Miért egyedi molekulák? Miért egyedi molekulák? Biomolekulák és sejtek mechanikai tulajdonságai. Élő sejtben: molekulagépezetek sokasága

Átírás

1 Élő sejtben: molekulagépezetek sokasága Biomolekulák és sejtek mechanikai tulajdonságai Tovakúszó keratinocita Mikrotubulus dinamikus instabilitás Kellermayer Miklós Semmelweis Egyetem Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Vezikulum transzport kinezinnel Fehérjeszintézis riboszómán Miért egyedi molekulák? 1. Egyének azonosíthatók a tömegben Miért egyedi molekulák? 2. Véletlenszerű eseményeket fedezetünk fel Microtubuláris rendszer Egyedi mikrotubulusok - treadmilling Kvantumpont pislogás Yao et al. PNAS 12, 14284

2 Miért egyedi molekulák? 3. Párhuzamos útvonalon haladó folyamatokat ismerhetünk meg Miért egyedi molekulák? 4. Biomolekulák mechanikáját jellemezhetjük Kigombolyodott állapot Hajlítási rugalmasság Motor fehérje működés Konformációs tér Natív állapot T2 bakteriofág Kinezin lépegetés F A = E ΔL L Rövid anyagtudomány Merev testek rugalmassága: Hooke törvény F = erő A = test keresztmetszete L = nyugalmi hossz ΔL = megnyúlás F/A = feszültség ΔL/L = relatív megnyúlás E=Young féle vagy elasztikus modulus (Pa) Anyag Youngmodulus (GPa) Gyémánt 12 Acél 211 Üveg 73 Plexi 3 Gumi.2 Selyem 5-1 Keratin 2.4 Aktin 2.3 Kollagén 2 Tubulin 1.9 Elasztin.2 Longitudinális merevség: A κ = L Merevségi (vagy rugó-) állandó Merevségi (vagy rugó-) állandó (k=f/δl) nem anyagfüggő paraméter. A merevségi állandó (k) függ a test alaki paramétereitől, az erő irányától, és azt mutatja meg, hogy egységnyi megnyúlást mekkora erő idéz elő. F ΔL = EA L F 2r Hajlítómerevség: κ = 4π 3 Er 4 L 3 F

3 A polimerlánc és a bolyongó mozgás (random walk) közötti kapcsolat A polimerlánc alakja hasonlítható a Brown mozgáshoz (random) Egyenesvonalú mozgás esetén: Bolyongó mozgás esetén: R=elmozdulás, v= átlagos sebesség, t 1, t 2 =mérési időpontok, l=átlagos korrelált lépéshossz R = vt ( 2 t 1 ) [ ( )] 12 R = l 12 vt 2 t 1 A Kuhn szegmens ( freely jointed chain ) és a perzisztencia hossz ( wormlike chain ) FJC (freely jointed chain): Kuhn segmens = l eff WLC (wormlike chain): s θ(s) ha s elég nagy, cosθ () s s függvényében lecseng: cosθ () s = exp s l p =perzisztencia hossz l p ha s<<l p, akkor cosθ () s ~1, és a θ(s) szög körül fluktuál. Ha s>>l p, akkor cosθ () s ~, azaz θ(s) és 36 közötti értékeket ugyanolyan valószínûséggel vehet fel. A perzisztencia hossz értelme: az a hossz, amelyen belül a lánc megtartja irányát (emlékszik rá). A perzisztencia hosszon túl a lánc elfelejti irányítottságát. Termikus rugalmasság A polimerlánc átlagos alakja leírható egyszerű paraméterek segítségével: R 2 = 2L p L A perzisztenciahossz a lánc hajlítómerevségével áll összefüggésben: minél rövidebb Lp, annál hajlékonyabb a lánc, és megfordítva. L p = EI k B T EI = hajlítómerevség E=Young modulus I=hajlítási tehetetlenségi nyomaték (körkeresztmetszetű rúd esetében I=r 4 π/4) k B =Boltzmann állandó T abszolút hőmérséklet. Merev Szemiflexibilis L p >>L L p ~L r 1 A polimérek alakja a bolyongó mozgásra emlékeztet Brown-mozgás - random walk R Négyzetgyök törvény : r N R 2 = Nl 2 = Ll R = vég-vég távolság N = elemi vektorok száma l = r i = korrelációs hossz r i = elemi vektor Nl = L = kontúrhossz l összefüggésben van a hajlítómerevséggel. Flexibilis L p <<L Bolyongó (diffúzióvezérelt) mozgás esetén R=elmozdulás, N= elemi lépések száma, L=teljes megtett út, és l=átlagos szabad úthossz.

