A cortactin fehérje működésének vizsgálata különböző jelpályákban

Átírás

1 Illés András A cortactin fehérje működésének vizsgálata különböző jelpályákban Doktori (Ph.D.) értekezés Témavezető: Dr. Buday László, egyetemi docens Semmelweis Egyetem, Budapest Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet, Bírálóbizottság: Prof. Hunyady László Dr. Kolev Kraszimir Dr. Váradi András Dr. Magócsi Mária Szigorlati bizottság: Prof. Machovich Raymund Dr. Tompa Péter Dr. Geiszt Miklós Opponensek: Dr. Mócsai Attila Dr. Homolya László

2 Illés András A cortactin fehérje működésének vizsgálata különböző jelpályákban Doktori (Ph.D.) értekezés Témavezető: Dr. Buday László, egyetemi docens Semmelweis Egyetem, Budapest Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet 1

3 Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke Bevezetés...8 Sejtmozgás, a sejtek lamellipodiumképződéssel történő vándorlásának menete...10 Az aktin fehérje sajátos kettőssége...13 Az Arp2/3 fehérjekomplex...16 Az Arp2/3 komplex szerkete.16 Az Arp2/3 komplex által katalizált folyamatok...17 Az Arp2/3 komplex működésének szabályozása...19 A WASP fehérjecsalád..23 A cortactin fehérje.27 A cortactin szerkezete...27 A cortactin szerepe A cortactin működésének szabályozása A cortactin Tyr- és Ser/Thr foszforilációjának szerepe A cortactin SH3 doménjén át megvalósuló szabályozás..39 Egyéb, a cortactin működését befolyásoló tényezők...40 A Rho GTPázok..41 A Rho csoportba sorolt fehérjék...43 A Cdc42 csoport...44 A Rac fehérjék..46 A Rho GTPázok működésének szabályozása...47 Az aktin citoszkeleton változásait okozó jelpályák.50 Az EGF jelpálya...50 Az integrin jelpálya...54 A forbol észter kezelés által aktivált jelpályák.57 Célkitűzések 61 Anyagok és módszerek...62 Plazmidok és konstrukciók...62 Ellenanyagok és reagensek...62 Sejtvonalak és stimulációjuk..63 Tranziens transzfekció...63 Immunprecipitáció és Western-blot

4 PAK kináz assay Immunfluoreszcencia COS7 sejtek szétterülése fibronektinnel bevont felszínen..65 A cortactin transzlokációjának vizsgálata A sejtek [ 33 P] ortofoszfáttal történő jelölése.66 RNS interferencia..66 Eredmények...68 A cortactin foszforilációjának szerepe a fehérje transzlokációjában, valamint az aktin polimerizáció szabályozásában 68 Az EGF kezelés, vagy a Vav2 overexpressziója COS7 sejtekben a cortactin transzlokációjához vezet..68 A cortactin tirozin foszforilációja nem szükséges annak membránlokalizációjához és így a sejtszéli aktin polimerizációhoz 69 A cortactin Erk általi szerin/treonin foszforilációja nem szükséges a fehérje transzlokációjához. 74 A PAK nem foszforilálja a cortactint 76 A cortactin transzlokációja COS7 sejtekben Rac-dependens folyamat 79 A cortactin szerepe az integrin jelpályában..80 A COS7 sejtek szétterülésefibronektinnel bevont felszínen Rac-függő folyamat...80 A cortactin N- és C-terminális felének expressziója gátolja a sejtek szétterülését...83 A cortactin fontos szerepet tölt be a sejtek fibronektin felszínhez történő adhéziójában és szétterülésében A cortactin transzlokációjának vizsgálata forbol észterrel kezelt hepatociták mozgása során...90 A forbol észter kezelés HepG2 sejtek esetén a sejtkolóniák Rho-kináz-independens szóródását idézi elő A forbol észter kezelés HepG2 sejtekben a cortactin transzlokációjához vezet...91 A forbol észter kezelés HepG2 sejtekben a cortactin Src kinázdependens foszforilációjához vezet...94 A cortactin forbol észter kiváltotta transzlokációja 3

5 Src kináz- és PI3-K-independens folyamat...97 A cortactin forbol észter indukálta transzlokációja Cdc42/Rac-independens folyamat A kísérleti eredmények megbeszélése A rövid idejű EGF stimulus hatására kialakuló cortactin transzlokáció, illetve aktin polimerizáció nem igényli a cortactin indukálható foszforilációját 101 A cortactin szerepe az integrin jelpályában A COS7 sejtekben aktiválódó integrin jelpályában a Rac fontos szerepet tölt be A cortactin N- és C-terminális felének expressziója gátolja a sejtszétterülést A cortactin kitüntetett szerepe az integrin-függő sejtadhézióban és kiterülésben A cortactin transzlokációjának vizsgálata forbol észterrel kezelt hepatociták mozgása során.110 HepG2 sejtekben a forbol észterrel indukált migráció első lépése a cortactin Rac-independens transzlokációja által kísért lamellipodiumképződés Az elért eredményeink tézisszerű összefoglalása Köszönetnyilvánítás..115 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Egyéb közlemény Irodalomjegyzék Összefoglalás Summary

6 Rövidítések jegyzéke Abi1: Abl interactor Abl: Abelson tirozin kináz Abp1p: actin binding protein 1p Arf: ADP ribosylation factor ARNO: Arf nucleotide exchange factor Arp2/3: actin related protein 2/3 ARPC1-5: actin related protein 2/3 complex component 1-5 ADF: aktint depolimerizáló faktor ADF-H domén: aktint depolimerizáló faktor homológ domén APC: adenomatous polyposis coli ARPC: Arp2/3 komplex komponens BCH: BNIP-2 and Cdc42GAP homology domain BPGAP1: BCH domain containing, Proline-rich and Cdc42GAP like protein 1 C3G: Crk SH3 binding guanine nucleotide exchange factor CapZ: capping protein associated with Z- disks of the sarcomere CARMIL: capping protein Arp2/3 and myosin I linker Cbl: Casitas B-lineage lymphoma protein CBP90: cortactin binding protein 90 kda CC: coiled-coil domain CD2AP: cortactin-cd2 associated protein Clip-170: Cytoplasmic linker proteins CortBP1: cortactin binding protein 1 CRIB: Cdc42, Rac interactive binding domain Crk: CT10 regulator of kinase CSF-1: kolóniastimuláló faktor 1 DAG: diacilglicerol Dbl: diffúz B sejtes limfóma protein DH domén: Dbl homológ domén DMEM: Dulbecco s Modified Eagle s Medium DN: domináns negatív Dock180: downstream of CRK 180kDa ECM: extracelluláris mátrix EGF: epidermális növekedési faktor EGFR: epidermális növekedési faktor receptor Elmo: engulfment and cell motility Eps8: Epidermal growth factor receptor pathway substrate 8 Erk: extracelluláris jelre regulálódó protein kináz F aktin: fibrilláris aktin FAK: fokális adhéziós kináz F aktin: filamentózus aktin Fer: Fes related protein Fgd1: facio-genital sysplasia 1 protein FH domén: formin homológ domén G aktin: globuláris aktin GAP: GTPáz aktivátor protein GBD: GTPase binding domain GDI: guanin nukleotid disszociáció inhibitor GEF: guanin nukleotid kicserélődési faktor 5

7 GFP: zöld fluoreszcens protein GKAP: guanylate kinase associated protein Grb2: growth factor receptor bound protein 2 GST: glutation S-transzferáz HAX-1: HS-1 associated protein X-1 HS-1: hematopoietic specific 1 protein ILK: integrin linked kinase IP 3 : inozitol-triszfoszfát IP: immunprecipitáció IQGAP1: IQ domain containing GAP IRSp53: inzulin receptor szubsztrát p53 kda LIMK: LIM (Lin-11/Isl-1/Mec-3) domain containing protein kinase 1 Lgl: lethal giant larvae protein MAP kináz: mitogén aktivált protein kináz mdia: mammalian Diaphanous mglur: metabotrop glutamát receptor MEK: MAPK/ERK kinase MIM: missing in metastasis Miro: mitochondrial Rho MLC: miozin könnyűlánc MLCK: miozin könnyűlánc kináz MRCK: myotonic dystrophy kinase related Cdc42 binding kinase MyoIp: miozin 1p Nap125: Nck associated protein NMDA: N-metil-D-aszpartát N-WASP: neural WASP NTA: N-terminal acidic P130 CAS : Crk associated substrate p130 PAK: p21 aktivált kináz Par6: partitioning defective protein PCR: polimeráz láncreakció PDGF: trombocita eredetű növekedési faktor PI3,4,5P 3 : foszfatidilinozitol-3,4,5- triszfoszfát PI3-K: foszfatidilinozitol-3-kináz PI4,5P 2 : foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát PI4P5-K: foszfatidilinozitol-4-foszfát 5- kináz PINCH: particularly interesting new Cys- His protein PIR121: p53 inducible messenger RNA PIX: PAK interacting exchange factor PH domén: pleksztrin homológ domén PKB: protein kináz B PKC: protein kináz C PKD: protein kináz D PKL: protein kináz L PKN-γ: protein kináz N-γ PLC: foszfolipáz C PMA: forbol mirisztát acetát PMSF: fenil-metil-szulfonil fluorid POR: partner of Rac PR domén: prolinban gazdag domén P-Rex1: PtdIns(3,4,5)P3 dependent Rac exchange factor PSD: posztszinaptikus denzitás PSTPIP: proline, serine, threonine phosphatase interacting protein PTEN: phosphatase and tensin homolog PTPα: protein tirozin foszfatáz α 6

8 PTP-PEST: PTPase with PEST sequences; Rap1: Ras-proximate 1 RF domén: ring finger domén Rho: Ras fehérjével homológ onkoprotein RhoBTB: Rho with BTB domain ROCK: Rho asszociált coiled-colied domént tartalmazó protein kináz Scar: supressor of camp receptor SDS: nátrium-dodecil-szulfát SH2 domén: Src homológ 2 domén SH3 domén: Src homológ 3 domén Shank: SH3 domain and ankyrin repeat containing protein Shp-2: Src homology region 2 containing protein tyrosine phosphatase 2 sirns: small interfering RNS Slp76: SH2 domént tartalmazó leukocita protein Sos: son of sevenless Syk: spleen tyrosine kinase TC10: teratocarcinoma 10 protein TCL: TC10 like Tiam: T lymphoma invasion and metastasis TRITC: tetrametil-rodamin-izotiocianát VCA domén: verprolin-cofilin(central)- acidikus domén v-src: virális Src WASP: Wiskott-Aldrich szindróma protein WAVE: WASP family verproline homologous protein WH: WASP homológ domén WIP: WASP interacting protein WISH: WASP interacting SH3 protein WRP: WAVE associated Rac-GAP protein ZAP70: Zeta-chain associated 70kDa protein ZO-1: zonula occludens 1 protein 7

9 Bevezetés A mozgás a Világegyetem sajátja. Nem az élőlényekre jellemző specifikumról, kuriózumról van tehát szó, hanem egy olyan általános, a mikrovilágtól a makrovilágig jelenlévő folyamatról, ami az elemi részecskéktől a galaxishalmazokig, a mérettartományok elképzelhetetlenül hatalmas, legalább 40 nagyságrendnyi skáláját foglalja magába. A fizikai világ tehát éppúgy állandó mozgásban, változásban van, mint az élőlények, az alapvető különbség nem magában a mozgás tényében, hanem annak formájában van. Amíg ugyanis az élettelenre jellemző mozgások vagy előre kiszámíthatóak, igen nagy pontossággal leírhatóak és egy adott energiagrádiensnek megfelelő irányban történnek, amilyenek például a makrovilágban megfigyelhető mozgások, vagy pedig véletlenszerű, kis amplitúdójú rezgések, mint például a mikrovilág részecskéinek mozgásai, addig az élőlények mozgásai lehetnek előre nem, vagy csak igen nehezen és pontatlanul megjósolhatóak, leírhatóak, illetve történhetnek különböző fizikai energiagrádiensek ellenében is. E mozgáshoz a bonyolult felépítésű többsejtű élőlények külön rendszereket, specializálódott sejteket tartalmazó szöveteket használnak. A mozgásnak e látványos, az egész élőlényt előrehajtó, jellemzően különféle vázakhoz rögzült izomsejtek segítségével megvalósított formájának tárgyalása kívül esik ezen értekezés keretein, a mozgás általam tanulmányozott formája a kevésbé látványos, ám ugyanannyira fontos sejtmozgás. A sejtmozgás rendkívül fontos folyamata a többsejtű élőlények egyedfejlődésének és ezt követően is, az élőlény egész élete során elengedhetetlen szerepet tölt be többek között például az immun- és a gyulladásos folyamatok során, a sebgyógyulás, illetve egyéb sérülések kijavítása folyamán, de ugyanígy a daganatos sejtek inváziójában, szóródásában is esszenciális szerepet játszik. Mindebből is kitűnik tehát, hogy a szabályozott mozgás elengedhetetlen a többsejtű organizmusok tökéletes működéséhez, életben maradásához. Mint láttuk a többsejtű élőlények esetén, a mozgáshoz gyakran szükségeltetik valamiféle váz is, ami az izmok tapadási helyéül szolgálhat. A sejtek szintjén vizsgálódva azt találjuk, hogy azok szintén rendelkeznek egy sejtvázzal, amit három egymástól jól elkülöníthető hálózat, rostrendszer alkot. A legfinomabb hálózatot az aktin monomerekből felépülő, mindössze 5-9 nm átmérőjű mikrofilamentumok alkotják, nevéből is következik az intermedier filamentumok átmeneti vastagsága, a tubulin alegységekből felépülő mikrotubulusok pedig jóval vastagabbak mintegy 25 nm átmérőjűek a fenti két rostrendszernél. Az eredeti felfogás szerint e hálózatok mindegyike rendelkezik a saját 8

10 funkciójával, a mikrotubulusok hálózata például a kromoszómák mitózis alatti mozgatásában játszik szerepet, míg a mikrofilamentumokból felépülő aktin citoszkeleton a sejtek mozgásában tölt be fontos szerepet. Egyre több adat bizonyítja azonban e rendszerek kapcsolatát. Megfigyelték például, hogy a mikrotubulusok fontos szerepet tölthetnek be a Rho családba tartozó GTPázok aktiválásában, egyes kicserélődési faktorok működését szabályozva, de észlelték azt is, hogy a mikrotubulusok működésének gátlása egyes sejtvonalaknál gátolja a membránkitüremkedések kialakulását, így magát a sejtmozgást is (1). Mivel a sejtmozgások folyamata főként az aktin hálózattal áll kapcsolatban, ezért számunkra a sejtváz aktin komponensei töltenek be fontos szerepet. Az aktin citoszkeleton azonban maga sem egységes, homogén hálózat. Megkülönböztethetjük a sejt belsejét átszövő aktin stressz rostok hálózatát, valamint a membránt kísérő kortikális aktin citoszkeletont. E különbségeket a megegyező fibrilláris aktin rostok eltérő kötegekbe rendezése, keresztkötése eredményezheti, mely folyamatért különféle aktin keresztkötő fehérjék lehetnek felelősek, amilyen például a fimbrin és a fascin. A munkám során vizsgált cortactin fehérje a sejtszéli aktin citoszkeletonon keresztül fontos szerepet tölt be mind a sejten belüli mozgással járó folyamatok amilyen például az endocitózis és a vezikulák sejten belüli transzportja mind pedig magának a sejtek mozgásának szabályozásában. Ahhoz azonban, hogy megérthessük a cortactin működésének módját, illetve a fehérje szerepét, szükséges áttekinteni a sejtek mozgásának mechanizmusát, valamint az ehhez elengedhetetlen aktin citoszkeleton hálózat felépítését is. 9

11 Sejtmozgás, a sejtek lamellipodiumképződéssel történő vándorlásának menete A sejtek zöme membrán kitüremkedések, úgynevezett lamellipodiumok, másnéven állábak segítségével mozog. A sejtmozgás ezen formája a következő fő lépések egymás utáni ismétlődése által valósul meg: mindenekelőtt az extracelluláris ingerek, külső szignálok hatására a sejt polarizálódik, majd a membrán alatti aktin polimerizáció hatására megtörténik a sejtmembrán mozgás irányába történő Rac-függő kitüremkedése, a lamellipodiumképződés. Az így létrejött membránprotrúziót ezt követően újonnan képződő adhéziós pontok rögzítik a sejtmozgás alapjául szolgáló felszínhez, majd ezen trakciós pontok, valamint a sejtben kialakuló aktin stersszrostok, illetve a hozzájuk kapcsolódó miozin segítségével megtörténik a sejttest Rho-dependens kontrakciója, behúzódása, majd a sejt hátsó, nem kitüremkedő végén a korábban létező adhéziós pontok megszűnése és a sejt esetlegesen visszamaradó farki végének behúzódása is. Ezt követően a folyamat ismételt lamellipodiumképződéssel kezdődik előről és ciklusszerűen zajlik a sejtmozgás teljes ideje alatt (1.ábra). 1. ábra: A lamellipodiummal történő sejtmozgás lépései Míg a fenti lépések az olyan viszonylag lassan mozgó sejtekben, amilyen például a fibroblaszt is élesen elkülöníthetőek és mindegyikük megfigyelhető, addig a gyorsan mozgó sejtek például a keratinociták és a leukociták esetén úgy tűnik, hogy a sejtek szinte tovasiklanak a felszínen folyamatosan kitüremkedve és behúzódva, jelentős adhéziók kialakulása nélkül. 10

