A negyedleges szerkezet szerepe a kis hő-sokk fehérjék

Átírás

1 A negyedleges szerkezet szerepe a kis hő-sokk fehérjék chaperon működésében Készítette: Böde Csaba Témavezető: Dr. Fidy Judit egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola Szigorlati Bizottság Elnök: Dr. Németh János egyetemi tanár, orvostudományok doktora Tagok: Dr. Simon István, biológiai tudományok doktora Dr. Gróf Pál, egyetemi docens Bírálók: Dr. Nyitrai Miklós, egyetemi docens Dr. Bauer Pál, egyetemi docens Budapest 2006

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés, irodalmi áttekintés A dajkafehérjék A kis hő-sokk fehérjék Az oligomer szerkezet Az -krisztallin Methanococcus jannaschii HSP Nagy nyomás alkalmazása a fehérjék szerkezetvizsgálatában Kémiai paraméterek hatása Célkitűzés Anyagok és módszerek Fehérjeminták készítése ph sokk Nagy nyomás Chaperon aktivitás mérése Fluoreszcencia mérések Triptofán fluoreszcencia ANS jelölés FTIR spektroszkópiai mérések Mintakészítés Sztatikus fényszórás Eredmények Nagy nyomásos kísérletek Chaperon aktivitás mérések Szerkezeti mérések A negyedleges szerkezet változásai ph sokk kísérletek Chaperon aktivitás mérések A másodlagos szerkezet változásai A negyedleges szerkezet változásai

3 4. Az eredmények megbeszélése A chaperon aktivitás változása Szerkezeti változások Nagy nyomás Rövid ideig tartó ph sokk Összegzés Utószó, további kérdések Következtetések 69 Összefoglalás 71 Summary 72 Irodalomjegyzék 73 Saját közlemények jegyzéke 89 Köszönetnyilvánítás 92 3

4 Rövidítések jegyzéke ANS 5-dimetilamino 1-naftalénszulfonsav CD cirkuláris dikroizmus spektroszkópia DTE ditioeritritol FTIR Fourier transzformációs infravörös spektroszkópia HSP hő-sokk fehérje (Heat Shock Protein) HSP33 33 kda tömegű hő-sokk fehérje HSP60 60 kda tömegű hő-sokk fehérje család HSP70 70 kda tömegű hő-sokk fehérje család HSP90 90 kda tömegű hő-sokk fehérje család HSP kda tömegű hő-sokk fehérje család IR Infravörös shsp kis hő-sokk fehérje (Small Heat-Shock Protein) TEM transzmissziós elekronmikroszkópia 4

5 1. fejezet Bevezetés, irodalmi áttekintés 1.1. A dajkafehérjék A fehérjék működőképes állapotához tartozó térszerkezetet fiziológiás körülmények között a fehérje aminosavsorrendje egyértelműen meghatározza [1] (az újabb kutatások alapján legalábbis a fehérjedomének szintjén [2]), azonban a fehérjék egy része képtelen külső segítség nélkül megtalálni ezt a szerkezetet. Az élő szervezetben egy külön fehérjecsalád, a dajkafehérjék (stresszfehérjék) vagy más néven chaperonok vesznek részt a fehérjék natív állapotának kialakításában, illetve stresszes körülmények közötti stabilizálásában. A chaperonok közé szerkezetét és funkcióját tekintve sokféle fehérje tartozik. Szerkezeti és működésbeli hasonlóság alapján családokba szokták sorolni ezeket a fehérjéket, legismertebbek a HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 fehérjecsalád és a kis hő-sokk fehérjék. A főbb dajkafehérje családokat összefoglalva az 1.1 táblázat, a fehérjék és a sejt életében betöltött szerepüket pedig az 1.1 ábra mutatja. Normális körülmények között a chaperonok a fehérjék felgombolyodásában játszanak szerepet. Ha a szervezetet valamilyen sokk vagy stressz éri (sokk, illetve stressz alatt értünk bármilyen olyan hatást, amely a fehérjékre veszélyt jelent: például magas hőmérséklet, oxidáció, ozmotikus változások) a fehérjék szerkezete sérül. Így kialakul egy átmeneti (intermedier) állapot, ahonnan külső segítség nélkül a fehérjék legtöbbször könnyen aggregálódhatnak. Ez az aggregáció nagyon veszélyes lehet, ugyanis az így aggregálódó fehérjék natív szerkezete általában nem állítható vissza, valamint számos betegség (amiloidózis [3], szürkehályog [4]) molekuláris eredete aggregációra vezethető vissza. Ezt az 5

6 1.1. táblázat. A főbb dajkafehérje családok, és egyes tagjaik. F. Narberhaus után [7] család példa fő feladat hivatkozás HSP100 ClpB fehérjeaggragátumok disszociációja [8] ClpA proteáz komplex [9] SC charonin DegP proteáz és chaperon [10] HSP60 GroEL fehérjék betekerése [5], [6] HSP70 DnaK fehérjék betekerése [5], [11] HSP33 HSP33 oxidatív sokk, [12] aggregáció elleni védelem HSP90 HtpG aggregáció elleni védelem [13], [14] shsp -krisztallin aggregáció gátlás [15], [7] MjHSP16.5 aggregáció gátlás [16], [17] aggregációt gátolják meg a kis hő-sokk fehérjék és a HSP90 család tagjai. Vegyük most sorra röviden a különböző chaperon családokat! A HSP60 az egyik legrégebben ismert chaperoncsalád, és a HSP70-el együtt a legjobban ismert dajkafehérjék közé tartoznak. Mind a két család tagjai megfelelő segédfehérjékkel közösen a fehérjék feltekeredésében, a megfelelő térszerkezet kialakításában vesznek részt. A különböző elektronmikroszkópos és röntgendiffrakciós felvételek alapján a HSP60 működési mechanizmusa jól ismert [5, 6]. Működésében a fehérje hidrofób központi ürege játszik fontos szerepet. Ez a teljes betekerendő fehérjét (illetve nagyméretű fehérjék esetében egy szerkezeti egységét) egyszerre köti meg, és nagymértékű konformációváltozásokkal segíti elő a betekeredést. Vele szemben a HSP70 a szubsztrát (segítendő fehérje) csak egy kis részét köti meg, ezáltal már a transzláció (átíródás) közben is segítheti a fehérje betekeredését. A HSP70 fehérje pontos működési mechanizmusa még nem ismert. A HSP90 család tagjainak fő feladata a fehérjék aggregációjának gátlása. Eukariótákban a HSP90 számos jelátvivő és sejtciklust szabályozó molekula tekeredésében játszik fontos szerepet [13, 14]. A HSP90 ATP-t kötő molekula, az ATP kötődése a fehérjében konformáció változást idéz elő [18]. A fehérje in vivo aktivitásához az ATP kötődése elengedhetetlen [19], habár in vitro ATP nélkül is mérhető chaperon aktivitás. A fehérjék 6

