folyamatok az egyedi molekula skálán Kooperatív erőátmenet dsdns (lézercsipesz) Diszkrét lépések: Miozin

pn 5 nm Fűrészfog alakú átmenetek Egyenlő távolság a fogak között Minden-vagy-semmi erőátmenet 2 pn Rekombináns titin fragmentum (AFM) 5 nm Fluktuációk: Koleszterin oxidáz Bulk versus single

5 Molekuláris szingularitás: nanomechanikai ujjlenyomat DNS fogantyú Rekombináns poliprotein 8 6 Folyamatok az egyedi molekula skálán Kooperatív erőátmenet dsdns (lézercsipesz) Diszkrét lépések: Miozin V - processzív motor I27 Vizsgált fehérje dsdns (lézercsipesz) Rekombináns titin fragmentum (AFM) Megnyúlás (μm) Megnyúlás (μm) Kooperatív átmenet 65 pn-nál DNS-RNS hibrid 2 pn 5 nm Fűrészfog alakú átmenetek Egyenlő távolság a fogak között Minden-vagy-semmi erőátmenet 2 pn Rekombináns titin fragmentum (AFM) 5 nm Fluktuációk: Koleszterin oxidáz Bulk versus single Aktiváció, sebesség, reverzibilitás Többszörös turnover Egy (egyedi) turnover M GuCl BULK G k tranziens GuCl 1 SINGLE stabil Δx instabil x Molekulahossz (μm) 12 R

Erő hatása az aktivációra:titin irreverzibilis kitekerése Erő hatása az aktivációra: RNS

ß 3 2 Natív Kitekert Reakció koordináta 1 ΔL x ß RupturaF = k BT x β ln rx β k B T k off

megnyújtása lézercsipesszel PEVKdomén Izomrost Miofibrillum Molekuláris erők mérhetők a

Vékony filamentum M Vastag filamentum Z virtuális rugó molekula Ig-domén (7-szálú ß-hordó)

6 Erő hatása az aktivációra:titin irreverzibilis kitekerése Erő hatása az aktivációra: RNS hajtű egyensúlyi kitekerése Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje G k off Tranziciós Fx ß 3 2 Natív Kitekert Reakció koordináta 1 ΔL x ß RupturaF = k BT x β ln rx β k B T k off RupturaF 2 pn 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm Példa: fehérjetekeredés Izomköteg EGyetlen molekula megnyújtása lézercsipesszel PEVKdomén Izomrost Miofibrillum Molekuláris erők mérhetők a lézercsipesz virtuális rugó tulajdonságai miatt Szarkomer Lézer fókusz Optikai csipesz: Z Vékony filamentum M Vastag filamentum Z virtuális rugó molekula Ig-domén (7-szálú ß-hordó) Titin I-szakaszbeli szegmens Latex gyöngy tandem Ig-régió tandem Ig-régió Mozgatható mikropipetta dsdna

Natív titin nanomechanikája Titin doménszerkezet Erőválasz Erővezérelt szerkezeti változások Ig domén PEVK szegmens egyedi szekvenciák 1 8 6 4 2 6 55 5 45 4 1.75 1.8 1.

7 Natív titin nanomechanikája Titin doménszerkezet Erőválasz Erővezérelt szerkezeti változások Ig domén PEVK szegmens egyedi szekvenciák Nemlineáris rugalmasság Domén kitekeredés C B E D A-B C D E szívizom N2-B NH 2 NH 2 I1 I15 N2-B I27 I84 I15 vázizom (soleus) I1 I15 I27 I79 N2-A PEVK I84 I15 COOH COOH Nemlineáris rugalmasság A F Megnyúlás (µm) A mechanikai erő stabilitási sorrendbe szervezi a titin doménjeit. F konstitutívan expresszálódó tandem Ig régió differenciálisan expresszálódó tandem Ig régió I55-62 I II III Klónozott és mechanikailag manipulált titin fragmentumok konstitutívan expresszálódó tandem Ig régió PEVK domén: elasztikus molekulaszakasz A PEVK domén elektrosztatikusan hangolható molekula-teleszkóp 1 L p, PEVKI, n=23 AFM rugólapka Au S PEVK szegmens His 6 Glymo-NTA-Ni Féregszerű lánc (Wormlike chain) model FL P k B T = z 1 L C 4(1 z / L C ) Erő Force (pn) (pn) PEVKI Reverzíbilis nemlineáris erőválasz Megnyúlás Extension (nm) Perzisztencia hossz (L p ) Megnyúlás (z) Erő (F) Gyakoriság Frequency Gyakoriság Frequency Gyakoriság Frequency Persistence length (nm) Perzisztenciahossz (nm) L, PEVKII, n=32 2 p Persistence length (nm) Perzisztenciahossz (nm) 28 L p, PEVKIII, n= Persistence length (nm) Perzisztenciahossz (nm) N-terminális szegmens Középső szegmens C-terminális szegmens Effektív Effective perziszenciahossz, persistence length L p (nm) Lp PEVKI Lp PEVKII Lp PEVKIII Ionerősség Ionic strength (mm) (mm) L P = L L e