12 Mindezen lépések a sejt aktin hálózatának térben és időben is jól szabályozott állandó felépülését, lebontását, átrendezését igénylik, mely folyamatokban számos szabályozó funkciót betöltő fehérje játszik szerepet. E fehérjék közül kiemelkedő szerep jut a Rho GTPáz család tagjainak, valamint az Arp2/3 komplexnek és aktivátorainak. A mozgáshoz vezető első lépés a sejt polarizációja a különféle kemoattraktáns anyagok hatására. Bár maguk a kemotaktikus receptorok a sejt felszínén egyenletes eloszlást mutatnak a kemoattraktáns anyagok grádiensének kialakulása után is, ők maguk nem polarizálódnak, azonban az általuk közvetített szignál hatására a sejt belsejében megtörténik a sejt polarizációja. Az egyik első olyan intracelluláris molekula, mely grádiensszerű, polarizált eloszlást mutat a sejten belül a különböző kemokinetikus ingerek hatására, a foszfatidilinozitol-3,4,5-triszfoszfát (PI3,4,5P 3 ). Ennek oka egyrészt a foszfatidilinozitol 3- kináz (PI3-K) lokális aktivációja a mozgás irányába eső oldalon a membrán közelében (2-6), másrészt pedig a PI3,4,5P 3 -foszfatáz PTEN (phosphatase and tensin homolog) áthelyeződése a vezető oldalról a sejt farki részébe (2,7). A PI3,4,5P 3 felhalmozódásának az eredményeként a mozgás irányába eső sejtszélnél megjelennek az aktivált Rho GTPázok, a Cdc42 és a Rac (8-10), ami mint ahogyan azt a későbbiek során látni fogjuk aktin polimerizációhoz és ennek következményeként a membrán kitüremkedéséhez vezet. Emellett az aktív Rac képes a PI3-K aktiválására is, pozitív visszacsatolási hurkot képezve a sejtmozgás során (3, 11-13) A Cdc42 szerepe a sejtmozgás folyamatában nem teljesen tisztázott. A feltételezések szerint az általa előidézett vékony, tüskeszerű membránkitüremkedések, az ún. filopodiumok, melyek a migráló sejtek vezető szélén gyakran megfigyelhetők (14), az extracelluláris környezet próbálgatására szolgálnak, mintha a szubsztárumot ízlelgető nyelvek lennének és ezáltal a sejtmozgás irányítottságáért felelősek (15). A Cdc42 tehát valamilyen módon a Rac számára nyújthat információt a sejtmozgás irányára vonatkozóan, megelőzendő, hogy a lamellipodiumképződés elveszítse irányultságát. (16). Ezzel összhangban van az a megfigyelés is, hogy makrofágok esetén a Cdc42 kiesése a chemotaxist felfüggeszti (16). Ezzel ellentmondóan egyes újabb tanulmányok szerint a Cdc42 funkcióvesztéssel járó mutációja nem érinti a Drosophila perifériás gliasejtek vándorlását (17). A Rac szerepe sokkal világosabb a lamellipodiumképződéssel járó sejtvándorlás során. Az általa előidézett és a későbbiek során részletesen is ismertetésre kerülő sejtszéli aktin polimerizáció a membránt mintegy maga előtt tolva lamellipodiumok, állábak képződéséhez vezet. A következő lépésben a Rho aktivációjának hatására a sejtben aktin stressz rostok jelennek meg, melyek a miozinnal kapcsolódva a sejttest kontrakcióját idézik elő. Így a sejt 11

13 mintegy belefolyik a Rac által képzett lamellipodiumba, majd megszűnik a hátsó rész összeköttetése a felszínnel és behúzódik a sejtfarok is. E folyamatokban a Rho által aktivált Rho kináz (ROCK) tölt be fontos szerepet. A GTP-t kötő aktív Rho kapcsolódva a Rho kinázhoz felfüggeszti a kapcsolatot annak kináz doménje és autoinhibitoros doménje között, így a kináz domén képessé válik katalitikus aktivitásának kifejtésére (18). Az aktív ROCK képes foszforilálni és aktiválni a LIM kinázt, ami ezt követően foszforilálja és inaktiválja az aktin polimerek lebontásában fontos szerepet játszó cofilint, stabilizálja tehát az aktin filamentumokat (19,20). Emellett a Rho kinázok foszforilálják és ezáltal gátolják a miozin könnyűlánc foszfatázt (21,22), sőt betölthetik a miozin könnyűlánc kináz szerepét is, magát a miozin könnyűláncot foszforilálva (23). E két módon növelve a miozin foszforilációjának mértékét, fokozzák a miozin aktivitását, aminek a sejtkontrakcióra gyakorolt nyilvánvaló szerepe mellett az általa keltett sejten belüli feszülésen, tenzión keresztül funkciója lehet magában az aktin hálózat felépülésében is. Az aktív Rho a Rho kinázok mellett aktiválja az mdia fehérjét is, aminek az aktin polimerizáció fokozásában van fontos szerepe (24). Igen érdekes eredményre vezettek egyes újabb, 3 dimenziós gélekben végzett sejtmozgási kísérletek, melyekből kiderült, hogy a sejtek térbeli mozgásának alapvetően két módja lehetséges, egy elnyúlt morfológiával járó, a PI3,4,5P 3 vezető oldali felhalmozódásától és a Cdc42/Rac páros aktivációjától kísért, ám Rho GTPáz aktivitást nem igénylő forma, valamint egy lekerekedett morfológiával jellemezhető, Rho-dependens amőboid migráció, ami viszont nem jár a PI3-K aktiválódásával, így a PI3,4,5P 3 vezető oldali felhalmozódásával sem (25). Megfigyelték továbbá, hogy ugyan a különböző sejtvonalak a térbeli sejtmozgás egyik, vagy másik módját preferálhatják, ám ha a két mód egyike gátolt, akkor a sejtek preferenciájukkal szemben is képesek a sejtmozgás másik módjára áttérni (25). Úgy tűnik tehát, hogy a különféle daganatos sejtvonalak térbeli mozgása során a Cdc42/Rac, valamint a Rho GTPáz fehérjék nem feltétlen működnek olyan rendezett sorrendben együtt, ahogyan azt a lamellipodiummal történő sejtvándorlás kapcsán megfigyelhettük, sokkal inkább egymás alternatíváiként jelentkeznek, mint egyetlen rendszerként. Ahogyan az az eddig elmondottakból is kitűnik, a sejtmozgásban az aktin citoszkeleton változásainak rendkívül fontos szerepe van. E változások közül vizsgálataink során az aktin sejtszéli, új elágazódások létrejöttével járó polimerizációja, illetve annak szabályozása töltött be fontos szerepet. A továbbiakban e folyamatot ismertetném tehát. 12

14 Az aktin fehérje sajátos kettőssége Az aktin citoszkeletont felfedezése után ahogy a neve is utal rá a sejt mechanikus vázaként, a sejtalak fenntartójaként, motorproteineket lehorgonyzó létrafehérjeként képzelték el. Manapság azonban egyre tisztábban látszik, hogy a sejtek aktin váza egy rendkívül dinamikus, gyorsan változó struktúra, melynek változása nélkülözhetetlen a sejtek mozgásához, alakváltozásához, esetleges kontrakciójához, az endocitotikus és vezikuláris transzport folyamatokhoz, sőt, magához a sejtek osztódásához is. Mindezen folyamatokért az aktin azon sajátos tulajdonsága tehető felelőssé, hogy két formában is jelen lehet a sejten belül. Egyrészt, mint G (globuláris) aktin monomer, másrészt pedig több monomer összeállásával F (fibrilláris) aktin polimert hozhat létre (tulajdonképpen egy két protofilamentumból felépülő kettős szálról van szó, amely egymásra felcsavart). Az ily módon létrejövő aktin filamentum polarizált felépítésű, az elektromikroszkópos képeken nyílvesszőhöz hasonló megjelenést mutat. Ennek megfelelően van egy szakállas, az angol nyelvterületen barbed-end -nek nevezett, valamint egy hegyes, angolul pointed-end -nek nevezett vége. A szakállas véget + végnek is nevezik, utalva rá, hogy az újabb G aktin monomerek beépülése, illetve leválása innét sokkal gyorsabban történhet, mint a másik, - végről. További különbség a két vég között, hogy a + végen ATP-t kötő G aktin monomer található, ellentétben a polimert alkotó többi G aktintól, amelyek ADP-t kötnek. Az újabb G aktin monomerek beépülése minden esetben ATP-kötött formában történik, amikor is az előzőleg még utolsóként a szálon található aktin monomerekhez kapcsolt ATP-nek megtörténik a hidrolízise. Mindezen folyamatok az aktin polimer + vég felé történő növekedését eredményezik. Tekintve, hogy a sejtszéli, újonnan képzett aktin polimerek +, gyorsan növekvő vége a sejtmembrán felé mutat, a membránt kitüremítve mindez a sejtmozgásban alapvető szerepet játszó membrán protrúziók, lamellipodiumok létrejöttét eredményezi (2.ábra). Az aktin monomerek aktin szállá történő spontán összeállása meglehetősen kis valószínűséggel történik meg, ugyanis az aktin dimerek és trimerek rendkívül instabilak, gyorsan lebomlanak, mielőtt a szál tovább fejlődhetne. (Az aktin dimerek disszociációs egyensúlyi konstansa 4-5 M, míg az aktin monomer sejtbéli koncentrációja mindössze 0,5 mm (26)). Az ilyen, néhány aktin monomerből létrejövő mag kialakulását nukleációnak nevezzük és tulajdonképpen e folyamat képezi az aktin polimerizáció sebességmeghatározó és jól szabályozott lépését. Ha a szál hossza ugyanis egyszer meghaladja a három alegységet, akkor az aktin polimerizációja, a filamentum 13

15 növekedése rohamosan zajlik tovább, hiszen az egyensúlyi koncentráció a disszociáció és a polimerizáció között a μm-os koncentráció tört része, az aktin monomerek koncentrációja pedig, mint láttuk, 0,5 mm. A sejtek az aktin polimerizáció mértékét tehát két alapvető módon befolyásolhatják: a szabad + végek számának növelésével, illetve csökkentésével (a polimerizáció alapjául szolgáló magvak számának változtatásával), valamint a jelenlévő szabad G aktin monomerek mennyiségének szabályozásával (a nukleációt követő reakció sebességét és irányát ugyanis nyilvánvalóan a szabad aktin monomerek mennyisége befolyásolja). Ez utóbbira példa a profilin, mely az aktin monomerrel képez 1:1 arányú komplexet, lehetővé téve a szabad G aktin koncentráció szabályozott változtatását (27). A szabad + végek számának szabályozásának három lehetséges módja ismeretes. Az első mechanizmus az olyan az angolban capping proteineknek nevezett (sapka)fehérjék aktivitásának szabályozása, melyek az aktin polimerek + végét képesek lefedni, megakadályozva ezáltal a szál további növekedését. Ilyen fehérje például a CapZ protein. A második módja a szabad + végek száma változtatásának a meglévő aktin filamentumok limitált feldarabolása, ami számos új + véget hoz létre. Ezt végzi például az ADF (actin depolymerizing factor), valamint a vele 70%-os szekvenciahomológiát mutató rokon fehérje, a cofilin (28). Ezen proteinek működése azonban meglehetősen ellentmondásos, hiszen szerepet tulajdonítanak nekik az F aktin polimerek szétszerelésében, teljes depolimerizációjában is (29). Mivel a lamellipodiumok területén is megtalálhatóak (30), ezért valószínűsíthető a szerepük a lamellipodiummal történő sejtmozgás folyamatában is, ahol a kortikális aktinrostok a sejtmembrántól távolabbi - végének folyamatos lebontását végezhetik, ezzel biztosítva a sejtmozgás folyamatosságát, dinamizmusát (2.ábra). A harmadik, a szabad végek számát befolyásoló folyamat az új + végek de novo szintézise. E folyamatban játszik döntő szerepet az Arp2/3 komplex, valamint a formin fehérjék. Mivel az Arp2/3 fehérjekomplex kiemelkedően fontos szerepet tölt be az általam tanulmányozott sejtszéli aktin polimerizációs folyamatokban, ezért itt most csak a formin fehérjék szerepével foglalkozom, az Arp2/3 komplex ismertetésére pedig a következő fejezet szolgál majd. A formin fehérjék az aktin nukleátorok legújabban azonosított családját képezik és az elágazódásokat nem tartalmazó aktin polimerizáció elindításáért felelősek, ahogyan azt majd látni is fogjuk, az Arp2/3 komplextől eltérően tulajdonképpen a semmiből teremtenek elő egy új aktinszálat. Felfedezésükre végtagi deformitásokkal született mutáns egerek vizsgálata vezetett, így feltételezték, hogy a láb formájának kialakításában játszanak szerepet, innen kapták nevüket is. Később kiderült, hogy a lábdeformitásokat a formin génjével szomszédos Gremlin fehérje génjének sérülése okozza és magának a formin fehérjének abban szerepe 14

16 nincsen. A formin fehérje két doménnel rendelkezik, egy FH1 (formin homológ 1) és egy FH2 doménnel, melyek közül az FH2 domén dimert képez egy másik formin fehérje FH2 doménjével és egy-egy G aktint kötve nukleációs magot hoznak létre, majd a sapkafehérjékhez hasonlóan az újonnan képződő aktin polimer + végéhez kapcsolódva maradnak, megvédve azt más, a polimerizáció folyamatát leállító sapkafehérjéktől (31). A formin FH1 doménje kapcsolódni képes a profilin fehérjéhez, amely kapcsolódás után a profilin által kötött G aktin beépülhet a kialakuló aktin polimerbe. A formin tehát mint sapkafehérje nem gátolja, hanem tovább serkenti az aktinszál növekedését (31). Továbi érdekes felfedezés, hogy az eredeti elképzelésektől eltérően a formin nem csupán a sejt belsejében található stressz rostok létrejöttéért lehet felelős, hanem a cadherin által közvetített sejt-sejt kapcsolatokban is fontos szerepe lehet, képes ugyanis az α-cateninhez kapcsolódni és így a membrán közelében aktin polimerizációt indítani (31). 2. ábra: A sejtszéli aktin polimerizáció okozta membránkitüremkedés. Megfigyelhető, hogy az aktin polimerizáció során beépülő újabb és újabb aktin monomerek (lila) egyre előrébb tolják maguk előtt a sejtmembránt, míg a lamellipodium mélyebb rétegeiben az aktinszál lebontását végző ADF/cofilin újabb és újabb aktin monomereket tesz szabaddá, biztosítva ezáltal a folyamathoz szükséges G aktin ellátást, valamint a lamellipodium konstans szélességét is. Az ábrán megfigyelhető egy Arp2/3 komplex által képzett elágazás is. 15

17 Az Arp2/3 fehérjekomplex Az Arp2/3 komplex szerkezete Az általam vizsgált, a sejtmembránt gyűrűszerűen követő, sejtszéli aktin citoszkeletonról kiinduló elágazódásképződéssel járó aktin polimerizáció fő kivitelezője az Arp2/3 komplex. Az Arp2/3 egy hét protein alegységből álló fehérjekomplex, melyet 1994-ben izoláltak és írtak le először (32) és melyről 1997-ben derült ki, hogy az aktin polimerizáció fokozója (33). A komplex tartalmaz két Arp (actin related protein) fehérjét, a 44kDa-os Arp2-t és a 47kDaos Arp3-t, melyekről a nevét is kapta és melyek az aktin monomerhez hasonló felépítést mutatva a de novo aktin polimerizáció során két G aktint utánozhatnak. Emellett tartalmaz további öt alegységet, melyeknek a struktúraalkotásban, valamint a szabályozásban, illetve fehérje-fehérje interakciókban lehet szerepe. Ez utóbbi fehérjéket ARPC1-5 (Arp2/3 complex component) fehérjéknek nevezzük (ezen alegységeknek használatban van régebbi, molekulatömegükön alapuló elnevezésük is, mely szerint az ARPC1 neve p41-arc, az ARPC2-é p34-arc, az ARPC3-é p21-arc, az ARPC4-é p20-arc, az ARPC5-é pedig p16- Arc). Tovább árnyalja a képet, hogy az Arp3-nak, az ARPC1-nek és az ARPC5-nek legalább két humán izoformája ismert, aminek a jelentősége egyelőre még ismeretlen. Ahogy az már az Arp2/3 felfedezésekor is kiderült, az egyes alegységek 1:1 arányban vannak jelen a komplexen belül (32). A komplex térbeli szerkezetét tekintve globuláris, meglehetősen kompakt képet mutat a tér mindhárom irányában majdnem azonos kiterjedéssel. Mérete:15X14X10nm (34). Az Arp2-es és 3-as alegység szerkezete mint már említettem a G aktinhoz hasonló, felszínükön megtalálható az aktin monomerre jellemző hasadék is, azonban az Arp-k esetén e hasadék jóval nyitottabb. Emellett az Arp-k az aktin monomerhez hasonlóan szintén képesek az ATP kötésére és hidrolízisére sőt, az működésükhöz elengedhetetlen is azonban ATP iránti affinitásuk jóval alacsonyabb, mint a G aktiné. (34,35). A röntgenkrisztallográfiás vizsgálatokból kiderült, hogy az ARPC2 és az ARPC4 alkotja a komplex központi magját, amely C-alakban körülfogja az Arp2-es és 3-as alegységeket (34). Az ARPC1 hét, egymástól egyforma távolságra elhelyezkedő WD (Trp- Asp) ismétlődést tartalmaz és a többi komponenstől eltérően valószínűleg nem az aktin polimerizációban, hanem az Arp2/3 komplex felépítésében és fenntartásában tölt be regulációs szerepet (36). Az ARPC3 egy globuláris, α-helikális fehérje, mely szerkezetét tekintve teljesen egyedi, és ami eltérően a többi alegységtől csupán egyetlen másik 16