7 Fehérjeszintézis DEGRADÁCIÓ HSP100 (s)hsp kötött HSP70 HSP60 shsp HSP90 HSP70 Polipeptidlánc HSP60 HSP70 NATÍV konformáció STRESSZ INTERMEDIER AGGREGÁCIÓ AGGREGÁCIÓ 1.1. ábra. A chaperonok szerepe a fehérjék szintézise során, illetve stresszes körülmények között aggregációjának gátlásában a HSP90 mellett a kis hő-sokk fehérjék játszanak fontos szerepet. A HSP100 családba tartozó fehérjék elsődleges feladata a kis hő-sokk fehérjék vagy a HSP90 által kötött sérült fehérjék újra oldhatóvá tétele, a chaperon-szubsztát komplex szétbontása. Az így felszabadított sérült fehérjéknek kétféle sorsuk lehet. Az egyik lehetőség az, hogy más chaperonok a HSP60 és HSP70 család tagjai tekerik őket vissza natív állapotukba [8], a másik lehetőség, hogy a sérült fehérjéket a proteázok lebontják. Ezek ismeretében nem meglepő, hogy nagy hasonlóság van a HSP100 család tagjai és a proteázok között. Például az úgynevezett "SC charonin" fehérjéknél ugyanaz a fehérje lehet a körülményektől függően proteáz illetve chaperon is. A család egyik tagja a DegP proteáz, amelynél a hőmérséklet dönti el, hogy chaperonként vagy proteázként működik-e [10]. A HSP33 fehérje nem sorolható be a nagy stresszfehérjecsaládok egyikébe sem. Számos más chaperon működését is befolyásolja a környezet redox potenciálja, azonban úgy tűnik, hogy az E. coli baktériumból izolált HSP33-nak kifejezetten az oxidatív sokk elleni védelem az elsődleges feladata [12]. Nagyon valószínű, hogy léteznek a HSP33-al homológ fehérjék az eukariótákban is, felfedezésük csak idő kérdése. Ebből a leírásból és az 1.1 ábrán is látható, hogy a kis hő-sokk fehérje családok szorosan együttműködnek egymással a fehérjék tekeredése, illetve a stresszes körülmények kompenzálása során. 7

8 Az irodalomban aggregáció alatt több folyamatot is értenek. A szó tágabb értelmében aggregációnak neveznek minden olyan folyamatot, mely során nagyméretű fehérjekomplexek keletkeznek. Így aggregátumnak hívják az egyes fehérjéknél kialakuló amiloid fibrillumokat, a kis hő-sokk fehérjék és szubsztrátjaik által alkotott komplexeket valamint egyes esetekben natív fehérjék által alkotott fehérjekomplexeket is. Ezen aggregátumok biológiai szerepe más és más, gyakran az is erősen kérdéses, hogy az aggregátumokat alkotó fehérjék szerkezete milyen, denaturált vagy natív-e A kis hő-sokk fehérjék A kis hő-sokk fehérjék (shsp vagy más néven -hő-sokk fehérjék [7]) a dajkafehérjék egyik legsokszínűbb családját alkotják [17, 20, 21]. Az archebaktériumoktól a gerincesekig szinte minden élő szervezetben megtalálhatóak, azon kevés kivétel mindegyike ahol mégsem, parazita vagy patogén mikroorganizmus [7, 22, 23]. A család tagjai közti homológia sokkal kisebb, mint más dajkafehérje családokban, azonban minden kis hő-sokk fehérje közös vonása a körülbelül 80 aminosav hosszúságú -krisztallin domén, amely a család egyik fontos tagjáról, a szemlencsében felfedezett -krisztallinról kapta a nevét [24]. Ennek az -krisztallin doménnek a jelenléte alapján (azaz szerkezeti, és nem funkcionális alapon) azonosítják a család különböző tagjait. Az élő szervezetben többféle kis hő-sokk fehérje található. Az ősbaktériumok kivételével, ahol egy vagy két kis hő sokk fehérje van, a sejtben a kis hő-sokk fehérjék száma tízes nagyságrendű is lehet [25]. Általánosságban elmondható, hogy a kis hő-sokk fehérjék száma korrelál a genom méretével [7]. A humán genom tíz, HSPB1-HSPB10-nek nevezett kis hő-sokk fehérjét tartalmaz [26], amelyek előfordulása szövetenként különböző (1.2 táblázat). Jelenlegi tudásunk szerint a kis hő-sokk fehérjék nem vesznek részt közvetlenül a fehérjék újratekerésében. Elsődleges feladatuk a stressz hatására aggregálódó fehérjék megkötése [38]. A legújabb kísérleti eredmények alapján a kis hő-sokk fehérjék szorosan együttműködnek a HSP100 fehérjecsalád tagjaival, ugyanis az utóbbi fehérjék vesznek részt a kis hő-sokk fehérjék által megkötött aggregálódó fehérjék fellazításában [39, 40]. Az a kérdés, hogy a kis hő-sokk fehérjék szubsztrátjaikkal alkotott komplexei fehérjeaggregátumnak tekinthetők-e vagy sem, és ha igen, akkor ezt az aggregátumot mi jellemzi, még 8

9 nem teljesen tisztázott [41, 42]. Fehérjeaggregáció a kis hő-sokk fehérjék jelenlétében is végbemegy, azonban jelenlegi tudásunk alapján úgy látszik, hogy a kis hő-sokk fehérjéket tartalmazó fehérjeaggregátumok szerkezete más, mint az e fehérjék hiányában létrejötteké; a kis hő-sokk fehérje kötött aggregátumokból nagyobb eséllyel állítható helyre az aggreátumokat alkotó fehérjék szerkezete [39]. Így a kis hő-sokk fehérjék kötődésének elsődleges célja valószínűleg az, hogy a sérült, aggregálódó fehérjét újratekeredésre alkalmas állapotban tartsák [43, 44]. A kis-hő sokk fehérjék további haszna, hogy a sejtet megvédik a sejt számára káros aggregátumoktól, így például gátolják az amiloid fibrillumok kialakulását [45, 46]. A foszforiláció szerepe vitatott a kis hő-sokk fehérjék működésében. Valószínűnek látszik, hogy a humán HSP27 esetében a foszforiláció a fehérje fő szabályozási mechanizmusa [47]. Több kis hő-sokk fehérje esetében kimutatták, hogy foszforilációjuk a fehérje disszociációjához vezet [48, 47]. Foszforilált A és B krisztallint a szemlencséből is izoláltak [49]. Az, hogy a foszforiláció illetve az ATP kötődés a chaperon aktivitás növekedését vagy csökkenését okozza, vitatott. Muchowski és munkatársai ATP kötődését követően az aktivitás növekedését figyelték meg [50], Ito és munkatársai a fehérje foszforilációjának mutációval történt mimikálása után aktivitáscsökkenésről számoltak be [48]. Például az B krisztallin esetében a 45-ös pozícióban található szerin foszforilációja az oligomer 1.2. táblázat. A humán kis hő-sokk fehérjék, G. Kappé munkája nyomán [26] fehérje alternatív elnevezés előfordulás hivatkozás HSPB1 HSP27, HSP25 szív, vázizomzat [27] HSPB2 MKBP szív, vázizomzat [28], [29] HSPB3 HSPL27 szív [30] HSPB4 A-krisztallin szemlencse [15] HSPB5 B-krisztallin szemlencse, szív, vázizomzat [15] HSPB6 HSP20, p20 szív, vázizomzat [31] HSPB7 cvhsp szív, vázizomzat [32] HSPB8 H11, HSP22 szív, vázizomzat [33], [34], [35] HSPB9 - csecsemőmirigy [36] HSPB10 ODF1 csecsemőmirigy [37] 9

