Fehérjék nanomechanikai tulajdonságainak vizsgálata Atomi Er Mikroszkópiával NEMES CSILLA

Átírás

1 DOKTORI ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Fehérjék nanomechanikai tulajdonságainak vizsgálata Atomi Er Mikroszkópiával NEMES CSILLA Témavezet : Dr. Rozlosnik Noémi ELTE, Biológiai Fizika Tanszék Semmelweis Orvostudományi Egyetem Doktori Iskola Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai Programvezet : Dr. Rontó Györgyi 2002

2 Kutatási célkit zések és módszerek Az utóbbi évtizedekben fontossá vált a felületek lokális mechanikai és adhéziós tulajdonságainak, valamint a nanoskálájú intra- és intermolekuláris kölcsönhatásoknak fiziológiás környezetben való vizsgálata. Molekuláris felbontású szerkezeti vizsgálatok hagyományos mikroszkópos és spektroszkópiás technikákkal végezhet k. A makromolekulák funkcionális tulajdonságai pedig különböz biokémiai és molekuláris biológiai módszerekkel vizsgálhatók. Következtetések levonását a különböz módszerekkel nyert szerkezeti illetve funkcionális információkból nehezíti, hogy az eljárások eltér minta-el készítést igényelnek. Ugyanakkor ezekkel a módszerekkel nagyon kevés információ nyerhet a biológiai molekulák felszínér l, lokális felületi tulajdonságairól, a molekulán belül és a molekulák között ható er kr l. Ezen a téren nagy el relépést jelentett az atomi er mikroszkópia (AFM) kifejlesztése és felhasználása nanoskálájú er mérésekre. A lokális er spektroszkópia segítségével a felület egy jól meghatározott pontján felvesszük az er -

3 távolság függvényt, ahol a távolság alatt a t z-irányú elmozdulását értjük, az er pedig egyenesen arányos a t t hordozó rugólapka elhajlásával. A görbe alakjából és a kezdeti meredekségb l következtethetünk a minta felületi tulajdonságaira (lokális adhézió, deformálhatóság), információkat kaphatunk a a biológiai makromolekulák között fellép er k nagyságáról, egyes kémiai kötések er sségér l. A fent említett tulajdonságok vizsgálata az utóbbi id ben egyre nagyobb hangsúlyt kapott, hiszen ezek a nanoskálán m köd kölcsönhatások határozzák meg az anyagok makroszkópikus tulajdonságait. Így pl. a mikroszkópikus adhézió számos folyamatot nagymértékben befolyásol: a különböz festékek és ragasztók hatékonyságát, a gyógyszerek hatásmechanizmusát. Szintén fontos az anyagok mikroszkópikus rugalmasságának ismerete, mivel ez határozza meg a különböz rendszerek szerkezeti és dinamikus jellemz it. Fontos a különböz makromolekulák között fellép nano- vagy pikonewton nagyságú er k ismerete és tanulmányozása is, mivel minden biológiai, biokémiai folyamatot (DNS replikáció,

4 fehérje szintézis, enzim reakciók, a specifikus és nemspecifikus antigén-antitest komplex kialakulása, stb.) az intermolekuláris er k határoznak meg. Tudjuk, hogy az oldat ionösszetétele befolyásolja a fehérjék szerkezetének stabilitását és felületi tulajdonságait, s ezek közül is leginkább az oldhatóságát. Vannak olyan ionok, amelyek stabilizálják a natív szerkezetet, de csökkentik az oldhatóságot. Ezek általában polárosak és úgy befolyásolják a fehérjéhez kötött víz szerkezetét, hogy az a szerkezet stabilitását fokozza. Ilyenek például a foszfát-ion, szulfát-ion. Más ionok csökkentik a stabilitást és növelik a fehérjemolekulák oldhatóságát, roncsolják a víz térhálós szerkezetét, mint például a tiocianát-ion. A klór-iont semlegesnek tekintjük, ugyanis alig van hatása a víz szerkezetére és M-os koncentráció tartományban a fehérjékre sem gyakorol hatást. A doktori értekezésemben két különböz, de bizonyos pontokon mégis kapcsolódó témával foglalkoztam: fehérjék nanomechanikai tulajdonságainak vizsgálatával és a fehérjéket alkotó alegységek kitekeredéséhez szükséges er meghatározásával. A

5 különböz fehérjéken végzett er -méréseim további kísérletek kiindulópontjául szolgálnak, amelyek arra irányulnak, hogy összefüggést találjunk a fehérjék nanomechanikai és adhéziós tulajdonságainak változásai és a sejtek szerkezetében és m ködésében bekövetkezett változások között. A vizsgált fehérjék fontos szerepet játszanak a szervezetben. Az extracelluláris mátrixot alkotó két nem kollagén-szer fehérje, a laminin-nidogén komplex és a tenascin, kulcsfontosságúak a sejt alakjának meghatározásában, a sejt-sejt közötti adhézióban. Az albumin és a metallothionein ([1], [2]) részt vesznek számos anyag, ligandum, fém szállításában, homeosztázisuk fenntartásában és más folyamatban. A lizozim enzim aktivitással rendelkezik és a szervezet baktériumok elleni védelmében játszik fontos szerepet. A nanomechanikai méréseinkben a lizozimet, mint modell fehérjét használtuk, mivel kis molekulatömeg, globuláris (14kD és 129 aminosavból áll) fehérje, amely kísérleti körülményeink között könnyen letapasztható a szilárd hordózóra (csillámra).