4 Biopolimérek mechanikája Biopolimérek rugalmassága Entrópikus rugalmasság l = korrelációs hossz (hajlítómerevséget jellemzi) L = kontúrhossz Termikus gerjesztésre a polimerlánc random, ide-oda hajló fluktuációkat végez. Merev lánc l>>l Mikrotubulus Nő a lánc konformációs entrópiája (elemi vektorok orientációs rendezetlensége). Szemiflexibilis lánc l~l Aktin filamentum Az entrópiamaximumra törekvés miatt a polimerlánc rövidül. Flexibilis lánc l<<l DNS molekula Vizsgálható paraméterek: erő Titin (lézercsipesz) 8 6 dsdns (lézercsipesz) Molekuláris szingularitás: nanomechanikai ujjlenyomat DNS fogantyú I27 Rekombináns poliprotein Vizsgált fehérje Megnyúlás (μm) Amiloid fibrillum (AFM) Megnyúlás (μm) Rekombináns titin fragmentum (AFM) 8 6 dsdns (lézercsipesz) Rekombináns titin fragmentum (AFM) pn pn Megnyúlás (nm) 5 nm Megnyúlás (nm) Megnyúlás (μm) 5 nm Megnyúlás (nm) RUGALMASSÁG SZERKEZETI VÁLTOZÁS ("ÁTMENET") Kooperatív átmenet 65 pn-nál DNS-RNS hibrid Fűrészfog alakú átmenetek Egyenlő távolság a fogak között

5 Egyedi molekulák vizsgálata: manipuláció rugólapka technikákkal Egyedi molekulák vizsgálata: manipuláció mező alapú technikákkal Hogyan fogjunk meg egyetlen molekulát? MOLEKULA - FOGANTYÚ GEOMETRIA Lézerrel! Fénytörő mikrogyöngy Belépő fénynyaláb P 1 P 2 ΔP F=ΔP/Δt mikrogyöngy ~ 1 µm Tractor beam, Star Trek Enterprise A mikrogyöngyöket mint fogantyúkat alkalmazzuk. molekula ~ 1 nm

6 HOGYAN RAGADJUNK MEG EGY MOLEKULÁT? Például "molekulahegesztéssel"! Csomókötés egyetlen molekulafonálra lézercsipesszel Aktin filamentum DNS Fotoreaktív keresztkötők Fáziskontraszt kép Fluoreszcencia kép Nem-specifikus Fotoreaktív N 3 (azid) csoport UV megvilágítás Fluoreszcencia kép Arai et al. Nature 399, 446, A lézercsipesszel erőt is lehet mérni! A lézercsipesz virtuális rugó "Pikotenziométer" Lézercsipesz: virtuális rugó Latex gyöngy molekula Mozgatható mikropipetta Δx nanométer tartomány K.1-1 pn/nm F pikonewton tartomány Két lézersugaras optikai csipesz berendezés

7 Egyedi titinmolekulák vizualizálása AFM-mel AFM Egyedi miozin filamentumok vizualizálása Atomerő mikroszkópia Szintetikus miozin filamentum Egyedi miozinmolekulák feloldhatóak vizes közegben Random coil filamentum globuláris fejjel (C-terminális) Doméncsoportok korrelált organizációja miozin molekula fej farok 1 nm 1.6 Topografikus magasság (nm) Autokorreláció függvény Axiális távolság (nm) 2 nm Miozin filamentumok nanomechanikája AFM történelem Egymolekula erőspektroszkópia = Rugóállandó (pn/nm) * Elhajlás (nm) Periodicity of repetitive force peaks correlates with spacing of charged regions along backbone Oxigén atomok rhodium egykristály felületén Reverzibilis átmenetek (#) Nyújtás - Relaxáció # # # # Periodicitás 4.15 nm 8.3 nm Erő 14.3 nm Megnyúlás 43 nm Richard P. Feynman: There is plenty of room at the bottom december 29. a "nanovilág" léptéke: 1 nanométer

8 AFM Rugólapkák és hegyek Atomerő mikroszkóp (Atomic Force Microscope = AFM) bakteriorodopszin DNS fotodetektor rugólapka lézer minta DNS titin Piezoelektromos hatás Pásztázó tűszondás mikroszkópia (Scanning Probe Microscopy = SPM) Inverz piezoelektromos hatás Piezoelektromosság (Pierre és Jacques Curie, 188): "nyomáselektromosság" Direkt piezoelektromos hatás: bizonyos kristályokban mechanikai deformálásra fellépő elektromos polarizáció (P): Inverz piezoelektromos hatás: bizonyos kristályokban potenciálkülönbség hatására fellépő deformáció:

9 Rugólap méretei Rugólapkák készítése 1-4 μm,3-2 μm 1-2 μm AFM alapok Pásztázó képalkotás Képalkotási módok Oszcillációs mód biológiai minták esetében ideális. Kontakt mód Emberi hajszál rugólapka fotodetektor lézer Oszcillációs vezérlő jel rugólapka 2 µm Detektált jel Amplitudó Z-piezo: vertikális mozgatás f=5-4khz minta A tű a felszínt követi, konstans amplitudó mellett. Magasság kontraszt Amplitudó kontraszt Fázis kontraszt

10 Ideális képalkotás feltételei Felszín: kösse a mintát Nem specifikus kötés: csillám, grafit. Specifikus kötés: keresztkötőkkel (amino-, carboxil-, SH-csoportok) Képalkotási hibák, felbontás A felszín legyen sima (lehetőleg atomi simaságú csillám, grafit) Rugólap: legyen kellően flexibilis, k 5,3 N/m. Rugólap tűje: nem alakulhat ki erős interakció a minta és a tű között átmérője legyen minél kisebb : 5-8nm. Minta: legyen minél laposabb ne legyen viszkózus Az AFM hátrányai Időfelbontás: perces nagyságrendbe esik Csak felszínhez kötött minta vizsgálható Csak felszínen zajló folyamat követhető nyomon Béta-amyloid fibrillumok DNS Vvt kenet Fibrin hálózat

11 HeLa sejtek Képek: ATP-szintáz Képek: endotél sejtek Nanolitográfia Lithos: kő, gráfia: rajzolni fotodetektor lézer rugólapka felszín Pablo Picasso: "Don Quixote" polikarbonát felszínbe rajzolva 1 μm

12 Nanolitográfia Nanolitográfia 1µm Szekvenciális két-hullámhossz STIRF-AFM Lágy minta manipulációja STIRF- AFM segítségével Height Amplitude Sejt abláció Filamentum hasítás Előtt Után Előtt Után * Actin Cytokeratin * * 1 µm 5 µm 1 µm Pancreas carcinoma cells

13 Molekulanyújtás atomerőmikroszkóppal alapelvek Termikus rugólapka-kalibráció Termikusan gerjesztett rugólapka: harmonikus oszcillátor m Rezgés (Amplitudó) 2 Termikusan gerjesztett rugólapka kitérésének Fourier spektruma Frekvencia (khz) Titin: rugalmas molekuláris gyöngyfüzér Izomköteg Titinmolekula nanomechanikája lézercsipesszel Izomrost Erőválasz Erővezérelt szerkezetváltozások: Nemlineáris rugalmasságra szuperponált domén kitekeredés Összehúzódás Z Vékony filamentum Titin I-szakaszbeli szegmens M Szarkomer Vastag filamentum Miofibrillum Z A ~28 nm Nemlineáris rugalmasság Domén kitekeredés C Megnyúlás (µm) B F E D Nemlineáris rugalmasság A-B C D E F Ig-domén (7-szálú ß-hordó) tandem Ig-régió PEVKdomén tandem Ig-régió A domének egymás után, a mechanikai stabilitásuk növekvő sorrendjében tekerednek ki.

14 Szívizom N2-B NH 2 NH 2 A titin nanomechanikai boncolása Alternatív hasítás: I1 I15 N2-B I27 I84 I15 Vázizom (soleus) I1 I15 Konstitutívan kifejeződő tandem Ig régió I27 I79 N2-A PEVK I84 I15 Differenciálisan kifejeződő tandem Ig régió Ig domén PEVK domén I55-62 I II III Klónozott és mechanikailag manipulált titin fragmentumok Egyedi szekvencia Konstitutívan kifejeződő tandem Ig régió COOH COOH Titin PEVK: hangolható rugó Force (pn) 12 pn PEVKI nm Entrópikus (féregszerű) lánc Perzisztenciahossz (Lp) Az összehúzódást az entrópiamaximumra törekvés vezérli Effektív perzisztenciahossz (nm) Lp PEVKI Lp PEVKII Lp PEVKIII Ionerősség (mm) Elektrosztatikus merevedés - Flexibilitás nő: ionerővel a C-terminális felé Kontrakció Titin I55-62: viszkoelasztikus elem A titin doméneket párhuzamosan csatolt H-hidak stabilizálják Kitekeredési események ΔL = 29.8 ± 3.5 nm 2 pn 5 nm Gyakoriság Erő Erő Kitekeredési erő (pn) 4 Erő