10 szerkezet szétesését és a chaperon aktivitás csökkenését okozza [51]. Mások feltételezik az ATP szerepét a megkötött szubsztrátok elengedésében [52]. Az ellentmondások hátterében a különböző vizsgálati módszerek állhatnak, illetve az, hogy a foszforilációnak esetleg a kis hő-sokk fehérjék más, kevésbé ismert funkciójában lehet szerepe. Nagyon valószínű, hogy nem csak a más fehérjék aggregációjának gátlása a kis hő-sokk fehérjék egyedüli feladata. Ezt erősíti az is, hogy például a kis hő-sokk fehérjék családjába tartozó C. elegans HSP12.2-nek és a HSP12.3-nak nincs chaperon aktivitása, holott szerkezetük alapján a kis hő-sokk fehérjék családjának tagjai [53]. Más esetekben, például a HSP27 és az -krisztallin esetén kimutatták, hogy képesek gátolni az aktin polimerizációját [54, 55], illetve képesek az aktin filamentumok stabilizálására [56]. Ez arra utal, hogy a kis hő-sokk fehérjéknek szerepe lehet a sejtváz stabilizálásában is [57, 58]. A kis hő-sokk fehérjék további fontos szerepét feltételezik a programozott sejthalál, az apoptózis gátlásában. Az apoptózis az elő szervezet normális működésének része, azonban stresszes körülmények között az apoptózis folyamata esetleg túl korán elindul, és a sok elpusztult sejt nyilvánvalóan káros a szervezetnek. A humán HSP27 és az B-krisztallin az apoptózis során számos ponton kölcsönhat az apoptózisban fontos szerepet játszó kaszpáz fehérjékkel, lehetőséget adva az apoptózis gátlására [59]. Mindezen eredmények is mutatják, hogy a korábbi elképzelésekkel ellentétben a kis hő-sokk fehérjék nem csak más fehérjék védelmében, hanem számos sejtes folyamatban is fontos szerepet játszanak Az oligomer szerkezet A kis hő-sokk fehérjék monomer egységeinek (alegységeinek) molekulatömege 12 és 43 kda között van. Ezek az alegységek legtöbbször nagyméretű oligomereket képeznek. Az oligomer szerkezet kialakulása a chaperon működés előfeltétele [60, 61, 62]. A kis hő-sokk fehérjék oligomer szerkezete dinamikus, az alegységek az oligomerek között cserélődhetnek [63, 64, 65]. A kis hő-sokk fehérjék családján belül az egyes tagok oligomerizációja és az oligomer szerkezet stressz hatására bekövetkező változásai nagyon különbözőek lehetnek [66], az 1.2 ábra mutat erre pár példát. A legegyszerűbb esetben a monomerek (esetleg több lépcsőben) összeállnak nagyobb, chaperon aktivitással bíró oligomerekké. Például a MjHSP16.5 oligomerei 24 monomerből állnak (1.2 B ábra). Azonban a nagy oligomerek 10

11 A Myobacterium tuberculosis HSP16.3 Monomer Trimer Nonamer B Methanococcus jannaschii HSP16.5 (MjHSP16.5) Monomer Dimer 24mer C Egér HSP25 T Monomer Dimer Tetramer 16mer Granula D Élesztő HSP26 T Monomer 24mer Dimer Chaperone-szubsztrát komplex 1.2. ábra. A kis hő-sokk fehérjék különböző oligomerizációs formái és ezek kialakulása Narberhaus nyomán [7] jelenléte nem minden esetben feltétele a chaperon aktivitésnak. A Myobacterium tuberculosis HSP16.3 oligomerei 9 alegységből épülnek fel [67], ami 150 kda-os oligomertömegnek felel meg. A 9 alegységből álló oligomert 3 darab kisebb egység, trimer alkotja (1.2 A ábra). A nonamerek és trimerek között dinamikus egyensúly áll fent, a nonamerek szétesése valószínűleg a chaperon működés egyik feltétele [68]. Ezideig csak három kis hő-sokk fehérje röntgendiffrakciós szerkezete ismert, a Methanococcus jannaschii archebaktériumból a 16.5 kda tömegű stresszfehérjéé [69], a búzából a HSP16.9-é [70], valamint a Taenia saginata szalagféregből származó TSP36.5-é [71]. E fehérjéket azért sikerült kristályosítani, mert a negyedeleges szerkezetük jól meghatározott, a fehérje oligomerek egyformák. A Methanococcus jannaschii HSP16.5 (MjHSP16.5) 24 11

12 alegységből felépülő oligomerének építőkockái a röntgendiffrakciós adatok alapján a két alegységből felépülő dimerek (1.2 B ábra, 1.3 B ábra) [69]. E dimerek feltehetően stabilak, az alegységek közötti intermolekuláris -lemezek tartják őket össze. E szerkezeti motívum szinte minden kis hő-sokk fehérjére jellemző, és az intermolekuláris -lemezek jelenléte a fehérje infravörös spektrumán jól nyomon követhető. A dimerek között már csak másodlagos kölcsönhatások vannak. Ezt figyelembe véve nagyon meglepő, hogy az MjHSP16.5-nél kizárólag a nagy, 24 alegységből álló oligomer formát figyelték meg, különálló dimereket nem találtak. Érdekes kérdés, hogy mindezek mellett hogyan tud a fehérje oligomer szerkezete dinamikus maradni, ugyanis az alegységek kicserélődése az MjHSP16.5 esetében is bizonyított [64]. Hasonló szerkezetet figyeltek meg a búzából származó HSP16.9 esetében [70]. A 12 alegységből felépülő dodekamer építőköve itt is a dimer, amit szintén a két alegység - lemezei közötti intermolekuláris -kölcsönhatások tartanak össze. A dimerek közti kölcsönhatások kiépülésében nagy szerepük van az alegységek C és N terminális végeinek. Számos más kis hő-sokk fehérje esetében is bizonyítékokat találtak az N terminális fontosságára az oligomer szerkezet kialakításában, illetve arra vonatkozólag, hogy az oligomerek dimerekből épülnek fel [72]. A fent bemutatott példáktól eltérő a Taenia saginata szalagféregből származó TSP36 kis hő-sokk fehérje szerkezete [73, 71]. A fehérje különlegessége, hogy egy alegysége két -krisztallin domént is tartalmaz [74], ehhez hasonló szerkezet a kis hő-sokk fehérjék között csak elvétve fordul elő [75, 76]. A röntgendiffrakciós szerkezet alapján [71] a fehérje oligomert összetartó kölcsönhatások mások, mint a többi kis hő-sokk fehérje esetében, ugyanis hiányzik az intermolekuláris -kölcsönhatás az alegységek között. A dimereket az alegységek N-terminális vége és az -krisztallin domének közti kölcsönhatás stabilizálja. A más kis hő-sokk fehérjék intermolekuláris -szerkezetére emlékeztető kölcsönhatás a molekulán belül csak egy helyen fordul elő: az alegységen belül, a két -krisztallin domén között. Azonban a kis hő-sokk fehérjék többségének pontos negyedleges szerkezete nem meghatározott, az oligomer populáció heterogén [17, 77], ezért érdemes egy kicsit bővebben is beszélni a kis hő-sokk fehérjék oligomerizációjáról. Az egér HSP25 fehérje érdekes példája a heterogén oligomer populációval rendelkező kis hő-sokk fehérjéknek: esetében több különböző méretű oligomer van jelen egyidejűleg. 12