18 alegységgel, nevezetesen az Arp3-mal létesít kapcsolatot. Az ARPC5 a komplex legkisebb alegysége és szintén α-helikális szerkezettel rendelkezik. A fent vázolt szerkezet az Arp2/3 komplex ATP-t nem kötő, inaktív szerkezete. A fehérje konformációváltozását és ezáltali aktiválódását előidézhetik mind a WASP fehérjecsalád tagjai, mind a már létező aktin filamentumhoz történő kötődés, mind pedig az ATP kötése (37). Érdemes megemlíteni továbbá, hogy az Arp2/3 komplex felszínén két kiterjedt bázikus folt is található, az első az ARPC1-en, közel az Arp3-hoz, a második pedig az ARPC1-en és 5-ön (34), mely foltok a később ismertetésre kerülő Arp2/3 komplex aktivátor fehérjék savas, úgynevezett A (acidikus)- motívumával kapcsolódnak. 3. ábra: Az Arp2/3 komplex térbeli, röntgen krisztallográfiás szerkezete (34). Az Arp2/3 komplex által katalizált folyamatok Az Arp2/3 komplex működése során a sejtszéli, kortikális aktin hálózatról kiinduló, a membránkitüremkedések kialakulásáért felelős elágazódó aktin polimerizáció létrejöttéért felel. Jelenleg két modell is létezik arra, hogy hogyan hozhatja létre az Arp2/3 komplex az új aktin elágazódásokat. Mindkét modellre találhatunk meggyőző bizonyítékokat éppen úgy, 17

19 mint ellenérveket. Először a jóval szélesebb körben elfogadott, az angolban dendritikus nukleációnak nevezett oldalelágazódási modellt ismertetném. E modell szerint az Arp2/3 komplex ARPC alegységei közül valamelyik, esetleg több is az eredeti aktin filamentum oldalához kapcsolódik, míg az Arp2-es és 3-as alegység két aktin monomert utánozva az újonnan képződő aktinszál első alegységét alkotja (4.ábra, 38,39). Minderre egyaránt meggyőző bizonyítékul szolgálnak az in vitro elvégzett kísérletek, valamint az elekromikroszkópos megfigyelések is. Annak tisztázása, hogy az Arp2/3 komplex mely alegysége lehet kapcsolatban az eredeti aktinszállal még várat magára, bár az elvégzett in vitro kísérletek alapján ezen interakcióban az ARPC2 és 4 szerepe valószínűsíthető (40). Az ARPC2 szerepét erősíti a molekula kristályszerkezetének tanulmányozása is. A másik modell szerint ami az angol nyelvterületen a barbed-end branching modell névre hallgat az Arp2/3 komplex a meglévő aktin polimer szabad, + végéhez kötődik, és ott képez új elágazódásokat, nem pedig az anyafilamentum oldalához kapcsolódva (4.ábra). Mindez azon a megfigyelésen alapszik, hogy egyrészt az Arp2/3 által mediált aktin polimerizáció sebessége nem az eredeti filamentumok hosszától, hanem a szabad + végek számától függ (41), másrészt pedig az ún. capping fehérjék melyek az aktinszálak + végét fedik le, így az aktin polimerizáció gátlói versengenek az Arp2/3-mal (41,42). Ugyanakkor az a megfigyelés, hogy az elágazástól kiinduló két szál hossza egymástól gyakorlatilag mindig eltérő, erősen megkérdőjelezi az elágazódásképződéssel járó aktin polimerizáció e modelljének létjogosultságát (43), hiszen, amennyiben a két szál mindegyike újonnan képződött, úgy az egyforma sebességű aktin polimerizáció miatt azok hosszának meg kellene egyeznie. Úgy tűnik tehát, hogy az Arp2/3 komplex által katalizált elágazódó aktin polimerizáció legvalószínűbb módja az oldalelágazódási modell. Attól függetlenül azonban, hogy végül is milyen módon jön létre az új elágazódás, annak jellemzői mindenképpen azonosak. Az Arp2/3 komplexről elmondhatjuk, hogy a két G aktinra emlékeztető alegysége szolgálja a kiindulási magot az új szál szintéziséhez, mely szál mindenképpen hozzávetőlegesen 70 -os szögben ágazódik el az eredeti szálhoz képest. Kijelenthetjük továbbá, hogy mindkét modell esetén az Arp2/3 komplex egyben betölti a vég védelmének szerepét is, megakadályozva ezzel az újonnan képződő szál gyors lebomlását. Látható tehát, hogy az Arp2/3 komplex rendkívül fontos szerepet tölt be a sejtekben lezajló aktin polimerizációs folyamatokban, mindebből pedig nyilvánvalóan következik, hogy működése szoros kontroll alatt áll. 18

20 4. ábra: Az Arp2/3 komplex által végzett aktin elágazódásképzés modelljei. Az ábra a részén az ún. dendritikus nukleáció, az oldalelágazódás modellje látható, míg a b részén a filamentum + végéről kiinduló elágazódás mechanizmusa figyelhető meg. Lilával az aktin monomereket, pirossal és kékkel az Arp2-es és 3-as alegységet, zölddel pedig az Arp2/3 komplex ARPC alegységeit jelöltem. A modellek pontos magyarázatát ld. a szövegben. Az Arp2/3 komplex működésének szabályozása Tekintve, hogy az Arp2/3 komplex önmagában csak igen alacsony mértékű aktin elágazódásképződést produkál, egyértelmű, hogy szabályozása főként különböző aktiváló molekulákon át valósul meg. E fehérjéket két nagyobb csoportra oszthatjuk: G aktin monomert kötő aktivátorokra, valamint F aktint kötőkre. Az első csoportba tartoznak a Wiskott-Aldrich szindróma protein (WASP) fehérjecsalád tagjai (44-46), a hematopoetikus sejtekben expresszálódó WASP, az ubikviter, a WASP-pal homológ szerkezetű N-WASP (neural-wasp) és a WAVE/Scar (WASP family verproline homologous/supressor of camp receptor) fehérjecsalád három tagja. Szintén G aktint kötő Arp2/3 aktivátor az intracelluláris patogén Listeria monocytogenes ActA fehérjéje (47). A második csoportba sorolható a Saccharomyces cerevisiae Abp1p fehérjéje (48), a szintén élesztő Pan1p fehérje (49), a munkám középpontjában álló cortactin fehérje (50,51), valamint ennek hematopoetikus 19

21 sejtekben megtalálható homológja, a HS-1 fehérje. Szintén az Arp2/3 komplex gyenge aktivátora a MyoIp, I. típusú élesztő miozin is, ami valószínűleg G aktinnal asszociált fehérjéket megkötve képes az Arp2/3 komplex aktiválására. Gyenge aktivátor továbbá a CARMIL (capping protein Arp2/3 and myosin I linker) Dictyostelium fehérje is (52). Bár az aktivátorok két csoportjának hatásmechanizmusa jelenősen eltér, egy közös jellemzőt a CARMIL kivételével az összes aktivátornál megtalálhatunk. Mindegyikük tartalmaz ugyanis egy savas oldalláncú aminosavakat tartalmazó régiót, valamint e régióban egy triptofánt is. E régió és főként a rá jellemző DDW motívum az Arp2/3 komplex felszínén található két, bázikus aminosav oldalláncok által alkotott folt valamelyikével létesíthet kapcsolatot. A fenti csoportosítás mellett az aktivátorokat feloszthatjuk aktiváló hatásuk erőssége szerint is. Ennek megfelelően vannak erős aktivátorok, ide tartoznak az aktin monomert kötő fehérjék, például a WASP család tagjai, melyek szörösére képesek fokozni az Arp2/3 komplex aktin polimerizáló aktivitását, valamint gyenge aktivátorok, amilyen például a cortactin is. Ezek mindössze 2-3-szoros aktivitásfokozást eredményeznek, így szerepük mint látni fogjuk jóval inkább a kialakult aktin elágazódás és az újonnan képződött aktin polimer stabilizálása lesz. Mivel az aktivátorok közül kimagasló a jelenősége a WASP fehérjéknek és a cortactinnak, ezért részletesen csak e két aktivátorral foglalkoznék, megemlítve, hogy mivel az aktivátorok két eltérő mechanizmusú csoportjába tartoznak, ezért ismertetésükkel az Arp2/3 aktiváció mindkét lehetséges módjába betekintést nyerhetünk. Ugyanakkor, mivel a későbbiekben mindkét fehérjéről, ill. fehérjecsaládról részletesen is beszámolok majd, ezért itt csupán a fehérjék az Arp2/3 komplex aktivációjában elengedhetetlen szerepet betöltő részeit és azok funkcióját ismertetném. A WASP fehérjecsalád tagjaira jellemző, hogy a C terminális végükön tartalmaznak egy illetve az N-WASP esetén kettő verprolin homológ motívumot (V) (amit WASP homológ 2 doménnek is neveznek (WH2), így W-vel is rövidítenek), majd egy összekötő központi (C) és egy triptofánt tartalmazó savas motívumot (A). E VCA domén felelős a monomer G aktin kötéséért (V), valamint az Arp2/3 komplexhez történő kapcsolódásért (45,54,55) is. A VCA domén jelenléte szükséges és egyben elégséges feltétele is az Arp2/3 aktivációjának (45), a fehérje többi része ahogy azt majd látni fogjuk szabályozó szerepet tölt be. Az A motívummal az Arp2/3 komplexhez kapcsolódó WASP fehérje a V motívuma által kötött aktin monomert átadja az Arp2/3-nak, így egy kvázi trimert hoz létre az Arp2-vel és 3-mal, ami kiindulási pontja lehet a további, már spontán is lezajló lánchosszabbodásnak (55). 20

22 A jóval gyengébb aktivátor cortactin ezzel szemben teljesen más mechanizmussal fejti ki hatását. A cortactin jellemzője, hogy az N terminális végén tartalmaz egy konzervatív N terminális savas domént, amin belül megtalálható az Arp2/3 aktivátorokra jellemző DDW motívum is, és ami az Arp2/3 komplexhez való kapcsolódásban tölt be elengedhetetlen szerepet (56). A WASP fehérjéktől eltérően a cortactin esetén ez a régió önmagában nem elégséges az aktiváláshoz. Szükséges hozzá a cortactin ezt követő hat és fél, egyenként 37 aminosavat tartalmazó tandem ismétlődése is, ami az F-aktin megkötését szolgálja (50,56). A fehérjének ez az N terminális fele játszik szerepet tehát az Arp2/3 komplex aktiválásában, a fehérje többi része ahhoz nem szükséges (50). Az aktiváció valószínű mechanizmusa tehát az, hogy a cortactin az Arp2/3 komplex mellett vagy az újonnan képződött leány-, vagy pedig még valószínűbben az eredeti anyafilamentumhoz kapcsolódik, stabilizálva ezáltal az újonnan képzett elágazódást (51), az Arp2/3 F-aktin iránti affinitása ugyanis önmagában jóval alacsonyabb. Annak ismeretében, hogy a cortactin az Arp2/3 komplex Arp3-as alegységéhez kapcsolódik, a WASP fehérjék pedig az Arp3-hoz, az Arp2-höz és a p41-arc-hoz is (57), tehát az Arp3 a két fehérje közös kötőhelye, felmerül a kérdés, hogy van-e valamilyen kompetíció köztük az Arp3-hoz való kötődésért. Weaver és munkatársai azt találták, hogy az N-WASP fehérje VCA doménje képes versengeni a cortactin N terminálisával az Arp3-hoz való kapcsolódásért. Magas koncentrációban adott VCA képes megakadályozni a cortactin kötődését az Arp2/3 komplexhez, ugyanakkor a cortactin NTA doménje, bár a VCA domén Arp3 kötését gátolja, nem érinti annak kapcsolódását sem az Arp2-höz, sem pedig a p41-archoz, így az NTA domén növekvő koncentrációban sem képes gátolni a VCA domén Arp2/3 aktiváló (aktin polimerizációt fokozó) hatását, úgy tűnik tehát, hogy az N-WASP fehérje Arp3-hoz történő kapcsolódása nem elengedhetetlen aktiváló képességének kifejtéséhez. Mindezen in vitro kísérletek alapján Weaver-ék feltételezték egy cortactin/arp2/3/n-wasp hármas komplex létét (57), amiben a cortactin és a WASP fehérjék additív, vagy szinergisztikus módon fokozhatják az Arp2/3 működését. Ezzel szemben viszont Uruno és munkatársai azt találták, hogy a fent említett hármas komplex nem jön létre, mivel az F-aktinhoz kapcsolódó, ADP-t kötő Arp2/3 komplex VCA iránti affinitása jóval alacsonyabb, mint a szabad, ATP-t kötőé, ami viszont a VCA és a cortactin közti kompetíció miatt cortactint nem köt (58). Szerintük tehát a cortactin és az N- WASP szerepe az Arp2/3 aktivációja során időben elválasztott, egymást követő, melynek során első lépésként az N-WASP az általa kötött aktin monomert átadja az Arp2/3-nak, ezáltal fokozva az Arp2/3 komplex Arp alegységeihez kötött ATP hidrolízisét, valamint az aktin 21

23 polimerizáció beindulását. Ezt követően a megváltozott körülmények miatt (ADP-t kötő Arp2/3, valamint az F-aktin szál kezdődő kialakulása), a VCA domén affinitása az Arp2/3 komplex iránt csökken, az N-WASP a komplexről leválik, lehetővé téve a cortactin kapcsolódását, ami stabilizálhatja az új elágazást (58). Tovább árnyalja a két aktivátor család együttműködését az a megfigyelés, hogy a cortactin SH3 doménjével képes kapcsolódni az N-WASP-hoz és aktiválhatja azt (59,60). Így felmerült annak a lehetősége is, hogy a cortactin a már meglévő aktin anyafilamentumhoz történő kötődése az elsődleges folyamat és ezt követően részben éppen a cortactinnak köszönhetően történik csak meg az N-WASP fehérje kihorgonyzása és aktiválása, ami azután az Arp2/3 komplex aktiválásához és az elágazódásképződés beindulásához vezet (60). Emellett a cortactin kapcsolódhat az eredetileg a WASP-pal kapcsolatban felfedezett WIP (WASp interacting protein) fehérjével is, mely kapcsolat fokozza a cortactin Arp2/3-t aktiváló képességét és valószínűleg a két fehérje interakciója felelős lehet az újonnan képzett aktin elágazódás stabilitásának további növelésében is (61). Mindezek mellett érdemes megemlíteni, hogy a WIP az N-WASP-pal kapcsolódva egyes megfigyelések szerint legalábbis in vitro nem is serkenti, hanem gátolja az N-WASP fehérje Arp2/3 aktiváló képességét (62). Mindezekből is kitűnik tehát, hogy az Arp2/3 aktivációjának pontos mechanizmusa és főként az egyes aktivátorok összehangolt működésének menete még közel sem tisztázott. A különböző aktivátorok mellett további regulációs lehetőséget biztosít az a megfigyelés, miszerint az Arp2/3 komplex p41-arc (ARPC1) alegységét a növekedési faktor jelpályákban a Rho GTP-ázok által aktivált PAK1 (p21 aktivált kináz) Ser/Thr kináz foszforilálni képes (64), mely foszforiláció hatására az egyébként monomer formájában is jelen lévő (63,64) p41-arc alegység kapcsolódik az Arp2/3 többi alegységéhez és lehetővé teszi annak működését. A megfigyelések szerint a p41-arc sejtbéli túlexpressziója a sejtek fokozott motilitását eredményezte, míg a foszforilációs helyet pontmutációval elrontva ez a hatás elmaradt, nyilvánvaló tehát a p41-arc-nak és foszforilációjának szerepe is az Arp2/3 működésében (64). Sőt, egyes újabb megfigyelések szerint az ARPC2-es (p34) alegység is fontos szerepet tölt be az Arp2/3 komplex aktivációját eredményező konformációs változásokban (125). Mindemellett ismertek az Arp2/3 komplex inhibitorai is, mégha jóval alacsonyabb számban is, mint az aktivátorok, ami valószínűleg annak is köszönhető, hogy keresésük kívül esik a kutatások fő vonulatán. Ilyen inhibitor az F aktint kötő tropomiozin, amely in vitro verseng az Arp2/3 komplexszel az aktin filamentumokhoz történő kötődésért (65), valamint a 22