15 A mechanikai stabilitás biológiai logikája Szerkezetet összetartó H-hidak párhuzamos csatolása Nagy kitereredési erő Makroszkópikus mechanikai stabilitás Effektív ragasztóanyag a párhuzamos csatolás elvén Szerkezetet összetartó H-hidak soros csatolása Alacsony kitereredési erő Mesterséges gecko talp Nanotechnológiával készítve Gecko talp felületi tapadása: Párhuzamosan csatolt Van der Waals kötések a serték és a felület között A megnyújtott titin bejárja a gombolyodási fázisteret Vajon milyen útvonalon? Titin nanomanipulálás erővisszacsatolt lézercsipesszel Force (pn) Erő Natív Native Feltekert Folded WLC WLC Részlegesen Partially unfolded gombolyodott Unfolded WLC Kitekert WLC 2 Unfolded Kitekert Extension (µm) Megnyúlás Spontán gombolyodási folyamat: Diffúzió az energiaprofilon? Konformációs tér Natív állapot sulfo-sanpah keresztkötővel bevont latex gyöngy mozgatható mikropipetta T12 anti-titin ellenanyaggal bevont gyöngy titin Mért jel (/-) (erő) Vezérelt kimenet (/-) (piezo mogás) Referencia jel (erő) Σ Feedback vezérlés Csapdázott gyöngy Mozgatott gyöngy

16 Konstans-erő kísérlet egyetlen titinmolekulán Titin kitekeredés konstans erőnél 3 Lépcsőméret eloszlás 28.2 ± 14.6 SD Megnyúlás (nm) Kvázi erőrámpa x1 6 Idő (1 3 s) ~2-perces adatsor High-force clamp Low-force clamp Kiteredési görbe Visszatekeredési görbe Megnyúlás (nm) Monoexponenciális Singleexponential görbeillesztés fit Megnyúlás (nm) ~28 nm lépcsők x1 3 Idő (s) x1 3 Idő (s) A várttól eltérések mutatkoznak a lépcsőméret eloszlásban, a monoexponenciális idő-megnyúlás görbe lefutásában és az erőfüggő sebességi állandó összefüggésben. Freqency Rate constant (s -1 ) Megnyúláslépcsők többsége: egyedi doménkitekeredési esemény Step size (nm) Erőfüggő sebességi állandók Feedback force (pn) Megnyúlás (µm) Doménkitekeredés hirtelen ugrásokban Idő (s) Kitekeredési ugrások Doméncsoportok korrelált szerkezeti elrendeződést mutatnak fej farok 1.6 Topografikus magasság (nm) Autokorreláció függvény Axiális távolság (nm) Kellermayer et al. BBA Bioenergetics doménből álló csoportok kooperatíven tekeredhetnek ki. Megnyúlás (µm) Szerkezeti átmenetek alacsony erőnél Nagy lépcső (>1 nm) Elsimult átmenet Idő (s) Az elsimult és nagy, lépcsőszerű átmeneteket a PEVK doménben kialakuló rövid- és hosszútávú elektrosztatikus kölcsönhatások okozhatják, amelyek a mechanikai fáradás alapjául szolgálnak. 8 pn 7 pn 6 pn 5 pn 4 pn 3 pn 2 pn 1 pn 5 pn Molekuláris fáradás Sima Nagy lépcső T12 9D1 (PEVK) Domén kitekeredés Megnyúlás (μm) Z Trombitás et al. J. Struct. Biol Titin T12 és 9D1 ellenanyagokkal megragadva Megnyúlás (μm)

17 Megnyúlás (nm) Titin gombolyodás konstans erőnél Kitekert állapot Gyors kontrakció (entrópikus kollapszus) Szerkezeti fluktuációk (A fázis időtartama rövidül az erő csökkenésével) Végső kontrakció (ritkán tapasztalható) Teljesen feltekert állapot x1 3 Idő (s) Az erőt ~3 pn alá kell csökkenteni jelentős domén visszatekeredéshez. A fluktuáció diffuzív keresés a konformációs térben. Részleges viszatekeredés: doméncsoportok kooperatívan tekeredhetnek. Kitekeredés Megnyúlás (μm) Megnyúlás (μm) Fluktuációk Domén unfolding ~7 nm Idő (s) Idő (s) 4 pn Fluktuációk Részleges refolding Megnyúlás (nm) A visszatekeredési útvonal változatos még egyetlen molekula esetén is x1 3 Idő (s) Erővezérelt ki- és visszatekeredés Titinben: -Kooperatív kitekeredés -Mechanikai fáradás -Diffuzív keresés a konformációs térben -Kooperatív visszatekeredés -Mechanikai erő és random fehérjeszakaszok modulálhatják a gombolyodás folyamatát