13 A B 1.3. ábra. A Methanococcus jannaschii HSP16.5 oligomer szerkezete K.K. Kim munkája nyomán [69] A: röntgendiffrakciós modell alapján alkotott kép az MjHSP oligomerről, jól látható a belül üreges gömbszerű szerkezet. B: A két alegységből felépülő dimer. A dimerek, tetramerek és 16merek arányát a fehérjekoncentráció határozza meg (1.2 C ábra) [78]. Mérhető chaperon aktivitása a tetramereknek és a 16mereknek van. A hőmérséklet emelkedésével még nagyobb méretű fehérjeoligomerek (granulák) keletkeznek. Az -krisztallin vagy a HSP25 esetében a heterogén oligomer populációban találhatunk akár 10 MDa tömegű oligomereket is [79, 80]. A humán HSP27 viselkedése hasonló az egér HSP25-höz, azonban megfigyelték, hogy a fehérje foszforilációja az oligomerek disszociációjához vezet. A így keletkezett kisebb méretű oligomerek képtelenek a feladatukat ellátni, a nagyméretű oligomerek jelenléte a feltétele a chaperon működésnek [47]. A szemlencséből származó -krisztallin oligomer mérete is megnő a hőmérséklet emelkedés hatására [81]. J. Koretz és munkatársai ez alapján feltételezték, hogy ebben az esetben is korreláció van az oligomerek mérete és a chaperon aktivitás között [82]. Azonban, ahogy a HSP16.3 esetében láttuk, a nagy oligomerek jelenléte nem minden esetben feltétele a chaperon aktivitásnak. Például az élesztő HSP26 esetében a nagy, 24 alegységből álló oligomerek a hőmérséklet emelkedésével disszociálnak, és ez a disszociáció szükséges a chaperon működéshez [83] (1.2 D ábra). Kimutatták, hogy a sérült fehérjéket a dimerek kötik meg, amelyek ezután nagyméretű chaperon-szubsztrát komplexet képeznek. 13

14 Az oligomer szerkezet kialakulásában nagy szerepe van a kis hő-sokk fehérje alegységek N terminális végének [84, 85]. Szemlencséből izolált -krisztallin esetében megfigyelték idősebb korban az alegységek N terminális végének rövidülését és ezzel párhuzamosan az oligomerméret csökkenését [86]. Számos más mutációs vizsgálat is az N-terminális vég fontosságára mutat rá [87]. Giese kísérletei érdekes információkat szolgáltattak az alegységek N-terminális végének szerepéről [88]. A Synechocystis cianobaktérium 16.6 kda tömegű kis hő-sokk fehérjéjénél találtak három olyan mutációt az alegységek N-terminális végén, amely in vivo a chaperon aktivitás elvesztését okozza, in vitro viszont nem mutatható ki aktivitáscsökkenés. Ennek feltételezhető oka az, hogy az alegységek N-terminális végének nem csak az oligomer szerkezet kialakulásában, hanem más HSP-kel való kölcsönhatásban is szerepe lehet, ami in vivo a fehérje működésképtelenségét eredményezi, az in vitro chaperon teszt viszont nem tudja kimutatni. Az alegység kicserélődés nemcsak egy kis hő-sokk fehérje oligomerei, hanem különböző kis hő-sokk fehérje oligomerek között is lehetséges [89, 90]. Például a humán kis hő-sokk fehérjék alegységei is cserélődhetnek egymás között [34, 64], így egy shsp oligomerben többféle kis hő-sokk fehérje molekula is előfordulhat. Az eddig felhozott példákból látható, hogy nem létezik a kis hő-sokk fehérjék esetében általános működési mechanizmus. Összességében három, alapjaiban különböző chaperon mechanizmust tételeznek fel: egyik lehetőségként a nagy oligomer a felszínén köti meg a szubsztrátot [15, 91]. Egy másik lehetőség az, hogy a kis hő-sokk fehérje oligomer disszociál kisebb egységekre (ezek lehetnek monomerek, dimerek, vagy nagyobbak), amelyek hidrofób felszínüknél fogva megkötik a szubsztrátot, majd a szubsztrát kötődése után összeállnak oldható komplexekké [83]. A harmadik elképzelés szerint a kis hő-sokk fehérje molekulák beépülnek a nagy, oldhatatlan aggregátumokba, lehetővé téve ezen aggregátumok disszociációját [41, 42, 92] Az -krisztallin A kis hő-sokk fehérjék közül az egyik leginkább kutatott fehérje az -krisztallin, amely már több, mint 100 éve ismert fehérje, és a gerincesek szemlencséjének közel egyharmadát alkotja [15, 93]. Az -krisztallin valójában két nagyon hasonló fehérje, az A és az B-krisztallin formájában van jelen a szervezetben. Az A és B alegységek közel 14

15 180 aminosav hosszúságúak, egy viszonylag kicsi N-terminális doménből, egy nagyobb C-terminális doménből, és a kettőt összekötő szakaszból állnak. A domének végén változó hosszúságú, rendezetlen szerkezetű szakaszok vannak [94]. A spektroszkópiai vizsgálatok során használt triptofánok az N-terminális doménen találhatóak, egy az A, kettő az B alegységen. Az emlősök szemlencséjében az A és B alegységek aránya körülbelül 3:1 [95]. Az -krisztallin oligomerek heterogének [96], egy oligomer hozzávetőlegesen alegységből áll [15]. Krio-elektronmikroszkópos felvételek tanúsága szerint az oligomerek alakja nem gömbszimmetrikus, szemben például a Methanococcus jannaschii HSP16.5 oligomerekkel [66]. Az oligomer szerkezet természetesen az -krisztallin esetében is dinamikus, az alegységek nem csak egymás között cserélődhetnek szabadon [63], hanem más kis hő-sokk fehérjékkel is lehetséges az alegységek kicserélődése [89]. Az -krisztallinról az elmúlt évtizedben mutatták ki, hogy chaperon tulajdonságokkal rendelkezik [97, 27]. Fontos szerepe lehet a szemlencse átlátszóságának fenntartásában [98] és a szürkehályog kialakulásának megakadályozásában [99]. Génkiütött állatokkal végzett kísérletek kimutatták, hogy a szemlencse átlátszóságának fenntartásához az A- krisztallin esszenciális [100] és valószínűleg nagy szerepe van a -krisztallin aggregációjának megakadályozásában [15]. Érdekes módon az átlátszó szemlencséhez az B-krisztallin nem szükséges, viszont az B kiütött kísérleti állatok átlagos élethossza mintegy fele volt az egészséges állatokénak, azaz nem zárható ki az B-krisztallin alapvető szerepe az életműködésben [101]. Hasonlóan más kis hő-sokk fehérjékhez az -krisztallin felszíne is erősebben hidrofób, mint más fehérjéké. Valószínű, hogy ezen oldószer által elérhető hidrofób felületeknek nagy szerepe van a chaperon működésben, és a szubsztrátok megkötésében. A chaperon működésben fontos szerepet játszik a fehérje oligomer szerkezete. Korábban feltételezték, hogy korreláció van az oligomer mérete és a chaperon működés között [82], azonban újabb eredmények azt mutatják, hogy az oligomer szerkezet és a chaperon működés összefüggése nem ilyen egyszerű [102, 103]. A magas hőmérsékleten tapasztalt nagyobb aktivitás és nagyobb oligomerméret mögött a fehérje nagyobb dinamikája és a megnövekedett alegységkicserélődés állhat, míg a mutációkkal illetve a nagy nyomással előállított kisebb oligomerek nagyobb aktivitásának oka a fehérjék nagyobb összfelülete, és ezáltal több elérhető szubsztrát kötőhely lehet. 15