24 hasonló elv szerint gátló caldesmon fehérje is (66). Végezetül pedig meg kell említenünk az élesztőtől az emlős sejtekig jelenlévő, konzervált szerkezetű, ám egyelőre csak foltokban ismert funkciójú F aktin-kötő fehérjét, a coronint, amelyről in vivo is igazolták, hogy kötődni képes az Arp2/3 komplex ARPC2-es alegységéhez, in vitro pedig az Arp2/3 komplex szintén bizonyított inhibitora, mely gátláshoz viszont érdekes módon a coronin F aktin kötő képessége nem szükséges (67). A WASP fehérjecsalád A WASP fehérjecsalád tagjai az első összeköttetést jelentették a Rho fehérjecsaládba tartozó GTP-ázok és az általuk előidézett, fénymikroszkóppal is észlelhető citoszkeleton és membránváltozások között. Szerepük tisztázásával hosszú idő után lehetővé vált a Rac fehérje által előidézett lamellipodiumképződés és membránfodrozódás, valamint a Cdc42 aktivációját követő filopodiumformálódás magyarázata, fontosságukat, ám nem kizárólagos szerepüket bizonyították az elvégzett egér knock-out kísérletek is ( ). A WASP fehérjecsalád névadójának, a WASP fehérjének 1994-ben azonosították génjét Wiskott-Aldrich szindrómában egy meglehetősen ritka, X kromoszómához kötötten öröklődő, ekcémákkal, infekciókkal és vérzési zavarokkal járó betegségben szenvedő gyerekek tanulmányozásával (68). Jelenleg a fehérjecsaládnak öt tagja ismert, melyeket két alcsaládba oszthatunk: a WASP-on kívül a WASP alcsalád tagja az N-WASP (69), a WAVE alcsaládba pedig a WAVE1-3 fehérjéket soroljuk (70-73). A WASP és a WAVE alcsalád tagjai amellett, hogy meglehetősen hasonló doménstruktúrával rendelkeznek, számos eltérést is tartalmaznak. Mindkét alcsalád esetén a C terminálisan elhelyezkedő domének tehetők felelőssé az Arp2/3 komplex aktiválásáért, míg az N terminális fehérjefélen található domének a működésszabályozásban töltenek be fontos szerepet. A C terminális fél V (verprolin homológ), más néven WH2 (WASP homológ 2) doménje a G aktin monomer kötését végzi (45), míg az őt követő C (cofilin-szerű, vagy central), illetve még inkább az A (acidikus) régió az Arp2/3 komplexhez kapcsolódik (45). A WASP alcsalád tagjainak N terminális végén egy WH1/ (WASP homológ 1) domén található. E doménnek a nem pontosan ismert funkciójú WIP (WASP-interacting protein) fehérjével történő interakcióban van fontos szerepe (74). Ezt követően mindkét WASP alcsaládtagban találhatunk egy bázikus szakaszt, aminek a PI4,5P2 kötésében van szerepe 23

25 (75), majd egy, a WASP fehérjék aktivációjában kulcsszerepet játszó ám a WAVE fehérjékből hiányzó GBD (GTPase binding domain), másnéven CRIB (Cdc42 and Rac interactive binding) domént, ami a GTP-t kötő, aktív Cdc42-vel létesít kapcsolatot (75,93). A GBD/CRIB domén utáni prolinban gazdag régió számos SH3 doménnel rendelkező fehérjével történő interakcióban tölt be elengedhetetlen szerepet (59,76-83). Ilyen fehérje például az Nck (77,78), valamint a Cdc42-től független N-WASP aktivációt lehetővé tevő WISH (WASP interacting SH3 protein) fehérje (83), de amint azt látni fogjuk maga a cortactin is (59). A WAVE fehérjék N terminális végükön tartalmaznak egy rendkívül konzervatív szerkezetű WHD/SHD (WAVE homológ/scar homológ) domént (70), aminek funkciója egyelőre tisztázatlan. Ezt követően a WAVE fehérjékben is találunk egy bázikus szakaszt, majd egy prolinban gazdag domént, azonban e prolinban gazdag régió szerepe nem teljesen tisztázott, hiszen a WASP-ok által kötött proteinekkel nem, vagy csak igen alacsony affinitással létesít kapcsolatot (83). Mindemellett a WAVE fehérjék nem rendelkeznek GBD/CRIB doménnel sem, nyilvánvaló tehát, hogy a WAVE fehérjék más módon szabályozódnak, mint a WASP-ok. E szabályozásban több fehérjének is szerepe van, melyek nyugalmi állapotban gátló komplexet képeznek a WAVE fehérjékkel. Szükséges tehát ezen fehérjék ismertetése is. Az inaktív WAVE1 fehérje legalább öt másik azonosított fehérjével alkotott komplex formájában van jelen. E fehérjék a kis molekulasúlyú HSPC300, a Rac-ot kötni képes PIR121 (p53-inducible messenger RNA), az Nck-t kötő Nap125 (Nck-associated protein), a Nap125-tel kapcsolatban álló Abi2 (Abl-interactor 2), valamint a Rac-GAP (GTPáz aktivátor protein) WRP. A WASP és a WAVE fehérjék aktivációja teljesen eltérő módon zajlik, a két folyamatsor talán egyetlen közös pontja a kiindulópontok hasonlósága. Mindkét alcsalád aktivációjában ugyanis a legjelentősebb szerepet a Rho családba tartozó GTP-ázok, valamint az olyan kapcsoló fehérjék, mint az Nck játszák (5.ábra). Azok a megfigyelések, miszerint a WASP és az N-WASP fehérje C-terminális VCA régiója jóval erőteljesebb Arp2/3 aktivációt és aktin polimerizációt idéz elő, mint a teljes hosszúságú, aktivitást gyakorlatilag nem mutató WASP és N-WASP, arra utaltak, hogy a WASP alcsalád tagjai nyugalmi állapotukban egy autoinhibitoros formában vannak jelen (89-92), mely formát különböző stimulusok, különféle molekulákkal történő kapcsolódás képes megbontani. Figyelembe véve a WASP alcsaládnak a filopodiumképződésben betöltött szerepét (89), és hogy a filopodiumok kialakulásának fő előidézője a Cdc42 GTPáz fehérje, valamint Aspenstrom-ék azon korai megfigyelését, miszerint a WASP és a Rho család tagjai kapcsolódnak egymással (93), viszonylag hamar felmerült a lehetőssége annak, hogy a WASP 24

26 fehérjék aktivációjában a Cdc42 fontos szerepet játszhat, mely lehetőség aztán nem sokra rá bizonyítást is nyert (75,90,94,95). Az összegyűlt adatok alapján kijelenthető, hogy a GTP-t kötő, aktív Cdc42 a WASP fehérjék GBD/CRIB doménjéhez kapcsolódik, így aktiválva azokat. Egy másik, a Cdc42-től független aktivációs utat biztosíthatnak az SH3 doménnel rendelkező fehérjék, főként a Grb2 és az Nck adapter protein, valamint a WISH (78,97,83). Részt vesznek a WASP fehérjék működésének szabályozásában a különféle tirozin kinázok is, például a Btk, az Abl és az Src kináz család tagjai ( ). E kinázok a WASP GBD/CRIB domén területére eső 291-es pozíciójú tirozin oldalláncát foszforilálják, gyengítve ezzel a kapcsolatot a GBD és a C domén között, így aktiválva a WASP fehérjét (101). A közelmúltban derült ki, hogy a szerin/treonin kináz casein kináz 2 is képes a WASP-ot foszforilálni a VCA régión belül, mely foszforiláció jelentősen képes fokozni a WASP fehérje Arp2/3 komplex iránti affinitását és az aktin polimerizációt (104). Végezetül pedig meg kell említeni a cortactin szerepét is az N-WASP fehérje működésének szabályozásában, bár erre részletesebben a cortactin fehérje ismertetésénél térnék ki. A cortactin SH3 doménjével képes kapcsolódni az N-WASP-hoz és így egyes megfigyelések szerint foszforilációs állapotától függően képes aktiválni azt (59,60). A WAVE fehérjékre gyakorlatilag már a felfedezésükkor úgy tekintettek, mint a Rac hatását az aktin citoszkeleton felé közvetítő Arp2/3 aktivátorokra (72), hasonló szerepet tulajdonítva nekik, mint a WASP-oknak a Cdc42 jelpályában betöltött funkciója. Több korai megfigyelés is arra utalt azonban, hogy a WAVE fehérjék aktivációjának menete gyökeresen eltér a WASP alcsalád tagjai esetén látott, széles körben elfogadott aktivációs mechanizmustól. Először is a WAVE fehérjék nem tartalmaznak GBD/CRIB domént, így aztán nem hathatnak rájuk direkt módon a Rho fehérjecsalád tagjai (72). Mindemellett a WAVE fehérjék PR doménje nem létesít kapcsolatot sem az Nck, sem pedig a WISH fehérjével, így aztán ezen a módon sem aktiválódhatnak. Másrészt pedig a tisztított WAVE fehérje eltérően a WASP fehérjéktől - in vitro képes aktiválni az Arp2/3 komplexet, nincs tehát autoinhibitoros formája (45), a fehérje nyugalmi gátlása egy több más fehérjével alkotott komplex formájában valósulhat meg (85). Az egyik első azonosított módját a WAVE-ek aktivációjának az IRSp53 fehérje jelentette (84), mely SH3 doménjével specifikusan kapcsolódik a WAVE2-höz, N-terminálisan elhelyezkedő RCB (Rac binding) doménjével pedig a GTP-t kötő aktív Rac-hoz (84), így teremtve kapcsolatot a Rho GTPázok és a WAVE2 fehérje között. A WAVE1 aktivációjában a WAVE-ek szerkezeténél ismertetésre került inhibitoros komplexet alkotó fehérjéknek van jelentős szerepe (85). A komplex több tagja is képes ugyanis különböző jelpályák hatásait a WAVE felé közvetíteni. A PIR121 25

27 5. ábra: A WASP (a) és a WAVE (b) fehérjék aktivációjának mechanizmusa. Rövidítések: B: bázikus szakasz, G: GBD/CRIB domén. A folyamatok pontos magyarázata a szövegben található. fehérjéhez például az aktív Rac, a Nap125 proteinhez pedig a tirozin kináz receptorokról és az integrinekről kiinduló jeleket közvetítő Nck kapcsolódhat, a komplex disszociációját, így a WAVE1 szabaddá válását idézve elő (5.ábra, 85). Emellett a komplex tartalmaz egy Rac- GAP-ot, a WRP (WAVE-associated Rac-GAP protein) fehérjét is, ami a Rac GTP-áz aktivitását fokozva a Rac inaktiválódását idézi elő, a WRP tehát jeltermináló szerepet tölt be (86). Meg kell említeni továbbá, hogy a komplex jelenléte nem csupán gátló hatást fejt ki, de részt vesz a WAVE1 fehérje védelmében is a proteoszómális degradációval szemben (105,106). 26

28 A cortactin fehérje A cortactin szerkezete A cortactint majd másfél évtizede azonosították először Kanner és munkatársai Rous sarcoma vírussal fertőzött, így v-src-t expresszáló csirke embrió fibroblaszt sejtekben, mint az Src által foszforilált 80/85 kda-os fehérjepárost (120). Az 1991-ben Wu és munkatársai által elvégzett kísérletekkel megkezdődött a fehérje egyedi szerkezetének feltérképezése, valamint kiderült, hogy a 80 és 85kDa-nál látható csíkpár ugyanazon fehérje két alternatív splice megjelenési formáját jelöli. Már ekkor megfigyelték, hogy a cortactin a v-src-vel transzformált sejtekben a membrán szélén, az ún. podoszómák területén dúsul, az F-aktinnal kolokalizációt mutatva, míg nem transzformált sejtekben szintén a sejt szélén található a stressz rostok végéhez lokalizálódva, ám nem magukon a stressz rostokon (121). Egy évre rá szintén Wu és munkatársai mutatták ki, hogy a cortactin tandem ismétlődéseket tartalmazó része kapcsolódhat az F-aktinhoz és a kortikális sejtbéli lokalizációja, valamint az aktin kötő képessége miatt ők javasolták először a cortactin elnevezés használatát is (122). Érdekes módon azt találták, hogy a cortactin v-src általi foszforilációja nem befolyásolja a fehérje F- aktinhoz történő kötődését. Mindezekkel párhuzamosan és a fenti eredményektől függetlenül azonosították a cortactin génjét olyan főként emlő, valamint fej-nyak tumorsejt vonalakat vizsgálva, amikben a 11q13-as kromoszómaszakasz amplifikációja volt megfigyelhető. A fenti szakaszon található amplicon tartalmazza többek közt a cortactin EMS1-nek elnevezett génjét, valamint a Cyclin D1 génjét is (123) és e két génnek tulajdonítják az adott amplicon által előidézett rendkívül rossz prognózist. Az EMS1 gén és az Src-szubsztrát cortactin közti kapcsolat felismerése Schuuring nevéhez fűződik. Munkatársaival ő klónozta először az EMS1 gént és fedezte fel az egybeesést annak szekvenciája és a cortactin fehérje között (124). A cortactin az elvégzett Northern-blot kísérletek alapján a hematopoetikus szövetek, a lép, a B- és a plazmasejtek kivételével gyakorlatilag minden szövetben kifejeződő ubikviter fehérje (129). Szerepét a fent említett vérképző szövetekben a hozzá hasonló szerkezetű HS1 (hemopoietic specific protein 1) fehérje tölti be (130). A cortactin egy hozzávetőlegesen 550 aminosavas, térbeli szerkezetét tekintve Å hosszúságú, szálszerű, elongált protein (57). Éppen e fibrilláris megjelenése magyarázza a számolt 60-65kDa-os tömegével szemben megfigyelhető 80-85kDa-os megjelenését az elektroforézis során. A cortactin szerkezete és egyes doménjeinek 27

29 szekvenciája evolúciós szempontból rendkívül konzervatív, utalva arra, hogy a fehérjének a sejtek működésében fontos szerepe lehet. A cortactin funkciójának megfelelően, illetve azon túlmutatva számos domént tartalmaz. N terminális végén hasonlóan a többi Arp2/3 komplex aktivátorhoz egy savas domént, az úgynevezett NTA (N-terminal acidic) domént találjuk, mely egy hozzávetőlegesen 90 aminosavból álló strukturálatlan fehérjeszakasz, amin belül a 15. és a 35. pozíció között nagyszámú savas oldalláncú aminosav lelhető fel (56). Itt található az Arp2/3 aktivátoraira általánosan jellemző DDW (Asp-Asp-Trp) motívum is, melynek rendkívül fontos szerepe van az Arp2/3 komplexhez történő kapcsolódásban, a három aminosav bármelyikének mutációja ugyanis felfüggeszti a cortactin és az Arp2/3 komplex kapcsolatát (50). A cortactin tehát ezen N-terminális doménjével kapcsolódik az Arp2/3 komplex Arp3-as alegységéhez (57). 6. ábra: Az F-aktint kötő Arp2/3 aktivátorok szerkezete. Rövidítések: HS1: hemopoietic specific protein 1, Abp1: actin binding protein 1, Pro-rich: prolin-gazdag domén, helix: α-hélix struktúra, ADF-H: aktin depolimerizáló faktor homológ domén. A többi rövidítés magyarázata, valamint az egyes domének szerepe a szövegben olvasható. Az NTA domént követően a cortactin hat és fél egyenként 37, illetve a fél esetén 20 aminosavas ismétlődést tartalmaz, mely ismétlődések egy-egy helix-turn-helix másodlagos struktúrát alakítanak ki (121). E cortactin ismétlődések teljesen egyediek, és a cortactinon kívül csupán a hozzá hasonló szerkezetű, és a hemopoiteikus sejtekben vele megegyező funkciót ellátó HS1 fehérjében lelhetők fel azzal a különbséggel, hogy a HS1 esetén 28

30 mindössze három és fél ismétlődést találunk. E régió felelős a fibrilláris aktin polimer kötéséért, elengedhetetlen tehát a cortactin Arp2/3 komplex aktiváló képességéhez. Deléciós kísérletek alapján valószínűsíthető, hogy a tandem ismétlődések közül a 4. ismétlődés kapcsolódik az F-aktinnal, bár az ezzel szomszédos 3. és 5. ismétlődés is szükséges a tökételes kapcsolathoz (56). Itt érdemes megemlíteni, hogy a cortactinnak mind patkányban, mind pedig emberi sejtvonalak esetén leírták az alternatív splice variánsait is, melyek az ismétlődések számában térnek el egymástól és egyik magyarázatául szolgálhatnak a cortactin gélelektroforézis során megfigyelt kettős csíkban történő megjelenésének. Patkányban eme alternatív splice variánsokat cortactin B-nek, illetve C-nek nevezték el, mely formák abban különböznek az A-val jelölt vad típusú fehérjétől, hogy a B esetén a 6., míg a C esetén az 5. és a 6. ismétlődés hiánya figyelhető meg. E két forma a megfigyelések szerint in vitro alacsonyabb affinitást mutat az F-aktin iránt (126). Ettől némiképpen eltérően az emberi sejtekben leírt SV1 és SV2 variáns melyek a patkány A és B variánsának megfelelően a 6., illetve az 5. és 6. repeat hiányát mutatják közül csupán a két ismétlődés deléciójával rendelkező SV2 mutat csökkent F-aktin kötő képességet. Az elvégzett migrációs kísérletekből kiderült továbbá, hogy amíg a vad típusú cortactin overexpressziója jelentős sejtvándorlást idézett elő a vizsgált NIH3T3 sejtekben, addig az SV1 variáns hatása jóval kisebb mértékű volt, az SV2 overexpresszió pedig a sejtek vándorlási képességét gyakorlatilag nem fokozta (127). Érdemes megemlíteni továbbá, hogy az SV1 variáns széles szöveti kifejeződést mutat és a vad típusú cortactinnal 1:4 és 4:1 arányok között fordul elő szövettípustól függően, míg az SV2 kizárólagosan a frontális cerebrum területén fejeződik ki. Figyelembe véve azt is, hogy a nagyagy és egyéb agyterületek tartoznak a jellegzetesen az SV1 dominanciáját mutató agyterületek közé, valamint azt, hogy a kifejlődött neurogén szövetekben értelemszerűen a sejtek vándorlása kevésbé intenzív, mint más, erőteljesen osztódó szövetekben felmerül annak a lehetősége, hogy az alternatív splicing-nek szabályozó szerepe lehet a cortactin működésében (127). Megjegyzendő továbbá, hogy a cortactin 4., valamint a HS1 mindhárom ismétlődése képes a PI4,5P 2 kötésére is, mely kötés az elvégzett in vitro kísérletek alapján gátolhatja az F-aktin cortactinhoz és HS1-hez történő kapcsolódását (128). A fehérje eddig ismertetésre került N-terminális felével szemben, mely szükséges és egyben elégséges is az Arp2/3 komplex aktin polimerizációhoz vezető aktiválásához (50,56), a C-terminális félnek fehérje-fehérje interakciókban, valamint a molekula működésének szabályozásában lehet szerepe. A két fél közti kapcsolatot egy aminosav hosszúságú, egyelőre ismeretlen funkciójú α-hélix struktúra teremti meg. Ezt követően egy prolinban, szerinben, és treoninban gazdag PR domént találhatunk, ami az egyébként meglehetősen 29