Titin I55-62: viszkoelasztikus molekulaszakasz A

Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos

fragmentum kitekeredési görbéje 2 15 Gyakoriság 3

Mechanikai stabilitás alapja: Szerkezetet

kitereredési erő 2 pn 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm Az

párhuzamosan csatolt H-hidak Nanotechnológiai

csatolás elvén A fehérjegombolyodás fázisterének

folding fázistér Kitekeredett Konformáció Erő

Van der Waals kötések a serték és a felület

8 Titin I55-62: viszkoelasztikus molekulaszakasz A mechanikai stabilitás biológiai logikája Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása Nagy kitereredési erő Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje 2 15 Gyakoriság ΔL Kitekeredési erő (pn) 4 Mechanikai stabilitás alapja: Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása Alacsony kitereredési erő 2 pn 5 nm ΔL = 29,8 ± 3,5 nm Az Ig domén első és utolsó ß-láncait összetartó, párhuzamosan csatolt H-hidak Nanotechnológiai alkalmazás Effektív ragasztóanyag a párhuzamos csatolás elvén A fehérjegombolyodás fázisterének vizsgálata egyedi molekula módszerrel Fehérje folding fázistér Kitekeredett Konformáció Erő Gecko talp tapadása: Energia Párhuzamosan csatolt Van der Waals kötések a serték és a felület között Mesterséges gecko talp Natív Mechanikai erő segítségével a konformációs tér kevésbé betöltött részei is vizsgálhatók.

A titin gombolyodási fázistere Titin nanomechanika erővisszacsatolt lézercsipesszel Referencia erő (konstans)

mikropipetta titin Vezérelt kimenet (/- piezo mozgás) Feedback kontrol 4 38 36 Monoexponenciális függvény: domén

26 5 1 15 2 25 x1 3 Idő (s) Titin feltekeredés konstans erőnél Biomolekuláris folyamatok mechanikai erőtérben 1 2 15 1

Reakció koordináta Gombolyodás (Diffúzió az energiaprofil felületén) Kitekert Erővezérelt kitekeredés (erő által

off ) illetve terhelés (r) sebességeinek arányától és az energiaprofil alakjától (x ß ) függ: F = k B T x β ln rx β k B

9 A titin gombolyodási fázistere Titin nanomechanika erővisszacsatolt lézercsipesszel Referencia erő (konstans) Lézercsipesz Doménkitekeredési folyamat konstans erőnél 1 Mért erő (/-) Folded WLC Unfolded WLC Mozgatható mikropipetta titin Vezérelt kimenet (/- piezo mozgás) Feedback kontrol Monoexponenciális függvény: domén kitekeredés F erőnél Force (pn) 4 Native Partially unfolded nm Unfolded (µm) Extension x1 3 Idő (s) Titin feltekeredés konstans erőnél Biomolekuláris folyamatok mechanikai erőtérben Kitekert Gyors kollapszus Szerkezeti fluktuációk Végső kontrakció Ismételt kitekeredés E 1. k off Fx ß Tranzíciós 2. Reakció koordináta Gombolyodás (Diffúzió az energiaprofil felületén) Kitekert Erővezérelt kitekeredés (erő által meghatározott irányban) 5 x ß Feltekeredett x1 Idő 3 (s) 1 A pillanatnyi erő (F) a vezérelt folyamat (k off ) illetve terhelés (r) sebességeinek arányától és az energiaprofil alakjától (x ß ) függ: F = k B T x β ln rx β k B T k off 15 1 Ugyanaz a molekula ismételt mechanikai ciklusok során más-más utat jár be. Monte-Carlo szimuláció ± Fx k = k k e B T 5 Natív x1 3 Idő (s)

10 Élő sejtben: molekulagépezetek sokasága Tovakúszó keratinocita Mikrotubulus dinamikus instabilitás Vezikulum transzport kinezinnel Fehérjeszintézis riboszómán

Hasonló dokumentumok

Nanomedicina Szimpózium, 2008. Nanomechanika: Egyedi Biomolekulák Manipulálása. Kellermayer Miklós

Nanomedicina Szimpózium, 2008. Nanomechanika: Egyedi Biomolekulák Manipulálása. Kellermayer Miklós Nanomedicina Szimpózium, 28 Nanomechanika: Egyedi Biomolekulák Manipulálása Kellermayer Miklós Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet ÉLŐ SEJTBEN: BONYOLULT