16 Míg az A krisztallin nagy mennyiségben a szemlencsében fordul elő (más szervekben csak nyomnyi mennyiségben van jelen), addig az B krisztallin a szervezetben mindenütt megtalálható [104, 105], az A krisztallintól függetlenül [106] (1.2). Dajkafehérjeként az -krisztallin nagyon stabil fehérje, az aminosav szekvenciában történő mutációk többségére érzéketlen [107]. Ismert azonban néhány olyan mutációja, ami ezt a stabilitást megszünteti, és ennek következtében a szemlencsében szürkehályogot okoz [98, 108, 109]. A szürkehályogon kívül számos más, főként neurológiai betegségben is szerepe van, mint az Alexander betegség [110], a Creutzfelt-Jakob szindróma [111], a Parkinson kór [111], vagy az Alzheimer kór [112, 113]. Új felfedezés, hogy az -krisztallin megfelelő körülmények között amiloid fibrillumokat is képezhet [114], ugyanakkor más esetben pedig képes meggátolni az amiloid fibrillumok kialakulását [115]. Tehát az - krisztallin ideális jelölt a kis hő-sokk fehérjék chaperon működésének tanulmányozására, már csak orvostudományi jelentősége miatt is Methanococcus jannaschii HSP16.5 A Methanococcus jannaschii termofil baktériumból származó HSP16.5 szerkezetét röntgenkrisztallográfiás mérésekből ismerjük [69]. Habár az -krisztallintól sok tekintetben eltérő fehérje, jelenleg a röntgendiffrakciós szerkezete (az élesztő HSP 16.9 mellett [70]) az elérhető legjobb modellje az -krisztallin és a kis hő-sokk fehérjék oligomer szerkezetének. A Methanococcus jannaschii HSP16.5 oligomerje 24 alegységből áll, amelynek építőköve a 2 alegységből álló dimer (1.3. ábra). Az oligomer szimmetrikus, belül üreges, az üregnek az oligomer felszínén számos nyílása van. Annak ellenére, hogy az oligomer szerkezet szigorúan 24 alegységből áll, a negyedleges szerkezet hasonlóan más kis hő-sokk fehérjékhez dinamikus [64]. Feltételezhető, hogy a fehérje működésében nagy szerepe van az alegységek kicserélődésének, mivel korreláció mérhető az alegység kicserélődés sebessége és a chaperon aktivitás között. Az alegységek kicserélődése C alatt nagyon lassú, e hőmérséklet felett (vagyis a baktérium természetes környezetében előforduló hőmérsékleteken) viszont megnő. Az oligomer szerkezet és ezáltal a chaperon aktivitás kialakulásában itt is fontos szerepet játszanak az alegységek N és C terminális végei. Az alegységek C terminális végének ritkán tulajdonítanak szerepet a kis hő-sokk fehérjék oligomer szerkezetének kialakulása- 16

17 kor, azonban a Methanococcus jannaschii esetén a röntgendiffrakciós képek alapján fontosak az alegységek közti kölcsönhatások stabilizálásában. Bár az alegységek rendezetlen N terminális végeinek feltehetően nincs ilyen szerepük [116], mégis megfigyelhető, hogy az N-terminális vég rövidülése az oligomer szerkezet szétesését okozza [91]. A látszólagos ellentmondás feloldása Kim és munkatársai [91] véleménye szerint az, hogy az alegységek N-terminális végének a oligomer szerkezet kialakulásakor van jelentősége. Ugyanis az N-terminális vég sok hidrofób aminosavat tartalmaz, amelyek az oligomerek formálódásakor egyfajta "aggregációs magként" funkcionálnak: az alegységek ezek körül a hidrofób aminosavak körül összeragadva állnak egybe. Az így kilakult szerkezet inkább hasonlíthat egy amorf aggregátumra, mint a fehérje végleges oligomer szerkezetére. Így ez az N-terminális végek körül kialakuló aggregáció az oligomer szerkezet kialakulásának csupán az első lépése. Az eddigi vizsgálatok alapján a fehérje negyedleges szerkezete érzéketlen a környezeti hatásokra. CD és különböző kromatográfiás mérések szerint 70 C-on is megmarad a fehérje másodlagos és harmadlagos szerkezete, és az oligomerek se disszociálnak kisebb egységekre [91]. Dinamikus fényszórással és TEM mikroszkópos felvételekkel az oligomerek kismértékű növekedését figyelték meg 80 C felett [91]. A fehérje in vivo védelmet nyújt hő-sokk ellen [117], valamint számos fehérje hő- és kémiai denaturációját akadályozza meg in vitro [64, 117]. Mivel termofil baktériumból származik, ezért szobahőmérsékleten meglehetősen rossz chaperon, aktivitása csak 60 C felett jelentkezik [117]. Feltételezik, hogy a fehérje működése során a szubsztrát valószínűleg csak az oligomer külső felszínére köt, a chaperon működéshez konformáció-változást mindeddig nem mutattak ki [91] Nagy nyomás alkalmazása a fehérjék szerkezetvizsgálatában Kísérleteink során számos esetben a fehérjék szerkezetének vizsgálatára nagy nyomást alkalmaztunk. A nyomás a hőmérséklettel egyenértékű termodinamikai paramétere a vizsgált rendszernek. Nagy nyomás használatával a fehérjék olyan különleges, a működés megértésében fontos állapotai állíthatók elő és tanulmányozhatók, amelyek más módsze- 17

18 p DENATURÁLT NATÍV T 1.4. ábra. A fehérjék elliptikus fázisdiagramja Hawley [125] nyomán rekkel (hőmérséklet, kémiai anyagok alkalmazása) nem érhetőek el [118, 119, 120]. A nagy nyomás fehérjékre gyakorolt hatását már a múlt század elején vizsgálta Bridgman [121]. Kísérletében megfigyelte, hogy a tojásfehérjét nagy nyomásnak kitéve az hasonlóan kicsapódik, mint a főtt tojás. Ez volt az első kísérleti bizonyítéka annak, hogy nagy nyomással ugyanúgy denaturálni lehet a fehérjéket, mint magas hőmérséklettel. Később elméleti alapon a fehérjék alacsony hőmérsékleten történő denaurációját is megjósolták és kísérletileg számos fehérje esetében igazolták is [122, 123, 124]. A fehérjék nyomás-hőmérséklet fázisdiagramjának első elméleti magyarázatát Hawley adta meg 1971-ben [125]. Az elméleti elliptikus alakot (1.4 ábra) több kísérlet is megerősíti. Később, a fehérjék denaturációjával kapcsolatos mérések rámutattak arra, hogy ez a kétállapotú modell tarthatatlan: sem a natív sem a denaturált állapot nem jellemezhető egyetlen jól definiált szerkezettel, ehelyett állapotok sokasága létezik, ami a natív és denaturált közötti átmeneti, intermedier állapotokat is magában foglalja [3, 127]. Számos kutató átmeneti, úgynevezett olvadt gombóc (molten globule) állapotokat figyelt meg a fehérjék nyomásdenaturációja során [128, 129, 130]. Smeller mioglobinon végzett nyomás- és hődenaturációs kísérletei [131] alapján a fehérjék nyomás-hőmérséklet fázisdiagramjára egy új modellt adott [126], kiegészítve Hawley elliptikus fázisdiagramját. A fehérjék módosított fázisdiagramját az 1.5 ábra mutatja. 18