31 konzervatív szerkezetű fehérje leginkább variábilis része. Amellett, hogy kötőhelyéül szolgálhat más, SH3 domént tartalmazó fehérjék számára, a cortactin PR doménje tartalmazza a fehérje szerin/treonin és tirozin foszforilációs helyeit is. A cortactin C-terminális végén található SH3 domén evolúciós szempontból olyannyira konzervatív, hogy a humán szekvencia még a csirke cortactin SH3 doménjével is 100%-os megegyezést mutat, sőt, a Drosophila SH3 doménje is alig több mint az aminosavak 10%-ában tér el a fentiektől. Nyilvánvaló tehát, hogy e doménnek igen fontos, ám egyelőre csupán részben tisztázott szerepe lehet a cortactin működésében. Felmerül annak a lehetősége is, hogy az ide kapcsolódó fehérjék közül egyeseknek nem is annyira a cortactin aktivitásának szabályozásában, mint inkább a fehérje adott membránterületekhez, különböző aktin polimerizációt igénylő folyamatok helyszínéhez horgonyzásában lehet szerepe. A cortactin SH3 doménjéhez kötődni képes konszenzus szekvencia a +PPΨPXKPXWL (ahol a + bázikus, a Ψ pedig alifás oldalláncú aminosavat jelöl) (131). A számos fehérje közül, amely rendelkezik e szekvenciával, többről is sikerült kimutatni, hogy kapcsolódhat a cortactinhoz. Ilyen fehérjék például az élesztő kéthibrid kereséssel elsőként azonosított CortBP1 (cortactin binding protein 1) (132), ami a Shank2 alternatív splice variánsa (133) és így tulajdonképpen az idegrendszeri állvány(scaffold) fehérjéket tartalmazó Shank család tagja, a szintén az elsők közt felfedezésre került és egyelőre ismeretlen funkciójú, ám a Shank fehérjékhez hasonlóan az idegrendszerben expresszálódó CBP90 (cortactin-binding protein 90) fehérje (126), az epitheliális sejtek közti kapcsolatban szerepet játszó tight-junction-höz lokalizálódó állvány fehérje, a ZO-1 (zonula occludens 1) protein (134), a receptor mediált endocitózis során aktiválódó mechano-kémiai GTP-áz, a dynamin 2 (135), a szintén az endocitózisban, valamint a növekedési faktor receptor downregulációban részt vállaló CD2AP (cortactin-cd2- associated protein) adapter/állvány fehérje (136), a sejtalak szabályozásában szerepet játszó Cdc42 GEF Fgd1 (facio-genital dysplasia 1) protein (137), a WASP fehérjéknél ismertetésre került, az N-WASP működését reguláló WIP adapter fehérje (61), sőt, maga az N-WASP (59), valamint egyes újabb megfigyelések szerint a NADPH-oxidáz p47phox alegysége (138) és egy nemrégiben felfedezett fehérje, az úgynevezett MIM (missing in metastasis) protein is (139). Amint azt már korábban megemlítettem, a cortactin hematopoietikus szövetekben expresszálódó analógja, a HS1 főként az F-aktint kötő ismétlődések számában tér el a cortactin szerkezetétől. További ismeretlen szereppel bíró különbség a prolinban gazdag domén és az α-hélix struktúra sorrendjének felcserélődése a fehérjén belül. A harmadik ismert F-aktint kötő Arp2/3 aktivátor, az egerekben leírt Abp1 (illetve ennek élesztő homológja, az 30

32 Abp1p) jóval jelentősebb eltérést mutat a cortactin szerkezetétől és a különbségek főként a két fehérje N-terminális fele esetén jelentkeznek. Míg ugyanis az Abp1 hasonlóan a cortactinhoz C-terminális felén szintén egy hélix struktúrát, majd egy PR és egy SH3 domént tartalmaz, addig a cortactin N-terminálisán lokalizálódó NTA doménnek és az F-aktin kötő tandem ismétlődéseknek nyomát sem találjuk. Ezek helyén az Abp1 fehérjében egy ADF-H (actin depolymerizing factor homology) domén található, mely képes az F-aktin kötésére. Az élesztő homológ Abp1p fehérje emellett tartalmaz két acidikus domént is, így közvetlenül kapcsolódhat az Arp2/3-hoz és erőteljesen aktiválhatja azt (48). Ezen A domének hiánya az emlős Abp1-ből arra enged következtetni, hogy annak hatása indirekt, más fehérjékkel kapcsolódva léphet interakcióba magával az Arp2/3 komplexszel (48). Ilyen fehérje lehet például az endocitózis folyamatában fontos szerepet betöltő dynamin (140), ami akár a cortactinon, akár pedig a WASP-on át kapcsolatban állhat az Arp2/3 komplexszel. Rátekintve a cortactin szerkezetére, az általa tartalmazott különböző domének széles skálájára, valamint a fehérje szerteágazó protein-protein interakcióira sejthető, hogy mind a funkciója, mind pedig a szabályozása igencsak bonyolult, akár meglepetéseket is rejtő, illetve sokhelyütt homály által fedett. Ezek tisztázására tesz kísérletet a következő két fejezet. A cortactin szerepe Amint az már az Arp2/3 fehérjekomplex működésének szabályozását ismertető fejezetből is kiderült, a cortactin elsődleges funkciója az újonnan képzett, a kortikális aktin hálózatról kiinduló, F-aktin elágazások stabilizálása, valamint az Arp2/3 komplex aktin polimerizáló képességének fokozása (50,51). Amellett azonban, hogy a lamellipodiumok létrejöttében ily módon fontos szerepet tölt be, számos egyéb folyamatban is leírták érintettségét. Ahhoz, hogy egy sejtben valamely növekedési faktor kezelés, vagy egyéb mozgást kiváltó kemoattraktáns hatására membránkitüremkedés alakulhasson ki, szükségessé válhat a sejt statikus vázának szétszerelése, a sejtet keresztülszelő aktin stressz rostok lebontása, az aktin citoszkeleton átrendezése, reorganizálása is. Egyes megfigyelések szerint a cortactinnak az endocitózisban fontos szerepet betöltő mechano-kémiai GTPáz dynamin 2 fehérjével alkotott komplexben e folyamatok során is kitűntetett szerepe lehet olyannyira, hogy ha gátolt e komplex létrejötte, akkor gátlódik a sejtek aktin vázának mozgás előtti 31

33 szétszerelődése, sőt, maga a sejtmozgás is. Jelentős szerepe van tehát a cortactinnak az aktin hálózat átrendezésében is, noha az itt betöltött pontos szerepe még tisztázásra szorul. Mindemellett az a tény, hogy a cortactin és a dynamin 2 kapcsolódni képes, előrevetíti annak a lehetőségét, hogy a cortactin szerepet tölthet be a dynamin legfontosabb funkciójában, az endocitózisban is. Az ennek tisztázására elvégzett kísérletekből kiderült, hogy a cortactin valóban kolokalizációt mutat a dynaminnal a clathrinnal borított membránbetüremkedések területén és valóban szerepet játszik a receptor mediált endocitózis során olyannyira, hogy a sejtekbe juttatott anti-cortactin ellenanyag mikroinjekció, valamint a cortactin SH3 doménjének overexpressziója is képes erőteljesen gátolni a receptor mediált endocitózis folyamatát (142). 7. ábra: A cortactin összekötő szerepe az endocitózis és az aktin hálózat között. Az ábra magyarázata a szövegben található. Rövidítések: U: ubikvitin, P: foszfát csoport, RF: ring finger domén, PR: Prolin-gazdag domén, CC: coiled-coil domén, GTPáz: GTPáz domén, PH: pleksztrin homológ domén. Mindezeken túl és ez részben már a cortactin működésének szabályozását is jelenti a dynamin 2 in vitro 1:1-es moláris koncentráció alatti arány esetén képes fokozni a cortactin- Arp2/3 komplex aktin polimerizációt előidéző képességét. Szintén a cortactin endocitózisban betöltött szerepét erősíti a CD2AP (CD2-associated protein) állvány fehérje, ami a cortactin SH3 doménjéhez kapcsolódva, valamint illetve valószínűleg még a cortactinnal történő kapcsolat elött a membránbetüremkedések invaginációját elősegítő endophilinnel és az 32

34 EGF-receptor ubikvitinálását végző Cbl-lel komplexet alkotva a ligandjával stimulált EGFreceptor endocitózisában játszik szerepet (136). A cortactinnak szerepe lehet továbbá az endoszómák sejten belüli transzportjában is, megtalálható ugyanis abban az aktin farokban, vagy csóvában, aminek ezen vezikulák előrehajtásában fontos szerepet tulajdonítanak. Ide csatlakozik a cortactin egy újabb, bár kevésbé az adott sejt érdekeit szolgáló funkciója, mégpedig az intracelluláris pathogének sejten belüli mozgásának elősegítése. Ilyen kórokozók például a különböző pathogén E. coli törzsek, a Listeria monocytogenes, a Shigella flexneri, de egyes vírusok, például a vacciniavírus is. A cortactin a kórokozók mozgását két mechanizmussal is szolgálhatja. Egyrészt elősegítheti a sejtbe jutásukat a kortikális aktin citoszkeleton átrendezése által (143,144) olyannyira, hogy a cortactin sirns-sel történő kiütése után az adott pathogének bejutása erősen gátlódik (145), másrészt pedig a vezikuláris transzportnál látottakhoz hasonlóan az intracelluláris kórokozó hátsó részénél kialakuló és a pathogént mintegy előrehajtó aktin csóva kialakításában is aktívan közreműködik (58), mely csóva a lamellipodiumokban látott Y-szerű aktin elágazódásokat tartalmaz és melyben megtalálható az Arp2/3 komplex is (146). Itt érdemes megemlíteni azt az érdekes tényt, hogy az Arp2/3 komplex másik jelentős aktivátor családjába tartozó N-WASP az aktin csóván belül nem található meg, csupán a kórokozó és az aktin farok találkozási felszínén, ami arra enged következtetni, hogy a két fehérje esetleg eltérő helyzetekben eredményezheti az Arp2/3 komplex aktivációját, így elképzelhető, hogy mintegy kiegészítik egymás funkcióját (58). Az Arp2/3 komplex aktivátorok közül szintén a cortactin kizárólagos jellemzője, hogy SH3 doménjével képes kapcsolódni számos állvány fehérjéhez, mely fehérjék a tightjunction -ök, az excitátoros idegsejtek posztszinaptikus denzitásai, vagy akár az adherens kapcsolatok jellegzetes proteinjeihez kapcsolódhatnak, a cortactinnak tehát szerepe lehet eme igen összetett rendszerek organizálásában és az aktin hálózathoz történő kapcsolásában is. Az első ilyen említésre érdemes in vitro igazolt kapcsolatot, ami az excitátoros szinapszisok posztszinaptikus denzitása (PSD) és a cortactin között áll fenn a Shank fehérjecsaládba tartozó Shank2 és e fehérje splice variánsa, a CortBP1 teremti meg (132,133). Eme állvány fehérjék amellett, hogy kapcsolódnak a cortactinhoz, több posztszinaptikus transzmembrán receptorral is összeköttetésben állnak. A CortBP1 például a 2-es típusú szomatosztatin receptorral, valamint az α-latrotoxin receptorral, míg a Shank2 más állvány fehérjéken (például a Homer-en, vagy a GKAP (guanylate kinase associated protein) proteinen) át, vagy pedig közvetlenül az 1-es csoportba sorolt metabotrop mglur1 és mglur5 receptorokkal, illetve az NMDA (N-metil-D-aszpartát) receptorral. 33

35 Szintén hasonló elv szerint vesz részt a cortactin a különböző polarizált epithel sejtek közti szoros kapcsolatot, az apikális és a bazolaterális membránoldal között tökéletes zárat biztosító, a paracelluláris permeabilitást szabályozó tight-junction -ök felépítésében. Itt a ZO-1 fehérje tölti be a kapocs szerepét, ami mind a cortactinhoz képes kapcsolódni (134), mind pedig a tight-junction-ök felépítésében fontos szerepet betöltő transzmembrán occludinhoz (147) és claudinhoz (148). Bár sokkal homályosabb szereppel és egyelőre pontosan nem tisztázott kapcsolatokkal, de a cortactin megtalálható az N- és E-cadherinek által felépített adherens junkciók területén is, ahol az intercelluláris kapcsolatok erősítésében vesz részt (149,150) RNS-interferenciával történő kiütése esetén a sejtek N-cadherinnel bevont gyöngyök iránti affinitása erőteljesen gátolt (150) sőt, jelen van a fokális adhéziók területén is (151). Meg kell említenünk továbbá a cortactin egy az intracelluláris kórokozók mozgásának segítéséhez hasonlóan pathológiás funkcióját is, amit gyakorlatilag génjének azonosítása óta ismerünk (123,124), hogy ti. a cortactin fontos szerepet tölt be egyes rosszindulatú daganatok kialakulásában, a szomszédos ép szövetek inváziójában és a daganatos sejtek szóródásában, a metasztázisképződés folyamatában, génjének amplifikációja pedig igen rossz prognózisra utal (152). Mindezek mellett amint az Li-nek és munkatársainaknak kísérleteiből kiderült a cortactin a lokális tumorok növekedését, daganatos sejtek osztódását nem fokozza, csupán a metasztázisok kialakulásának valószínűségét növeli, sőt, ha emlő carcinoma sejtekben tirozinon foszforilálódni nem képes cortactin mutánst expresszáltak (a 421-es, 466-os és 482-es tirozin fenilalaninra mutált), akkor e metasztázisfokozó képesség is kiküszöbölhető volt (153). Magyarázatul szolgálhat a cortactin inváziót és metasztázisképződést fokozó hatására egyrészt az a tény, hogy a cortactin overexpressziója a sejtmozgás fokozódásához vezet, másrészt pedig az a megfigyelés, hogy az extracelluláris mátrix inváziójához elengedhetetlen, annak degradációját eredményező membrán protrúziók, az úgynevezett invadopodiumok a mátrix metalloproteinázokon, valamint több, az aktin hálózattal kapcsolatban álló fehérjén például az α-actininon, a talinon, a tensinen, a paxillinen kívül cortactint is tartalmaznak, sőt anti-cortactin ellenanyag mikroinjekciójával a környező mátrix inváziója ki is védhető (154). Végezetül pedig és ez részben visszavezet minket a cortactin eredeti funkciójához, az elágazódó aktin polimerizáció folyamatának felgyorsításához a cortactin SH3 doménjével az N-WASP prolinban gazdag doménjéhez kapcsolódva az Nck-hoz, vagy a WISH-hez hasonlóan legalábbis in vitro aktin polimerizációs kísérletekben képes fokozni az N-WASP aktivitását (59,60). Minderre képes a teljes hosszúságú cortactin is, ám a fehérje 34

36 SH3 doménje sokkal potensebb aktivátor. Ennek magyarázatául talán az a megfigyelés szolgálhat, hogy a cortactin Erk általi Ser-foszforilációja fokozza, míg Src általi Tyrfoszforilációja csökkenti a fehérje N-WASP aktiváló képességét (59). Elképzelhető ugyanis, hogy a különböző foszforilációs állapotbeli változások a cortactin olyan konformációs változásait idézik elő, melyek vagy elérhetőbbé teszik a cortactin SH3 doménjét az N-WASP prolinban gazdag doménje számára, vagy pedig nehezebben hozzáférhetővé. Láthattuk tehát, hogy a cortactin által érintett folyamatok milyen szerteágazó rendszerét alkotják a sejtek működésének, ami előrevetíti a cortactin szabályozásának bonyolultságát, ellentmondásokkal tűzdeltségét is. A cortactin működésének szabályozása A cortactin széleskörű szerepét figyelembe véve nyilvánvaló, hogy működésének regulációja meglehetősen pontosan kell, hogy történjen, még ha e szabályozás terén szerzett ismereteink egyelőre több homályos, akár ellentmondásos ponttal is terheltek. Ismereteink hiányán túl azonban ezen ellentmondásokért részben talán éppen a cortactin által érintett folyamatok sokassága felelős. Elképzelhető, hogy a különböző kutatócsoportok által kapott, gyakran egymásnak homlokegyenest ellentmondó in vitro eredmények éppen abból adódnak, hogy a fehérje különböző folyamatokban betöltött szerepét egy-egy szabályozási mód talán teljesen máshogy érinti. Könnyen lehetséges például, hogy a legtöbb fehérjétől eltérően a cortactin foszforilációja nem aktiváló, vagy gátló hatással bír, hanem a cortactin egyes funkcióit erősíti, míg másokat háttérbe szorít. Egy olyan fehérje esetén, amely egymással gyakran szembenálló szerepeket is betölt, ez nem elképzelhetetlen. Hogy csak egy példát említsünk: a cortactin nyilvánvalóan nem lehet egyszerre, egy időben a lamellipodiumok segítségével lejátszódó sejtmozgás aktivátora, valamint a meglévő sejtkapcsolatok megerősítője is, holott mindkét folyamathoz szükség lehet aktivitására, valószínű tehát, hogy az a szabályozási mód, ami a cortactin egyik eseményben betöltött aktiváló szerepét erősíti, a másik folyamatbani aktivitását gátolja. Ha a cortactin 6. ábrán feltűntetett szerkezetére tekintünk, megállapíthatjuk, hogy a fehérje működésének szabályozásában valószínűleg annak C-terminális fele tölt be fontosabb szerepet. Ha mindezek mellett megemlítjük azt is, hogy a fehérje prolinban gazdag doménjén belül található 421-es, 466-os és 482-es tirozin, valamint a 405-ös és 418-as szerin 35