6 Tudományos eredmények 1. Az er -spektroszkópai módszerrel különböz ionösszetétel és ion-er sség oldatokban felvettem az er - elmozdulás görbéket az AFM t mozgási sebességét változtatva. A különböz sebességeken felvett görbék hiszterézisének változásából az alábbi következtetéseket vonhatjuk le: 1.1. Az AFM t mozgási sebességének viszonylag kis tartományában (hozzávet legesen 60 és 280 µm/s közötti tartományban) a fehérje-réteg newtoni folyadékként viselkedik és ebben a tartományban jó közelítéssel alkalmazható Stokes törvénye, amib l a réteg viszkozitását kiszámíthatjuk [3] A viszkozitás az intermolekuláris súrlódás következménye, amely az oldat összetételével változik. Az általam használt ionok esetében a kapott viszkozitás eredmények összhangban vannak a Hofmeister-sorozat ionjainak a fehérjék oldhatóságára és stabilitására gyakorolt makroszkópikus hatásáról leírt megfigyelésekkel.

7 1.3. A viszkozitás legmagasabb értékét a foszfát-ionok jelenlétében figyeltem meg. A Hofmeister sorozatban a foszfát-ionok csökkentik a fehérje molekula oldhatóságát, tehát a fehérje rétegnek valószín leg kisebb lesz a szabad-víz tartalma. Ez megnövelheti a molekulák között adhéziós er t, és ez jelentkezik a viszkozitás növekedésében. Ennek megfelel en, a legalacsonyabb viszkozitást a tiocianát-ion jelenlétében figyeltük meg, amely annak a következménye, hogy több szabadon mozgó vízmolekula került a fehérjerétegbe. A klorid ionok a várakozásunknak megfelel en köztes hatást gyakoroltak A fehérje molekula deformálhatósága, a k p, a tiocianát-ionok jelenlétében a legkisebb, amely összhangban van a destabilizáló hatással, és a legnagyobb a stabilizáló hatású foszfát jelenlétében [3] Laminin esetében nem tudtuk ugyanazt a megközelítést használni a molekularéteg jellemzésére, mint amit a lizozim molekula esetében. A magyarázat az, hogy a fehérjerétegben a

8 molekulák er sen kötött hexagonális térszerkezetet alkotnak, és így a réteg még közelít leg sem viselkedik newtoni folyadékként. 2. A fehérjeláncot alkotó alegységek küls er hatására történ ki/visszatekeredési (folding/unfolding) folyamatai a molekula mechanikai stabilitását jellemzik. Nagyon sok fehérje mechanikai szerepet is betölt az él rendszerekben, ilyenek pl. az izomfehérjék és a sejtvázat ill. a sejtek közötti állományt alkotó fehérjék. Ezért ezen molekulák mechanikai stabilitásának vizsgálata további szerkezeti tulajdonságokkal kapcsolatos információt szolgáltathat. Ezek a fehérjék polipeptid-láncuk jellegzetes "kitekeredésén" keresztül fejtik ki funkcióikat A humán szérum albumin mechanikai er hatására történ ki/visszatekeredési folyamatait vizsgáltuk, meghatározva egy-egy alegység kitekeredéséhez szükséges er nagyságát illetve két csúcs közötti távolságot, amely egy kitekeredett alegység hosszának felel meg Az albumin ph függ konformációs átalakuláson megy keresztül, amely az er méréseken is megfigyelhet. Savas ph-n egy alegység

9 kitekeredéséhez szükséges er és két er csúcs közötti távolság lecsökkent. Ez azzal magyarázható, hogy alacsony ph-n az inter- és intramolekuláris er k átrendez dnek, s a fehérje-lánc konformációja lazább lesz A laminin molekulán mért er -elmozdulás görbék összetettek, hiszen a fehérje több nyújtható alegységbõl áll: (α-helikális régiók, α-helixet és β- lemezkét tartalmazó globuláris alegységek). Így az er -elmozdulás görbék értelmezése bonyolultabb feladat. A görbéken megjelen csúcsok egymástól való távolságának és a hozzájuk tartozó er knek eloszlás-függvényéb l egyértelm en meg lehetett határozni, hogy melyik alegység kitekeredésére jellemz ek a csúcsok [4] A kitekeredési er kre kapott mérési eredményeink alapján megállapítottam, hogy a laminin molekulát alkotó globuláris alegységek átmenetet jelentenek azon struktúrák között, amelyek csak α-helixb l vagy csak β-lemezkékb l állnak.

10 A doktori értekezés téziseihez kapcsolódó közlemények [1] Zs. Szitányi, Cs. Nemes and N. Rozlosnik: "Metallothionein and heavy metal concentration in blood" Microchemical Journal 54, (1996) [2] Zs. Szitányi, Cs. Nemes and N. Rozlosnik. "Lead detoxification: the roles of essential metals and metallothionein" Central European Journal of Enviromental and Occupational Medicine 4 (1), (1998) [3] Cs. Nemes, J.J. Ramsden, N. Rozlosnik "Direct measurement of the viscoelasticity of adsorbed protein layers using atomic force microscopy" Phys. Rev. E. 60(2), R1166-R1169 (1999) [4] Cs. Nemes, J.J. Ramsden, N. Rozlosnik "The unfolding of native laminin investigated by atomic force microscopy" Physica A (2002)

11 Közlemények konferencia kiadványokban [5] Cs. Nemes, J.J. Ramsden, N. Rozlosnik "Direct measurement of nanomechanical properties of thick layer of lysozyme" Polymer Preprint 39(2), (1998) Magyar nyelv közlemények [6] Rozlosnik N., Nemes Cs., Glavák Cs. "Pásztázó er méréses mikroszkópia " Modern fizikai mérések biológusoknak, jegyzet, szerk.: Rozlosnik Noémi (ELTE, 1999) [7] Nemes Cs., Ramsden, J.J., Rozlosnik N. "Atomer -mikroszkópos mérések biológiai alkalmazásai" Fizikai Szemle 2, (2002)