19 p DENATURÁLT N (I) N (I) (A) N (A) A T 1.5. ábra. A fehérjék elliptikus fázisdiagramjának kiegészítése Smeller [126] nyomán. Az ábrán (I) és (A) a metastabil intermedier és aggregált állapotokat, az N és A a natív, illetve aggregált állapotot jelöli A módosított fázisdiagramon a natív tartományon belül számos átmeneti intermedier állapot található. Például mioglobin esetében kimutatták, hogy a fehérje nyomásdenaturációja után a feltekeredő fehérje hajlamos az aggregációra [131, 132]. Ez az aggregáció nem közvetlenül a natív állapotból, hanem a nyomásdenaturáció után létrejövő intermedier állapotok sokaságából megy végbe [133]. Az 1.5 ábrán jól látható, hogy a fehérje denaturált állapota sem egyféle. Alacsony nyomáson a denaturálódott fehérje aggregálódhat, míg nagy nyomáson ez nem lehetséges, mivel nagy nyomáson a fehérjeaggregátumok a bennük található viszonylag nagy üres térfogat miatt nem stabilak. Tekintsük át röviden a nagy nyomás hatásait a fehérjeszerkezetre (1.6 ábra)! Relatíve kicsi ( 100 MPa) nyomások a fehérjékben csak rugalmas, teljesen reverzíbilis szerkezetváltozásokat okoznak [120]. Ezekről a reverzíbilis szerkezetváltozásokról a kompresszibilitás mérésével szerezhetünk információt. A kompresszibilitás mérése történhet spektroszkópiai módszerrel [134], illetve ultrahangos sebességméréssel [135, 136]. Előbbivel a fehérjében található kromofór csoport környezetének izotermikus kompresszibilitását, utóbbival a fehérjeoldat egészének adiabatikus kompresszibilitását mérhetjük. A spektroszkópiai módszerekkel mérhető izoterm kompresszibilitás a fluktuáció-diszszipáció tétel következtében a kromofór csoport környezetének térfogati fluktuációival ará- 19

20 MPa p Másodlagos szerkezet sérülése, nyomásdenaturáció MPa Oligomerek szétesése 100 MPa Rugalmas, reverzíbilis változások 1.6. ábra. A különböző nyomástartományok hatása a fehérjeszerkezetre nyos [137]:!#"%$&!"(')'+*-,.0/12(!#"3' (1.1) ahol " a térfogatot,. az izoterm kompresszibilitást, 2 a hőmérsékletet, /1 a Boltzmannállandót jelöli, a!' jelölés pedig az időbeli átlagolást jelenti. A fentiek alapján a fehérje kompresszibilitásának mérésével a fehéjemolekula dinamikájáról szerezhetünk információkat [138, 139]. Magasabb nyomáson ( MPa) az oligomer szerkezetű fehérjék disszociálódnak, miközben a másodlagos szerkezetük érintetlen marad [140]. Ezáltal az oligomerizációval összefüggő térfogatváltozás, illetve az oligomerek kialakulásának folyamata tanulmányozható. Erre más módszerekkel csak a fehérje mutációival [141, 107, 142, 143, 144], illetve a fehérje részleges elemésztésével van lehetőség [91, 102], azonban ezek a módszerek mind módosítják a fehérje másodlagos szerkezetét. A nagy nyomás hatását a kis hő-sokk fehérjék vizsgálatakor nagyon jól ki lehet használni, mivel a fehérjék másodlagos szerkezete csak magasabb nyomáson, általában 500 és 800 MPa között sérül [126, 103]. Ebben, a MPa nyomástartományban egyes fehérjéknél reverzíbilis másodlagos szerkezetváltozás is megfigyelhető [145, 146, 147, 148]. Még magasabb nyomás a fehérjék denaturációjához vezet [149, 120]. A denaturációs nyomás a különböző fehérjék esetén nagyon különböző lehet, az MPa-os adat csak tájékoztató jellegű. Két extrém példaként megemlítjük a ribonukleázt, amely már 90 MPa körül széttekeredik [150], illetve a Methanococcus jannaschiii HSP16.5-öt, amelynek 20

21 másodlagos szerkezete 45 C-on 1900 MPa-ig stabil [151] Kémiai paraméterek hatása A környezeti ph változása az aminosav oldalláncok töltésének megváltozását okozza. Ez nagy jelentőségű lehet a kis hő-sokk fehérjék esetében, hiszen a fehérje negyedleges szerkezete kulcsfontosságú a chaperone működésben [47, 87] és az oligomer szerkezetet többek között az alegységek oldalláncai közötti gyenge kölcsönhatások stabilizálják [70, 69, 71]. Méréseink során a környezeti ph-t a fiziológiás, ph 7.4 értéktől a savas irányba változtattuk. A választás oka egyrészt a valós fiziológiás körülmények modellezése, másrészt az volt, hogy az A- illetve az B-krisztallin izoelektromos pontja ph 5.3 és ph 6.3 [152], így savas irányban várható nagy változás az oligomer szerkezetben. A környezeti ph hatását korábban többen tanulmányozták az -krisztallin esetében. Augusteyn és munkatársai méréseik során az A- B heterooligomerről B alegységek disszociációját figyelték meg savas ph-n [153]. Más vizsgálatok kimutatták, hogy az A illetve B alegységekből képzett homooligomerek is disszociálnak savas ph-n [154], továbbá azt is megmutatták, hogy míg az B-krisztallin ph 3.4 alatt denaturálódik, addig az A-krisztallin ph 2-ig stabil marad. Mások infravörös spektroszkópia segítségével szintén az -krisztallin denaturációját figyelték meg ph 3 alatt [155]. Míg az -krisztallin denaturációját extrém savas ph-n jól leírták, addig a savas ph-nak a fehérje funkciójára gyakorolt hatásáról nem sokat tudunk. Koretz és munkatársai kimutatták, hogy ph 6-on az -krisztallin nem tudja meggátolni a szubsztrát fehérjék aggregációját in vitro [156]. Más kutatók viszont azt találták, hogy az B krisztallint kifejező E. coli baktériumok túlélése nagyobb volt extrém ph sokk után, mint az B krisztallint nem kifejező társaiké [157]. Ehhez hasonlóan megfigyelték, hogy sejtekben más kis hő-sokk fehérjék expressziója is megnövekszik ha a sejtek savas környezetbe kerülnek [158]. A kluszterin nevű, oligomer szerkezetű extracelluláris fehérjéről ami ez ideig az egyetlen ismert extracelluláris dajkafehérje [159, 160] kimutatták, hogy chaperon aktivitása megnövekszik enyhén savas ph-n, ph 5.5-ön [161]. Ez egy extracelluláris chaperon esetében nem meglepő, hiszen megfigyelték, hogy számos gyulladás, illetve betegség esetén az extracelluláris tér ph-ja 6-nál alacsonyabb értékre csökkenhet [162, 163, 164]. Fontos hangsúlyozni, hogy az irodalomban található eddigi kísérletek nagy része ala- 21