37 foszforilálódni képes, akkor feltehető, hogy a cortactin működésének szabályozásában a foszforiláció, valamint az SH3-doménen át történő fehérje-fehérje interakciók játszhatják a legfontosabb szerepet. Elsőként tehát a Tyr- és Ser/Thr-kinázok szabályozó szerepét, majd a cortactin működésének SH3 doménjén át megvalósuló szabályozását ismertetném, végezetül pedig néhány olyan, a fenti két csoportba be nem sorolható szabályozási módot, amilyen például a cortactin alternatív splicing-ja. A cortactin Tyr- és Ser/Thr foszforilációjának szabályozásban betöltött szerepe Mint már említettem, a cortactint eredetileg a v-src új szubsztrátjaként fedezték fel a fenti onkogénnel transzformált csirke embrio fibroblaszt sejtekben (120,121). A későbbiek során a fiziológiás és pathológiás stimulusok széles skáláját azonosították, melyek a cortactin Src általi foszforilációjához vezettek. Ilyen stimulus például az FGF (155), az EGF (156), vagy akár a trombin kezelés (157), az integrinek által mediált sejtadhézió (151), a Shigella flexneri-invázió (145), a hidrogén-peroxid által mediált endothélsejt károsodás (158), valamint a N-syndecan-dependens neurit növekedés is (159). Mindezeken túl más tirozin kinázokat is sikerült azonosítani, melyek a cortactin foszforilálásában egyes szignalizációs utak során szintén szerepet töltenek be. Ilyen kináz például a tromboxán A 2 hatását a vérlemezkékben a cortactin felé közvetítő Syk (160), a metasztatikus melanoma sejtvonalak integrin-közvetítette mozgásában szereppel bíró Fyn (161) és a PDGF-, illetve a CSF-1 kezelés hatására (162), valamint az ozmotikus stressz következményeként aktiválódó és a cortactint foszforiláló FER (163). Az egér cortactin 27 tirozint tartalmaz, melyek többsége a tandem ismétlődések, valamint az utolsó ismétlődés és az SH3 domén között helyezkedik el. Huang és munkatársai deléciós kísérletekkel igazolták, hogy e 27 tirozin közül a prolinban gazdag domén területére eső 421-es, 466-os és 482-es tirozin a három fő foszforilációs hely (164), Head és munkatársai pedig kimutatták, hogy a foszforiláció időben meghatározott sorrendben történik. Először a 421-es tirozin foszforilálódik, mely foszforiláció kötőhelyet teremthet az Src SH2- doménje számára, szorosabb kapcsolatot biztosítva ezáltal a kináz és szubsztrátja között, mely kapcsolat a 466, majd a 482-es tirozin foszforilációját eredményezi (165). Mindezek mellett Head és munkatársai azt találták, hogy a cortactin foszforilációjához in vivo szükséges a fehérje N-terminális fele is, míg in vitro erre nincs szükség. Olyan fúziós fehérjét előállítva, mely az Arp2/3 komplex inhibitor coronin N-terminálisát, valamint a cortactin C-terminálisát tartalmazza, így szemben a magában expresszált cortactin C-terminálissal a sejt 36

38 perifériájára transzlokálódhat, azt találták, hogy e fúzisós protein visszanyeri Src-általi foszforilációs képességét. Ismerve a fenti eredményeket, valamint a cortactin N- terminálisának funkcióját, valószínűsítették, hogy a cortactin foszforilációjához szükséges lehet a fehérje sejtszéli lokalizációja, amit ők a Rac-aktiváció számlájára írtak. Mindamellett, hogy a cortactin foszfotirozinjainak pontos helyei, azok foszforilációjának időbeni sorrendje, sőt, az egyes jelpályákban szerepet játszó kinázok is jól ismertek, magának a foszforilációnak a szabályozásban betöltött szerepe meglehetősen ellentmondásos. Elvitathatatlan, hogy a cortactin foszforilációja kötőhelyet teremt az Srckináz SH2-doménje számára, sőt, egyes megfigyelések szerint adapter fehérjék, például a Crk és az Nck is kötődhetnek SH2-doménjük segítségével e foszforilált tirozin oldalláncokhoz (166), potenciális kapcsolatot biztosítva ezáltal a tirozin foszforilációval járó szignalizációs utak és a kortikális aktin citoszkeleton között. Mindezeken túl viszont a foszforiláció szerepét vizsgálva több, elsőre meglepő felfedezésbe is belebotlunk. A cortactin felfedezése után nem sokkal Wu és munkatársai ugyanis azt találták, hogy a fehérje foszforilációja nem befolyásolja annak F-aktin kötő képességét (122). Ezzel szemben Huang és munkatársai in vitro kísérleteikben arra jutottak, hogy a cortactin Src-általi foszforilációja jelentősen képes gátolni annak az F-aktin szálakat kötegekbe rendező keresztkötési aktivitását, sőt, habár kis mértékben, de gátolja a cortactin F-aktin kötő képességét is (167). Szintén a tirozin foszforiláció negatív szerepére mutattak rá a Martinez-Quiles és munkatársai által elvégzett kísérletek is, melyekből kitűnt, hogy a cortactin tirozin foszforilációja gátolja a cortactin N- WASP aktiváló képességét (59). E megfigyelésekkel szemben sok kísérletben azt találták, hogy a tirozin foszforiláció valamilyen módon pozitívan érinti a cortactin működését. Li-nek és munkatársainak munkájából kiderült, hogy emlőrák vonalakat olyan hármas mutánssal transzfektálva, melyben a három fő foszforilációs tirozin fenilalaninra cserélt, majd e daganatokat egerekbe injektálva, jóval kisebb a csontmetasztázis esélye, mint a vad típust expresszáló daganatok esetén (153). Liu-nak és munkatársainak kísérleteiből pedig arra lehetett következtetni, hogy bár a cortactin foszforilációja a fehérje sejszélre helyeződéséhez nem szükséges, ám annak elmaradása a sejtvándorlást erőteljesen gátolja (168). De ugyanígy szükséges a cortactin foszforilációja a Shigellák intracelluláris mozgásához (145), vagy a melanomasejtek vándorlásához (161) és az intercelluláris kapcsolatok fenntartásához is (150). Ezen részben ellentmondó kísérletek alapján az tűnik a legvalószínűbbnek, hogy a cortactin foszforilációja nem szükséges a fehérje membránközeli transzlokációjához. Sőt, könnyen lehetséges, hogy a foszforiláció éppen a cortactin transzlokációjának felfüggesztésére szolgál, biztosítva ezáltal a sejtmozgáshoz szükséges aktin hálózat átrendeződés ciklicitását. Érthető 37

39 tehát, hogy amennyiben a foszforilációt gátoljuk, úgy a sejtmozgás elmaradását kapjuk eredményül akkor is, ha a foszforiláció maga a cortactin membránszéli lokalizációját felfüggeszti. E feltételezések megerősítését találjuk Fan-nak és munkatársainak azon eredményeiben, amiket az aktin depolimerizáció cortactinra kifejtett hatásait vizsgálva nyertek. Kísérleteikből kiderült, hogy az aktin depolimerizációját előidéző szerek fokozzák a sejtszélen felhalmozódó cortactin foszforilációjának mértékét (169), arra utalva, hogy a cortactinhoz kötődő F-aktin valamilyen módon képes megakadályozni, hogy a cortactinhoz a tirozin-kinázok hozzáférjenek. Mindezeken túl az is elképzelhető, hogy a tirozin foszforiláció eltérően a legtöbb fehérje tirozin foszforilációjától a cortactin esetén nem aktiváló, vagy gátló szerepet lát el, hanem csupán azt befolyásolja, hogy a cortactin mely jelpályában, mely folyamatokban fejtse ki a már egyébként is fennálló Arp2/3 komplex aktivátor hatását. Lehetséges, hogy amíg a foszforiláció a cortactin egyes folyamatokban betöltött szerepét például az N-WASP aktivációt akadályozza, addig más folyamatokban például az intracelluláris pathogének mozgásában, vagy a különböző sejtadhézióformákban inkább serkentő hatású pusztán azáltal, hogy lehetővé teszi a cortactin részvételét ezen eseményekben úgy változtatva meg konformációját, hogy egyes fehérjékhez nő, míg más proteinek iránt csökken SH3 doménjének affinitása. Sőt, az sem elképzelhetetlen, hogy egyes esetekben a foszforilált tirozinja kötőhelyet teremt olyan SH2 doménnel rendelkező adapterfehérjék számára, melyek a cortactint a hatása kifejtéséhez szükséges helyhez irányítják, ahogyan azt a Shigella invázió esetén a Crk fehérje kapcsán láthatjuk (145). Tovább bonyolítja a helyzetet az, hogy egyes megfigyelések szerint a cortactin 405-ös és 418-as szerinjét Ser/Thr-kinázok foszforilálhatják. E kinázok közül a Raf-MEK-Erk útvonal és ezen belül is az Erk szerepe egyértelmű (59, 170). A legújabb eredmények szerint a cortactin szerin-foszforilációja szemben a tirozin-foszforilációval fokozza a fehérje N- WASP akiváló képességét (59). A foszforiláció két formájának ilyen ellentétes hatása tehát ki-be kapcsolóként működhet a cortactin N-WASP aktiváló képességének tekintetében. In vitro kísérletek alapján elképzelhető, hogy a Cdc42 és a Rac által szabályozott PAK is képes a cortactin szerin/treonin foszforilációjára, így esetlegesen a fent említett két GTP-áz fehérje nem csupán a WASP és a WAVE fehérjéken át fejtheti ki hatását a sejtszéli aktin hálózatra, hanem a cortactinon keresztül is (171). Érdemes megemlíteni továbbá egy másik Rho GTP-áz-függő szerin/treonin kinázt is, a protein kináz N-γ-t (PKN-γ), ami hasonlóan a PAK hoz, aktív Rac-ot kötve szintén fokozni képes a cortactin szerin és treonin foszforilációjának szintjét és e foszforiláció in vitro 38

40 kísérletekben hasonlóan a tirozin foszforilációhoz gátolni képes a cortactin F-aktin keresztkötő aktivitását (172). A cortactin SH3 doménjén át megvalósuló működésszabályozás Tulajdonképpen a cortactin szerepének ismertetésekor felsorolt összes fehérje, fehérjekomplex, mely a cortactin SH3 doménjéhez kapcsolódhat, tekinthető egyben szabályozó fehérjének is olyan értelemben, hogy szerepet játszik a cortactin irányításában, olyan helyekre horgonyzásában, ahol annak aktivitása szükséges; hogy csak egyetlen példát említsünk, idegsejtekben az NMDA-kezelés receptorának indukcióján kívül a cortactin és a kortikális aktin hálózat átrendeződését is eredményezi (173). Mindemellett azonban ismert néhány fehérje, melynek közvetlenül is bizonyították cortactint aktiváló képességét. Ilyen fehérje például a RhoGAP (GTP-áz aktivátor protein) BPGAP1 fehérje, ami in vivo is képes kapcsolódni a cortactinhoz, annak transzlokációját előidézve, sőt, a két fehérje együttes expressziója ellentétben a külön-külön expressziójuk során kapott eredményektől jelentős sejtmigrációfokozódást eredményez (174). További érdekessége a BPGAP1-nek, hogy RhoGAP doménje a RhoA GTP-áz aktivitását képes fokozni, az aktív Rac-ot pedig képes megkötni, bár annak inaktiválására nem képes, BCH (BNIP-2 and Cdc42GAP homology) doménjéhez pedig a Cdc42 kötődhet szelektíven, így a Rac és a Cdc42 GTPáz fehérjék hatásait közvetítheti a sejtszéli aktin hálózat felé. Szintén a cortactin SH3 doménjéhez kapcsolódva fejti ki hatását a nemrégiben azonosított MIM (missing in metastasis) fehérje, ami in vitro képes fokozni a cortactin Arp2/3 komplex aktiváló és aktin polimerizációt fokozó hatását (139). Ennek magyarázatául az a tény szolgálhat, hogy a MIM fehérjén belül a cortactin SH3 doménjével kapcsolatban álló prolinban gazdag régió mellett egy G-aktint kötő WH2 domén helyezkedik el, így elképzelhető, hogy a WIP-nél látottakhoz hasonlóan (61) azáltal fejti ki aktiváló hatását, hogy a cortactinon keresztül egy G-aktin monomert biztosít az Arp2/3 komplex számára. Talán éppen ezzel magyarázható az N-WASP működésére kifejtett ellenkező hatása is. Lehetséges ugyanis, hogy azzal mintegy verseng a G-aktin kötéséért, ezért mérhető aktin polimerizáció gátlás in vitro. Említésre érdemes továbbá az a megfigyelés, hogy a NADPH-oxidáz p47phox alegysége in vivo szintén kapcsolódni képes a cortactin SH3 doménjéhez és talán szerepet játszhat a cortactin transzlokációjában is (138). 39

41 Szintén a cortactin in vitro aktivátora a dynamin 2, ami a cortactinhoz hasonló nagyságrendű koncentrációban jelentősen képes fokozni a cortactin aktin polimerizációt okozó Arp2/3 komplex aktivátor hatását, míg olyan cortactin mutánst használva, melyben az SH3 domén elrontott e fokozódás elmarad (175). Végezetül pedig e felsorolásba illik bele a WIP fehérje is, ami ahogyan azt pár sorral feljebb láthattuk G aktin kötő képességének segítségével eredményezheti a cortactin fokozott Arp2/3 komplex aktiváló hatását. Egyéb, a cortactin működését befolyásoló tényezők A cortactin szabályozásával kapcsolatban fontos megemlítenünk az előbbi két csoportba be nem sorolható HAX-1 (HS1 associated protein X-1) fehérjét, amit a cortactinnal homológ, hematopoietikus sejtekben expresszálódó HS1-gyel kapcsolatban fedeztek fel egy élesztő kéthibrid keresés során (176). Kiderült, hogy a HAX-1 képes kötődni a cortactin N- terminális végéhez is, sőt, képes a G13 heterotrimer G protein Gα 13 alegységéhez kapcsolódva annak hatásait is közvetíteni a sejtszéli aktin hálózat felé, fokozva az elágazódásképződéssel járó polimerizációt. E rendszerben a HAX-1, a Gα 13, a cortactin és a Rac egy négyes komplexet alkot, ami a cortactin sejtszélhez történő transzlokációját és a sejtmigráció fokozódását eredményezi (177). További szabályozást biztosíthat, hogy a cortactin tandem ismétlődéseket tartalmazó doménjén belül egy, míg a HS1 ismétlődésein belül három PI4,5P 2 kötőhely is található és a PI4,5P 2 kötése csökkenteni képes a cortactin és a HS1 F-aktint kötő, valamint keresztkötő képességét is (128). Bár a fentiek in vivo jelentősége nem tisztázott, a foszfolipideknek valószínűleg szerepe lehet a cortactin funkciójának finomregulációjában. A cortactin szerkezetének ismertetésekor már említésre került, hogy a fehérje alternatív splice variánsai a teljes hosszúságú proteinnél kisebb affinitást mutatnak az F-aktin iránt (126), valamint expressziójuk a sejtmigrációt is jóval kevésbé fokozza, mint a vad típusú cortactiné (127). Mindez tehát már mrns szinten lehetővé teszi a cortactin aktivitásának bizonyos mértékű befolyásolását. Szintén a cortactin szerkezetének jelentős megváltoztatásával fejti ki hatását a calpain is, ami az előzőleg az Src által foszforilált cortactin proteolízisét végzi el vérlemezkékben. Az ily módon kovalensen módosított cortactin kisebb affinitást mutat az F-aktin iránt, e calpainos emésztésnek tehát szerepe lehet a cortactin funkciójának lecsengetésében (178). 40

42 A Rho GTPázok, az aktin citoszkeleton változások karmesterei Visszatekintve az eddig leírtakra láthatjuk, hogy a Rho családba tartozó GTPáz fehérjék gyakorlatilag minden fejezetben felbukkantak, utalva e molekuláris kapcsolóként funkcionáló proteinek elengedhetetlen szerepére a sejtmozgás kapcsán. E család egyike a több mint száz, tipikusan kda molekulatömegű kis GTPáz fehérjét magába foglaló Ras szupercsaládnak, melynek további tagjai a Ras, a Ran, a Rab és az Arf családba tartozó fehérjék (179). A Rho család tagjait a rájuk jellemző úgynevezett inzert-domén alapján különböztethetjük meg a Ras szupercsalád többi tagjától, mely domén a GTPáz doménbe ékelődik be annak 5. β-lemez és 4. α-hélix struktúrája közé. A családba tartozó 22 fehérje 8 csoportba osztható: Rho-szerű, Cdc42-szerű, Rac-szerű, Rnd, RhoD, RhoH/TTF, RhoBTB és Miro alcsaládokról beszélhetünk (180, 8.ábra). Cdc42 Rac Rho Rnd RhoD RhoH/TTF RhoBTB Miro Cdc42 Rac1 RhoA Rnd1 RhoD RhoH/TTF RhoBTB1 Miro-1 TC10 Rac2 RhoB Rnd2 Rif RhoBTB2 Miro-2 TCL Rac3 RhoC Rnd3/RhoE Chp RhoG Wrch-1 8. ábra: A Rho-család alcsoportjai. Szerkezetükkel kapcsolatban meg kell említenünk, hogy a RhoBTB, a Miro, valamint a Chp fehérjék kivételével mindegyikük C-terminálisa poszttranszlációs módosuláson, izopreniláción esik át. Ez leggyakrabban geranilgeranilációt, esetenként pedig farnezilációt takar és lehetővé teszi a Rho család tagjainak membránhoz történő kikötődését (181), aminek elengedhetetlen szerepe van e fehérjék működésében. Működésük a többi kis GTPáznál látottakhoz hasonlóan történik, vagyis GTP-t kötve aktív, míg GDP-kötött formában inaktív állapotban vannak, ki- és bekapcsolásukat pedig guanin nukleotid kicserélődési faktorok (GEF), GTPáz aktivátor fehérjék (GAP), valamint guanin nukleotid disszociáció inhibitor fehérjék (GDI) végzik (9.ábra). A szabályozás lényege, hogy az inaktív GTPáz által megkötött GDP-t egy különféle jelpályákban aktiválódott kicserélődési fehérje GTP-re cseréli (valójában a GEF-ek működésük során nem csupán a GDP-GTP, hanem akár a GTP-GDP, sőt a GDP-GDP és a GTP-GTP cserét is katalizálhatják, a reakció irányát és az abban részt vevő 41

43 nukleotidok milyenségét az határozza meg, hogy a GTP intracelluláris koncentrációja egy nagyságrenddel meghaladja a GDP-ét), így a Rho fehérje, mivel önálló GTPáz aktivitása gyakorlatilag nincsen, képes effektorainak működését befolyásolni mindaddig, amíg egy aktiválódó GAP nem segíti elő az általa megkötött GTP hidrolízisét. A szabályozás részét képezik továbbá a GDI fehérjék, melyek hidrofób zsebükkel képesek befogadni a Rho fehérje geranilgeranil, vagy farnezil részét, megszüntetve ezáltal a GTPáz membránlokalizációját, lehetetlenné téve tehát a működését. Mindezen folyamatokért több, mint 70 GAP, hozzávetőlegesen 60 GEF és 4 azonosított GDI fehérje felelős, mutatva a Rho GTPázok szabályozásának bonyolultságát (182). 9. ábra: A Rho GTPázok működésének szabályozása. A folyamatok részletes magyarázata a szövegben található. A Rho család tagjai közül a legtöbbet vizsgált és így a leginkább tisztázott funkcióval és szabályozással rendelkező fehérjék a Rho, a Rac és a Cdc42 csoportba tartozó GTPázok, ezért, valamint azért is, mert a Rho GTPázok e három csoportja jól szemlélteti az aktin citoszkeleton változásának módozatait, a továbbiakban csupán e három csoport ismertetésére szorítkoznék. Alan Hall munkacsoportjának a 90-es évek elejétől folytatott kísérleteiből 42

44 kiderült, hogy az olyan, fénymikroszkóppal is megfigyelhető sejtbéli folyamatokért, amilyen a stressz rostok képződése, a lamellipodiumképződés és membránfodrozódás, valamint a filopodiumok kialakulása, a Rho családba tartozó Rho, Rac és a Cdc42 felelős (14, 183, 184). Noha a fent említett folyamatok mellett fény derült a Rho fehérjék egyéb funkcióira is, például a sejtproliferációban betöltött szerepére, mivel e funkciók az általam vizsgált folyamatokat nem érintik, ezért e munka kereti között csupán a Rho fehérjék aktin citoszkeleton változásokban szerepet játszó funkcióit és effektorait ismertetem. A Rho csoportba sorolt fehérjék Ahogyan az már Hall munkacsoportjának korai munkáiból is kiderült a Rho csoport tagjai és főként a RhoA és C tehetők felelőssé az integrin cluster -eket tartalmazó fokális adhéziók szerveződéséért, valamint az aktin stressz rostok kialakulásáért. E hatásukat legalább három effektor fehérjéjükön keresztül fejtik ki, a Rho kinázon (ROCK), a formin fehérjék közé tartozó mdia fehérjén és a foszfatidilinozitol-4-foszfát 5-kinázon (PI4P5-K) át (18, 185, 186). Ahogyan az a 10. ábrán is látható, a Rho képes aktiválni az aktin nukleációért felelős mdia-t, ami a formin fehérjéknél látott módon a profilinnel együttműködve fokozott aktin polimerizációhoz vezet. E folyamatot erősíti a Rho által aktivált PI4P5-K is, amelynek lipidterméke a foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát (PI4,5P 2 ) az aktin sapkafehérjékhez kötődve képes eltávolítani azokat az aktinszálak pozitív végéről, lehetővé téve ezáltal a rapid aktin polimerizációt. További segítséget nyújt az aktin stressz rostok kialakulásához a Rho kontrollja alatt álló ROCK által foszforilált és így aktivált LIM kináz (LIMK) is, ami foszforilálja és ezáltal inaktiválja az aktin depolimerizációjáért felelős cofilin fehérjét. A ROCK emellett képes fokozni a miozin könnyű lánc (MLC) foszforilációs szintjét is egyrészt közvetlenül foszforilálva azt, másrészt pedig a miozin könnyűlánc foszfatázt foszforilálva és így gátolva annak MLC defoszforiláló képességét. A foszforilált MLC a miozin fokozott aktivitását eredményezi, ami a fokozott aktin polimerizáció és gátolt depolimerizáció következtében kialakuló stressz rostokkal együttműködve a sejt kontrakciójához vezet (185,186). A megfigyelések szerint a fent vázolt folyamatok résztvevői nem egymástól függetlenül fejtik ki a hatásukat, hanem egy jól organizált hálózatot alkotva, melyben az egyes utak mindegyikének működése elengedhetetlen a tökéletes stressz rost-képződéshez. Azt találták ugyanis, hogy ha a Rho effektorok közül a ROCK-ot, vagy az mdia-t önmagában 43

45 expresszálják, akkor ugyan fokozott stressz rost-képződés figyelhető meg, ám e stressz rostok szerkezete, átmérője, orientációja, az általuk alkotott hálózat csak akkor normális, ha a két effektort koexpresszálják. Az önmagában expresszált konstitutívan aktív ROCK zavart irányultságú, elrendeződésű stressz rostok nagymértékű megjelenését eredményezi, mely rostok átmérője jóval meghaladja a normálisat. Ezzel szemben az mdia aktív formájának expressziója vékony, gyengén kötegelt aktinrostok finom hálózatát alakítja ki. A fent vázolt effektorokon kívül a Rho-nak egyéb effektorai is ismertek, melyek befolyásolhatják az aktin citoszkeleton szerveződését. Ilyen például a citron kináz, mely a ROCK-hoz hasonlóan a MLC foszforilációjában tölt be szerepet, bár szerepe nem annyira a sejtmozgásban, mint inkább a mitózis során keletkező utódsejtek szétválasztásában van (185). 10. ábra: A Rho effektorai és az általuk érintett citoszkeleton változások. Az ábra részletes magyarázata a szövegben olvasható. A fekete nyilak aktivációt, míg a piros vonalak a gátlást jelölnek. A Cdc42 csoport Hasonlóan a legelsőként karakterizált Cdc42-höz, a csoportba tartozó valamennyi GTPáz a vékony, tüskeszerű sejtmembránnyúlványok, a filopodiumok képzésében játszik szerepet (14, 181). A megfigyelések szerint a Cdc42 nem is annyira a sejtmozgást magát, mint 44

46 inkább annak irányítottságát szolgálja (16). Mindemellett a család tagjainak fontos szerep jut más, szintén irányító funkciókban is, amilyen például a sejtek polarizáltságának (Cdc42) kialakítása, a neuritnövekedés (TCL és TC10), vagy a GLUT-4 membránhoz transzlokálása (TC10) (181). A Cdc42 általi filopodiumképződés során a Cdc42 egyik fő effektora az Arp2/3 komplex aktivátor WASP, illetve az N-WASP fehérje. A WASP fehérjék egyedüli szerepét azonban megkérdőjelezik azok a génkiütéses kísérletek, melyekben a WASP fehérje expresszióját ily módon megszűntetve a filopodiumok jelenlétét tapasztalták (112, 114). További effektorai a Cdc42-nek a szerin/treonin kinázok csoportjába tartozó MRCK α és β (myotonic dystrophy kinase-related Cdc42-binding kinase), melyek a ROCK-hoz hasonlóan képesek a miozin könnyűlánc foszforilálására. Bár annak mechanizmusa, ahogyan e kinázok kifejthetik hatásukat a filopodiumképződésre, nem ismert, azonban szerepük e folyamat során kétségtelen, ugyanis domináns negatív formájuk expressziója meggátolja a filopódiumképződést, a vad típus expressziója pedig fokozza azt (18). A GTP-t kötő, aktív Cdc42 emellett képes kapcsolódni a szerin/treonin kinázok egy másik csoportját alkotó fehérjékhez, a p21-aktivált kinázokhoz (PAK) is. E kinázok CRIB doménjéhez kapcsolódva képes felfüggeszteni azok autoinhibitoros formáját, így a szabaddá váló kináz doménjük következtében azok kifejthetik katalitikus aktivitásukat, mely aktivitás igencsak sokrétű és melyből itt csak az aktin citoszkeletont érintő hatásokat említeném meg. A PAK-ok a ROCK-hoz hasonlóan képesek foszforilálni és ezáltal aktiválni a cofilint inaktiváló LIMK-t, meggátolva így az aktin depolimerizációt, de képesek a miozin könnyűlánc kináz foszforilálására is, ami viszont gátolja annak működését, csökkentve ezáltal a miozin könnyűlánc foszforilációjának mértékét és gyengítve a miozin aktivitást. E hatásukban tehát ellentétesek a ROCK-kal (18, 185). Itt érdemes megjegyezni, hogy amíg a PAK1-3 közös effektora a Cdc42-nek és a Rac-nak, addig a fentiektől meglehetősen eltérő szerkezetű PAK4 kizárólag a Cdc42-vel kerül kapcsolatba. Szintén a Cdc42 és a Rac közös effektora az IQGAP1 és 2. E fehérjék a nevüket a RasGAP-okkal megfigyelt szekvenciahomológiájuk alapján kapták, ám funkciójuk egyelőre nem tisztázott. In vitro kísérletek alapján úgy tűnik, hogy oligomerizálódva szerepük lehet az aktin filamentumok keresztkötésében, kötegelésében (187). Mindemellett az IQGAP1 Cdc42-t kötve képes kapcsolódni a mikrotubulusok + végéhez asszociált Clip-170 fehérjéhez, kapcsolatot teremtve ezáltal az aktin- és a mikrotubulus hálózat között (188). Végezetül érdemes megemlíteni a Par6 fehérjét is, melynek a sejtpolaritás kialakításában lehet szerepe és amely fehérje az aktív Cdc42-vel és az atípusos Protein kináz C családba tartozó PKCζ-val alkot hármas komplexet, így aktiválva a PKCζ-t., aminek következménye az adenomatous polyposis coli proteinnek (APC) a 45

47 mikrotubulusok + végéhez történő asszociációja és a mikrotubulusok kötegekbe rendeződése. Szintén az ily módon aktivált PKCζ szubsztátja lehet az Lgl (Lethal giant larvae) fehérje, amely fehérje a vándorló fibroblasztok vezető oldali membránjához lokalizált és valószínűleg szerepet tölt be a vándorló sejtek polarizálásában (189). A Rac fehérjék Az elsőként azonosított Rac1-hez hasonlóan a Rac csoportba tartozó Rho GTPázok mindegyike a membránfodrozódások, valamint a lamellipodiumok kialakulásáért felelős (184). A csoport négy tagja közül a Rac1, 2 és 3 erős, mintegy 88%-os szekvenciahomológiát mutat. Amíg azonban a Rac1 széles szöveti megjelenést mutat, addig a Rac2 kizárólag a hematopoietikus sejtekben, a Rac3 pedig főként az agyban expresszálódik. A család negyedik tagja, a RhoG fehérje szerkezetét és effektorait tekintve is eltér a fent említett három Rac fehérjétől. Megemlítése azért fontos, mert GTP-t kötve képes kapcsolódni az Elmo nevű fehérjével, valamint a Dock180-nal és az így létrejött hármas komplex képes a Rac1 aktiválására (190). A Rac család másik három tagjának effektorai közül a lamellipodiumképződés folyamatában kiemelkedő szerepet játszhatnak az Arp2/3 komplex aktivátor WAVE fehérjék, amelyek azonban eltérően a Cdc42 effektor WASP fehérjéktől CRIB doménnel nem rendelkeznek, így nem képesek az aktív Rac közvetlen megkötésére. A Rac hatását a WAVE1 felé valószínűleg az azt fehérjét inaktivációs komplexben tartó PIR121 (85), a WAVE2 felé pedig az IRSp53 fehérje (84) közvetítheti. További fontos effektorai a Rac GTPázoknak a Cdc42-nél ismertetésre került PAK fehérjék, melyek mint láttuk egyrészt a cofilint inaktiváló LIMK-t aktiválva, másrészt pedig a miozin könnyűlánc foszforiláltsági állapotát az MLCK gátlásán keresztül csökkentve fejtik ki hatásukat (18, 185), de egyes megfigyelések szerint a cortactint foszforilálva annak működését is befolyásolhatják (171). Egy másik közös pont a Cdc42-vel az IQGAP, melynek szintén aktivátora a Rac is (187). A Rac GTPázoknak azonban nem csupán a Cdc42-vel van közös effektora, hanem a Rho csoport tagjaival is, mégpedig a PI4P5-K, aminek lipidterméke, a PI4,5P 2 az aktin sapkafehérjékhez kötődve képes azokat eltávolítani az aktin filamentumok + végéről, így lehetővé téve a gyors polimerizációt. További érdekes szerepe lehet a PI4,5P 2 -nak a cortactin működésének finomregulációjában is, hiszen, mint láttuk, kötődhet a cortactin tandem ismétlődéseihez is, 46

48 befolyásolva azok F-aktin kötő képességét (128). Érdekes effektora a Rac-nak a POR-1 (partner of Rac) fehérje, amelyről azonban ismereteink meglehetősen hiányosak. Domináns negatív formájának expressziója, vagy a kötésére képtelen Rac mutáns kifejezése azonban erőteljes gátlója a Rac által kiváltott lamellipodiumképződésnek, szerepe tehát több mint valószínű az említett folyamatban (18, 191). Részben az ismertetett folyamatok szabályozáshoz vezet el minket a PI3-K, mely enzim amellett, hogy lipidtetmékén, a PI3,4,5P 3 -on keresztül fontos szerepet tölt be a Rac GTPázok aktiválásában, egyben effektora is a Rac-nak, ami így pozitív visszacsatolási hurkot biztosít a polarizált sejtmozgás során (3, 11-13). Szintén a Rho GTPázok összehangolt működésében tölt be szerepet a Rac akkor, amikor eddig nem pontosan meghatározott módon, közvetetten gátolva egy protein tirozin foszfatázt, a p190rhogap fokozott foszforilációját és így aktivitását idézi elő, ami a Rho csoport tagjainak inaktiválódásához vezet (185). További effektora lehet a Rac-nak a Protein kináz N-γ, amely a PAK-hoz hasonlóan szintén szerepet játszhat a cortactin működésének foszforilációs szintű szabályozásában (172), valamint a cortactinhoz kötődő és annak membránhoz történő transzlokációját elősegítő BPGAP1 fehérje is (174). A Rho GTPázok működésének szabályozása Amint azt már említettem, a Rho GTPázok olyan molekuláris kapcsolóként funkcionálnak, amely GTP-t kötve aktív, míg GDP-t kötő formában inaktív állapotban van és ezen kapcsoló ki- és bekapcsolásáért, vagyis a Rho GTPáz család és általában a Ras szupercsalád szabályozásáért a különféle kicserélődési faktorok (GEF), GTPáz aktivátorok (GAP), valamint néhány ismert guanin nukleotid disszociáció inhibitor fehérje (GDI) felelős (9.ábra). A GAP-ok szükségszerűségét az okozza, hogy ellentétben a heterotrimer G fehérjékkel a Ras szupercsaládba tartozó kis GTPázok endogén GTPáz aktivitása igen alacsony. A Rho és a Rac felfedezésekor, 1992-ben már számos Rho GAP is ismert volt, manapság pedig több, mint 70-re tehető azon fehérjék száma, melyek a Ras GAP-okétól jelentősen eltérő Rho GAP doménnel rendelkeznek (185), noha többségüknek a funkciója egyelőre ismeretlen. Magas számuk és a GAP doménen kívül bennük található egyéb domének hatalmas változatossága arra enged következtetni, hogy különböző szövetekben, illetve szignalizációs utakban a GAP-ok más-más tagjának lehet fontos szerepe. Jól példázza 47