22 4 4 4 csony ph-n foglalkozik a fehérje szerkezetével és működésével. Alig ismert azonban a rövid ideig tartó ph sokk hatása az -krisztallin szerkezetére és működésére, annak ellenére, hogy ez utóbbi effektus fiziológiai szempontból fontosabb lehet, hiszen a sejtben számos esetben történhetnek ph ingadozások. Egy fontos példa a sejtek úgynevezett ischémiareperfúziós károsodása, melynek során a sejt először oxigénhiányos környezetbe kerül, majd hirtelen oxigént kap [165, 166]. Ilyen károsodás történhet a sejtekkel szívinfarktus során, vagy például koraszülött, inkubátorban tartott csecsemők esetében [167, 168]. Ilyen esetekben a sejteken belüli ph ingadozás mértéke savas irányban akár az 1 ph egységet is elérheti [169] Célkitűzés Munkánk során célunk a dajkafehérjék közé tartozó kis hő-sokk fehérjék működési mechanizmusának és negyedleges szerkezetük kialakulásának vizsgálata volt. Vizsgált rendszerként az -krisztallint és az MjHSP16.5-öt választottuk. Kísérleteinkben különböző fizikai és kémiai módszerekkel (nagy nyomás rövid ideig való alkalmazása, a környezeti ph rövid ideig tartó módosítása savas irányban) módosítottuk a kis hő-sokk fehérjék oligomer szerkezetét és vizsgáltuk az e hatásra bekövetkező szerkezeti és működésbeli változásokat. E vizsgálatok során a következő kérdésekre kerestük a választ: Milyen oligomer szerkezetű kis hő-sokk fehérjék képesek chaperon hatást kifejteni? Mi a szerepe a kis hő-sokk fehérjék többségénél megfigyelhető heterogén negyedleges szerkezetnek e fehérjék chaperon működésében? Köthető-e a chaperon működés egy jól definiált negyedleges szerkezethez? Milyen kölcsönhatások játszhatnak szerepet a kis hő-sokk fehérjék negyedleges szerkezetének kialakításában? 22

23 2. fejezet Anyagok és módszerek 2.1. Fehérjeminták készítése Az -krisztallin mintákat két forrásból szereztük be. Egyrészt munkacsoportunknak a kievi Biokémiai intézettel való együttműködését felhasználva marha szemből izolált - krisztallint használtunk. A fehérje izolálását a kievi munkacsoport végezte. A mintakészítés során a kievi munkacsoportban frissen vágott állatok szeméből kimetszett szemlencsékből indultak ki. A szemlencséket ötszörös térfogatú 0.02 % NaN5 -ot tartalmazó 50 mm ph 7.4 TRIS pufferben homogenizálták. A homogenátumot 30 percig vel centrifugálták, majd a felülúszót Sephracyl S-300 oszlopon kromatografálták 50 mm ph 7.4 TRIS pufferben. Az elválasztás után kapott -krisztallin mintát Budapesten SDS-PAGE módszerrel ellenőriztük, majd inzulin aggregációs kísérlettel vizsgáltuk a chaperon aktivitását. A kapott aktivitásokat irodalmi adatokkal vetettük össze [170], melyek alapján mintáink aktivitása megegyezett az irodalmi adatok alapján várhatóval. A marha szemből izolált -krisztallin mellett a SIGMA cégtől is vásároltunk liofilizált -krisztallint (C4163). Ezt a fagyasztva, -18 C-on tárolt fehérjét mérés előtt 50 mm ph 7.4 BES pufferben oldottuk fel. Az MjHSP16.5 mintát Prof. K.K. Kim (Suwon Egyetem, Dél-Korea) bocsátotta rendelkezésünkre [117], akivel munkacsoportunk szintén együttműködésben áll. 23

24 2.2. ph sokk A rövid ideig tartó ph sokk hatásának vizsgálatakor a fehérjeminta ph-jának változtatását dialízissel végeztük. A ph csökkentése során a fehérjét 10 mm-os ph 7.4 TRIS pufferben oldottuk fel. A fehérjemintát másodpercig dializáltuk 0.1 M HCl-el szemben, a dialízis ideje az elérni kívánt ph-tól függött. A kívánt ph elérése után ellenőriztük az oldat ph-ját, majd 2 percig ezen az alacsonyabb ph-n tartottuk a mintát. A ph növelésekor másodpercig dializáltuk a mintánkat 0.1 M NaOH-val szemben, majd ismét ellenőriztük az oldat ph-ját. Ezután a mintánkat 2 percig dializáltuk 100 mm ph 7.4 TRIS pufferrel szemben az oldat ph-jának stabilizálása érdekében. Kontrollkísérletként megvizsgáltuk a sókoncentráció változásának hatását az -krisztallin mintára. A kontrollminta készítésekor a 10 mm ph 7.4 TRIS pufferben feloldott mintát 3 percig 0.1 M NaCl-el szemben dializáltuk. A rövid ideig tartó ph sokk vizsgálata során a funkció vizsgálatára szolgáló chaperon teszteket a ph sokk után, ph 7.4-en végeztük el. Savas ph-n csak szerkezeti mérésekre került sor Nagy nyomás Kísérleteinkben a nagy nyomást kétféle módon állítottuk elő. Az FTIR mérések során üllős gyémántcellát használtunk. A gyémántcellában a fém tömítéssel körülzárt minta két gyémánt között helyezkedik el. A gyémántokat üllők tartják, és egy csavar segítségével szabályozható a gyémátokat összeszorító erő, ezáltal a nyomás. A gyémántcellában alkalmazott erőátvitel és a kis felület miatt nagy nyomás érhető el [171]. A nyomás mérésére bárium-szulfátot használtunk [172]. A mintatér kis térfogata (7 nl) miatt az alkalmazott fehérje koncentráció igen nagy, 75 mg/ml volt. Pufferként 100 mm pd 7.0 TRIS puffert használtunk. A többi nyomáskísérletben hidraulikus nyomáscellát (úgynevezett "bombát") használtunk. Ebben a cellában a nagy nyomást egy külön pumparendszerrel építjük fel, és folyadék közvetíti [173]. A pumparendszer egy alacsony nyomású (<100 MPa) előpumpából, illetve egy magas nyomású (maximum 500 MPa) dugattyús főpumpából áll. Kísérleteinkben mindkét pumpa svájci Nova Swiss gyártmányú volt. A nyomást közvetítő folyadékként 24

25 tiszta vizet használtunk, amivel ugyan nagyobb a csövek korróziójának veszélye, ugyanakkor nem zavarja a spektroszkópiai méréseket, szemben az általánosan használt nagy tisztaságú olajjal. A cella térfogata 2 cm 5 volt, három oldalról zafír ablakok határolják, lehetővé téve a fluoreszencia és abszorbanciaméréseket. A cellába a mintát egy teflondugóval lezárt l térfogatú kvarc küvettában helyeztük el. A nyomás mérését egy elektronikus nyomástávadóval végeztük el. A kísérletek során 50 mm ph 7.4 TRIS puffert használtunk, és a fehérje koncentráció 2 mg/ml volt Chaperon aktivitás mérése A kis hő-sokk fehérjék egyik fontos feladata más fehérjék aggregációjának gátlása. Aktivitásuk vizsgálatakor egy alkalmas szubsztrát fehérjét valamilyen módon aggregáltatnak, és e fehérje aggregációjának csökkenésével jellemzik a chaperon aktivitást. Az aggregációt spektrofotométerben, illetve luminométerben fényszórás mérésével követhetjük nyomon. Spektrofotométerben az aggregáció miatt fellépő látszólagos abszorbancianövekedést figyelhetjük meg, míg konvencionális luminométerben az aggregátumok fényszórását mérhetjük közvetlenül. Az irodalomban található különböző szubsztrátokat a 2.1 táblázat tartalmazza táblázat. Különböző szubsztrátok a kis hő-sokk fehérjék vizsgálatához szubsztrát denaturáció módja hivatkozás inzulin redukció [174] -krisztallin UV besugárzás [175] -krisztallin hődenaturáció [176] rodanáz hődenaturáció [177] citrát szintáz hődenaturáció [178] abrin redukció [179] Az inzulin redukcióján alapuló teszt során az inzulin A és B láncai közti diszulfidhidakat [180] redukálószer (DTE) segítségével felszakítjuk, ekkor a B láncok egymáshoz tapadva aggregálódnak, miközben az A láncok az oldatban maradnak. Többen kimutatták, hogy az -krisztallin meggátolja, illetve lassítja az inzulin B láncok aggregációját 25

26 9: : OD a b t (min) 2.1. ábra. Inzulin DTE által kiváltott aggregációját jellemző 400 nm-en mért látszólagos abszorbancia (OD;<< ) változása -krisztallin nélkül (a), illetve -krisztallinnal (b) Az = -krisztallin hatásának szemléltetésére itt 1:1 inzulin: = -krisztallin monomer arányt használtunk, eltérően a későbbi mérésektől. A kísérlet során 0.1 mólos ph 7.4 TRIS puffert használtunk, az inzulin koncentrációja 0.5 mg/ml, az = -krisztallin koncentrációja 1.8 mg/ml volt. [174, 175, 170]. Ennek hatásfoka függ az inzulin/ -krisztallin aránytól, az -krisztallin esetleges előkezelésétől, valamint a kémiai körülményektől. Szobahőmérsékleten az - krisztallin csak nagy mennyiségben védi meg az inzulint, a kismennyiségű -krisztallin védőhatása elhanyagolható. A nyomás és a ph sokk hatásának vizsgálata során nem alkalmazhattunk olyan módszert, ahol magas hőmérséklet hatására aggregálódik a megvédendő fehérje, hiszen a hőkezelés az -krisztallin chaperon aktivitását is megváltoztatja, megnöveli [175]. Így kísérleteinkben -krisztallin esetében az inzulin aggregációs tesztet alkalmazunk. Az inzulin koncentrációja 0.5 mg/ml, az -krisztallin koncentrációja 0.6 mg/ml, a DTE koncentrációja pedig 6 mg/ml volt. Pufferként 0.1 M 7.4 ph-jú TRIS puffert használtunk. Az inzulin/ - krisztallin (monomer) arány kísérleteinkben megközelítőleg 3 volt, abból a célból, hogy a kezeletlen -krisztallin még ne mutasson jelentős védelmet. A kísérletek során a minta hőmérséklete C volt. A 2.1 ábrán inzulin DTE hatására kiváltott aggregációját láthatjuk -krisztallin nélkül (a), illetve -krisztallin jelenlétében (b). Az aggregáció mérése spektrofotométerben történt, az aggregáció miatt fellépő látszólagos abszorbancianövekedés detektálásával

27 nm-en. Látható, hogy a chaperon jelenléte csökkenti az aggregációt. Az aggregációs görbék jól illeszthetőek egy exponenciális telítési görbével. Az aggregáció jellemzésére a görbék határértéke volt alkalmas, amit az illesztésből kaptunk. Ezt az abszorbanciaértéket a kontrollmintához (inzulin aggregációja chaperon nélkül) viszonyítva egy, a chaperon aktivitásra jellemző mennyiséget kapunk. A későbbiekben ezzel jellemezzük a chaperon aktivitást: chaperon aktivitás = 1 minta aggregációja/kontroll aggregációja Más szubsztrát alkalmazása során is hasonló aggregációs görbéket kaptunk, ezeket a görbéket szintén a fenti módon értékeltük ki. Az MjHSP16.5 chaperon aktivitása csak 50 C felett jelentkezik [117]. Így chaperon aktivitását rodanáz és citrát szintáz teszttel vizsgáltuk, mert ezek a tesztek működőképesek ebben a hőmérséklet-tartományban. Pufferként 50 mm TRIS puffert használtunk, a ph a kísérletek során 7.4 volt. A szubsztrátkoncentráció 3 mg/ml, a chaperon koncentráció 0.6 mg/ml volt. Az aggregációt 50 C-on mértük hagyományos luminométerben. A mérés során a minta fényszórását detektáltuk 400 nm-en. E módszerrel kisebb aggregáció is detektálható, mint a fényszórás miatt fellepő látszólagos abszorbancia mérésével abszorpciós spektrofotométerben Fluoreszcencia mérések Triptofán fluoreszcencia Az -krisztallin A alegységén 1, B alegységén 2 triptofán található. Az MjHSP16.5-ben alegységenként 1 triptofán van [16]. A triptofán fluoreszcencia emissziója nagymértékben függ a triptofánok környezetétől, így a spektrum alakja és a spektrum maximumának helyzete információt ad a triptofán aminosavak környezetében a fehérje másodlagos és harmadlagos szerkezetéről. A fehérjék emissziós spektrumát EAI CD 900 és Jobin-Yvon Fluorolog fluoriméterekkel vettük fel. A nyomáscellában végzett mérések esetén a résméret 2 nm volt, más mérések esetében 1 nm-es résszélességgel dolgoztunk. A tirozinok emisszióját elkerülendő, 290 nm-en, 2 nm-es sávban gerjesztettük a triptofánt. A spektrumok maximumának meghatározására számos módszer áll rendelkezésünkre. 27

28 [ A klasszikus, Savitzky és Golay által kidolgozott módszernél [181] a maximum környezetében polinommal illesztjük a spektrumot, az illesztésből meghatározva a maximum helyét. A maximum meghatározásának hibája a mérési pontok hibáiból számítható [182]. További lehetőség a spektrum súlypontjának meghatározása, ami már hordoz magában némi információt a spektrum alakjáról is, valamint található az irodalomban több olyan függvény, amivel a triptofán fluoreszcencia spektrumok alakja illeszthető [183]. Az illesztéses módszerek előnye továbbá az, hogy a spektrumcsúcs helyzete a mérésnél alkalmazott hullámhosszlépésnél nagyobb pontossággal is meghatározható [182]. Burstein módszerénél [183] például az illesztés során a spektrumokat áttranszformáltuk hullámszámskálára, korrigálva az intenzitásokat a skálatranszformáció miatt fellépő látszólagos intenzitásváltozással: >@?ACB * >@?D0BFEGDIH (2.1) majd a hullámszámskálán ábrázolt spektrumra lognormális függvényt illeszthetünk: $ A >@?ACB * >KJMLONQPSRUTVXW H\[ HZY TV $ A]J_^ (2.2) TV ahol >`?AaB a A hullámszámnál mérhető fluoreszcencia intenzitás, >bj az illesztett spektrum maximumának magassága, Y a spektrum aszimmetriájára jellemző alakparaméter, AJ a maximum helye, [ pedig egyéb illesztési paraméter. A maximum helyét az illesztésből kapott A]J érték adja meg ANS jelölés A fehérjék hidrofób felületeinek vizsgálatára egy fluoreszcens jelzőt, ANS-t használtunk [184]. Az ANS vizes oldatban gyengén fluoreszkál, emissziós maximuma 535 nm-nél található, azonban apoláros környezetben (például egy fehérje elérhető hidrofób felületéhez kötődve) emissziós maximuma kék irányba, 460 nm-re tolódik el, és a fluoreszcencia kvantumhatásfoka több, mint egy nagyságrenddel is megnőhet. Ezáltal az ANS fluoreszcencia intenzitásának mérésével információt kaphatunk arról, hogy vannak-e a fehérjén található, oldószer által elérhető hidrofób felületek. Méréseink során a Sigma cégtől vásárolt ANS-t 96 %-os alkoholban oldottuk fel, majd a fehérjéhez való hozzáadása előtt a mérésben használt pufferrel higítottuk. Az ANS flu- 28