49 működésük összetett szabályozását a p190rhogap, mely fehérje az Src által foszforilálódik és aktiválódik, inaktiválva ezáltal a Rho csoport tagjait. De aktiválódhat a Rho család másik két csoportja által, az Rnd által, mely fehérje közvetlenül kapcsolódhat hozzá, valamint a Rac által is egy bonyolultabb jelpálya eredményeként, amelyben a p190rhogap-ot defoszforiláló foszfatáz kerül gátlás alá, sőt, a Ras is képes fokozni a működését egy p120rasgap fehérje segítségével (185, 192). Érdemes megemlíteni egy másik Rho GAP-ot is, a Rac inaktivációjában szerepet játszó WRP-t, ami a WAVE1 fehérje inaktivációs komplexének tagja, és szerepet játszik a WAVE1 Rac általi aktivációját követően a Rac szignál lecsengetésében (86). A RhoGAP domén jelenléte egy fehérjében azonban nem jelenti automatikusan annak GTPáz aktivátor voltát. Vannak esetek, ahol e domén csupán az aktív Rac-hoz kötődésben játszik szerepet, kvázi egy CRIB domén szerepét betöltve. Ilyet találunk például a PI3-K p85-ös, szabályozó alegysége esetén is (13). A GEF-ek működéséről, illetve annak szabályozásáról jóval szélesebb körű ismeretekkel bírunk. A Rho család kicserélődési faktorait két csoportra oszthatjuk. Az egyik első azonosított GEF a Dbl volt (193), erről kapta a jóval nagyobb számú fehérjét tartalmazó és jóval régebben felfedezett Dbl család a nevét. E fehérjékre a Dbl homológ/pleckstrin homológ (DH/PH) doménpáros a jellemző, ahol a DH domén bír a nukleotid cseréhez szükséges katalitikus aktivitással, a PH doménnek pedig a katalízis elősegítésében, a PI3-K lipidtermékeinek megkötésében, így a fehérje membránhoz történő lokalizálásában, aktiválásában lehet szerepe, ám e domén szerepe kicserélődési faktoronként is eltérő (194). Néhány éve sikerült azonosítani a kicserélődési faktorok egy új csoportját, a Dock180 fehérjéket, mely csoportnak jelenleg legalább 10 tagja ismert (185). A Dock fehérjék sem DH, sem PH doménnel nem rendelkeznek, aktiválódásukhoz az RhoG-vel, valamint az Elmo-val alkotott hármas komplexük létrejötte szükséges (190). A kicserélődési faktorok magas számára való tekintettel a továbbiakban csupán néhány fontosabb, az általam vizsgált jelpályákban bizonyított, vagy lehetséges szerepet játszó GEF fehérjéről szólnék részletesebben, előre is megemlítve, hogy e kicserélődési fehérjék főként a Rac és a Cdc42 aktivációjában játszanak szerepet. A legjobban tanulmányozott GEF-ok a Vav fehérjék. E csoportba három GEF tartozik, a hematopoetikus sejtvonalakban kifejeződő Vav1, valamint a széles szöveti megjelenést mutató Vav2 és 3. Az ide tartozó fehérjék in vitro képesek mindhárom jelentősebb Rho csoport, a Rho, a Rac és a Cdc42 aktiválására is, bár in vivo valószínűleg a Rho aktivációjában kisebb szerepet töltenek csak be. A család tagjai a DH/PH doménpároson kívül tartalmaznak egy SH3/SH2/SH3 doménmotívumot is, melyből az SH2 doménnek a különféle 48

50 receptor- (EGFR, PDGFR) és nemreceptor tirozin kinázokhoz (Syk, ZAP-70), valamint egyes adapter fehérjékhez (Slp76) való kapcsolódásban van szerepe. A Vav fehérjék aktiválódása némiképp ellentmondásos. A hagyományos felfogás szerint foszforilálatlan állapotban a fehérje N terminális savas régiója kapcsolódik a DH doménhez, mintegy autoinhibitoros formát alkotva, mely formát a savas régió tirozin foszforilációja megszűnteti, lehetővé téve ezáltal a fehérje GEF aktivitásának kifejtését (195). Más felfogás szerint viszont a Vav fehérjék aktivációjában a PI3-K lipidtermékének, a PI3,4,5P 3 -nak a PH domén általi megkötése játszik elengedhetetlen szerepet. Foszforilációra képtelen, illetve a PI3,4,5P 3 kötésére nem képes mutánsok expressziójával, valamint a PI3-K gátlásával a Tamás Péter kollégám által elvégzett kísérletek alapján munkacsoportunk is erre az eredményre jutott (196). Feltételezésünk szerint a Vav2 esetén a tirozin foszforilációnak jóval inkább fehérjefehérje interakciókban, mint a Vav2 működésének szabályozásában lehet szerepe. Érdemes megemlíteni, hogy a Vav2 aktiválásában a Rap1-nek, egy másik, a sejtek adhéziójában és vándorlásában érintett, nem a Rho családba tartozó GTPáznak is szerepe lehet (200). Szintén a Rac aktivátora a Tiam fehérje, amely a Vav GEF-eknél látottakhoz hasonlóan szabályozódhat (197), ám mivel van egy RasGTP kötő doménje is, ezért összeköttetést teremthet a növekedési faktor receptorrol kiinduló Ras-MAP-kináz jelpálya, valamint az aktin citoszkeleton változások között, aktiv Ras-t kötve ugyanis kicserélődési aktivitása fokozódik (185). Érdemes megemlíteni az Sos kicserélődési fehérje szerepét is, amely eredetileg Ras GEF-ként lett leírva, ám az Abi1-gyel, az Eps8-cal, valamint a PI3-K p85-ös regulátoros alegységével alkotott komplexében Rac GEF-ként funkcionál (197). További Rac aktivátorok a P-Rex1, amit a PI3-K lipidtermékei, valamint a heterotrimer G fehérjék βγ alegysége aktivál és a PIX (PAK interacting exchange) fehérje, ami az aktív PAK-ot kötve, és az Nck adapterfehérjével, valamint növekedési faktor receptorokkal komplexet formálva fejti ki aktivitását, melynek segítségével a PAK visszahat aktivátorára, a Rac-ra, fokozva annak működését (198). A Rho GTPázok működését befolyásoló harmadik fehérjecsoport a GDI fehérjéket foglalja magába. A Rho GTPázok funkciójához elengedhetetlenül szükséges azok membránlokalizációja. Ezen képesek változtatni e kisszámú fehérjét magába foglaló csoport tagjai, hidrofób zsebükkel ugyanis képesek kapcsolatot létesíteni a poszttranszlációsan prenilált Rho GTPázok farnezil és geranilgeranil láncaival, így mintegy kiragadva a membránból azokat (181). Mindezen gátló funkciójuk mellett újabban feltételezik, hogy szerepük lehet a Rho GTPázok szubcelluláris lokalizációjának megváltoztatásában is. Del 49

51 Pozo és munkatársai például azt találták, hogy a RhoGDI szállíthatja az aktivált Rac-ot és Cdc42-t az új integrin adhéziók helyére, hozzájárulva ezzel a migráló sejt vezető oldali protrúziójához (199). Az aktin citoszkeleton változásait okozó egyes jelpályák összefoglalása Munkám során a sejtek alakváltozásának, vándorlásának, aktin citoszkeleton változásainak előidézéséhez három fő szignalizációs utat befolyásoltam: az EGF (epidermal growth factor) kezeléssel a EGF-receptor tirozin kinázról kiinduló reakcióutakat, a forbol észter kezeléssel a protein kináz C család aktivációját követő reakcióutakat, a sejtek fibronektinre történő leültetésével pedig az integrinekről kiinduló szignalizációs folyamatokat. E felyezetben megkísérlem e rendkívül szerteágazó és sokrétű szignáltranszdukciós útvonalak szigorúan csak az aktin citoszkeleton felé vezető elágazásainak összefoglalását, előrebocsátva, hogy ezen kísérlet az érintett fehérjék magas száma és az azok által alkotott hálózatok rendkívüli bonyolultsága miatt eleve kudarcra ítélt, az újabb és újabb felfedezésre kerülő fehérje-fehérje interakciók és finomregulációs mechanizmusok miatt pedig szükségszerűen erősen hiányos is. Az EGF jelpálya szerepe az aktin citoszkeleton változások szabályozásában Az EGF-receptor aktin citoszkeletonra kifejtett hatásaiban segít eligazodni a meglehetősen bonyolult 11. ábra is, melynek feladata nem is annyira az, hogy önálló ábraként funkcionáljon, hanem jóval inkább az, hogy az alant ismertetésre kerülő szöveggel párhuzamosan tanulmányozva elősegítse a leírtak megértését, az ismertetésre kerülő egyes részfolyamatok elhelyezését az egész jelpályán belül. Jóval inkább nevezhetjük tehát térképnek, mint ábrának, arra bíztatom tehát az olvasót, hogy használja úgy, mint természetjáró a turistatérképet: előrehaladásakor gyakran beletekintve. A könnyebb eligazodást segíti, hogy a különböző folyamatokat más-más színnel jelöltem, a fontosabbnak tartott reakcióutakat pedig megvastagított nyilakkal hangsúlyoztam ki. Szintén az 50

52 11. ábra: Az EGF jelpálya kapcsolatai az aktin citoszkeletonnal. A világoskék nyilak a Rac aktivációjának lehetőségeit, a sötétkék nyilak a Rac effektorait, a narancssárga nyilak az Arp2/3 komplex szabályozóit, a zöld nyilak e szabályozók regulációjának lehetőségeit, a piros vonalak pedig a gátlásokat jelölik. A fontosabb reakcióutakat vastag vonalakkal, a Rac aktivációban legjelentősebbnek tartott PI3K-Vav2-Rac útvonalat pedig lilával jelöltem. 51

53 áttekinthetőséget szolgálja, hogy például a kicserélődési faktorokat egységesen világoslila, míg a Rho GTP-ázokat kék, az effektoraikként szereplő szerin/treonin kinázokat piros, az inozitol lipideket foszforiláló kinázokat pedig egészen halványkék színnel jelöltem. Az EGF-receptor ligand általi aktivációja mintapéldája az egyetlen transzmembrán domént tartalmazó, intracellulárisan tirozin kináz aktivitással rendelkező receptor tirozin kinázok működésének. A receptor EGF-t kötve dimerizálódik és kereszt-autofoszforilálódik. Az így létrejött foszfotirozin oldalláncaihoz SH2 doménnel rendelkező fehérjék széles spektruma kapcsolódhat, mely fehérjék egy részét az aktiválódott receptor foszforilálni is képes. A legfontosabbnak tartott útvonal, amely az aktiválódott receptorról kiindul, az IA típusú PI3-K-ok aktivációja, ami a PI3,4,5P 3 megjelenéséhez vezet. A fent említett foszfatidilinozitol származék aztán kapcsolódva a Vav2 PH doménjéhez, fokozza annak kicserélődési aktivitását, ami a GTP-t kötő aktív Rac (valamint Rho és Cdc42) megjelenéséhez vezet (196) (elképzelhető ugyanakkor, hogy a Vav2 aktivációjában annak EGFR általi foszforilációja is szerepet játszik, nem csupán a PI3,4,5P 3 (195)). A Vav2 mellett a PI3-K aktiválhatja a Rac egyéb kicserélődési faktorait is, amilyen például a Tiam1, vagy a P-Rex1, melyek szintén képesek a Rac (és a Cdc42) által kötött nukleotidok cseréjére (197). Tovább bonyolítja a helyzetet, hogy a Rac működésének szabályozásában több útvonalon a MAP-kináz kaszkád aktivációjában érintett Sos-Ras kicserélődési faktor-gtpáz kettős is részt vállalhat. Az Sos-t az autofoszforilált receptorhoz kötődő Grb2 adapter fehérje transzlokálja a membránhoz, a Ras közelébe, ahol az szerepének megfelelően elvégzi a guanin nukleotid cserét a Ras-on, így aktiválva azt. Az újabb megfigyelések szerint a Ras effektora nem csupán a MAP-kináz kaszkádot elindító Raf lehet, hanem az IB csoportba tartozó PI3-K-ok is, melyek a GTP-Ras-t kötve aktiválódhatnak és az általuk létrehozott PI3,4,5P 3 az IA PI3-K-oknál bemutatott módon aktiválhatja a Tiam1-t, a P-Rex1-t és legfőképpen a Vav2-t. Emellett a GTP-Ras közvetlenül is képes kapcsolódni a Tiam1-hez, aktiválva azt (185), de az eredetileg Ras GEFként azonosított (ám a Rho GEF-ekre jellemző DH/PH doménpárral is rendelkező) Sos is képes lehet a Rac aktiválására, ugyanis az Abi1-gyel, az Esp8-cal, valamint a PI3-K regulátoros, p85 alegységével alkotott komplexében Rac GEF aktivitást mutat (197). Újabb lehetőséget teremt a Rac aktivációjára a nem receptor tirozin kináz Src is, ami az autofoszforilálódott receptorhoz kötődve és általa foszforilálódva aktiválódik és többek közt foszforilálhatja a PI3-K-t is, amely foszforiláció fokozza annak működését, megnövelve tehát a fent említett Rac GEF-ek kicserélődési aktivitását. De az ábrán nem jelölt, ám az aktiválódott EGF-receptorhoz kötődni képes PLCγ is érintett lehet e folyamatokban, hiszen az általa elindított Ca 2+ -jel következtében aktiválódó Ca 2+ /calmodulin-dependens protein kináz II 52

54 képes foszforilálni és ezáltal aktiválni a Tiam1-t, vagy megemlíthetjük a Ras szupercsaládba tartozó és a receptor tirozin kináz aktivációt követően szintén aktiválódó Rap1-t is, ami a Vav2-n és a Tiam1-en keresztül fejti ki a Rac-ra gyakorolt hatását. Az e bonyolult utakban aktiválódott Rac ezt követően effektorai által egyrészt pozitív visszacsatolási hurkokat hoz létre, másrészt pedig kifejti hatását az aktin citoszkeletonra. Ilyen pozitív visszacsatolást jelenthet az, hogy a Rac képes aktiválni a PI3-K-t (3, 11-13), mely folyamatnak fontos szerepe lehet a sejtmozgást bevezető polarizációban, valamint a PI3-K aktivitásának fenntartásában a mozgás folyamata során, valamint az is, hogy a Rac-effektor PAK aktiválódva és autofoszforilálódva kapcsolódhat az Nck-val és a PIX Rac GEF-fel, mely komplexformálódás a PIX kicserélődési aktivitásának megjelenését eredményezi (198). A Rac legfontosabb a citoszkeleton változásait előidéző effektorai a WAVE fehérjecsalád tagjai, melyeket a Rac indirekt módon, az IRSp53-on (84) és a WAVE1 működését gátló inhibitoros komplex tagján, a PIR121-en (85) keresztül aktivál. Szintén fontos effektor a pozitív visszacsatolásoknál már említett PAK, amely egyrészt a LIMK-t (e foszforiláció a LIMK aktiválódását eredményezi, ami viszont az aktin depolimerizációjában fontos szerepet betöltő cofilin fehérje gátlásához vezet), másrészt pedig a cortactint foszforilálva fejti ki hatását, de az Arp2/3 komplex p41-arc alegységét foszforilálva finomregulációs szerepet is betölthet (64). Érdemes megemlíteni a PI4P5-K-t is, melynek terméke, a PI4,5P 2 amellett, hogy az aktin sapkafehérjék működését gátolja, felszabadítva ezáltal a + végeket, a cortactin tandem ismétlődéseihez is kötődik, modulálva azok F-aktin kötő képességét (128) és a WASP fehérjék működését is befolyásolja (75). További Rac-effektorok a cortactin membrántranszlokációjában potenciális szerepet betöltő BPGAP1 (174), ami egyben a Rho csoport GTPázainak GAP fehérjéje is, és a cortactin szerin/treonin foszforilációjában érintett PKN-γ (172). Látható tehát, hogy a Rac (és az itt működését tekintve nem részletezett Rho, illetve Cdc42, amelyek sok tekintetben a Rac-hoz igen hasonlóan aktiválódnak és fejtik ki hatásukat az aktin citoszkeletonra, a Cdc42 főként a WASP, a Rho pedig a ROCK és a formin csoportba tartozó aktin nukleátor mdia fehérjéken keresztül) központi szerepet tölt be az aktin citoszkeleton változások szabályozásában. Ez a szerep azonban nem kizárólagos. A Rac-on kívül, azt elkerülve az aktivált EGF-receptorról kiinduló jelek sokassága hat az aktin citoszkeletonra. Szó volt már az Src-ről, amely kináz amellett, hogy közvetetten elősegítheti a GTP-Rac mennyiségének növekedését, közvetlenül foszforilálhatja és ezáltal regulálhatja az Arp2/3 komplex aktivátorok mindkét csoportjának tagjait, a cortactint és a WASP fehérjéket is ( , 121). Az Nck adapterfehérje szintén az Arp2/3 aktivátorokon át fejti ki hatását: kapcsolódva a WAVE1 fehérje inhibitoros komplexének tagjához, a Nap125-höz, lehetőséget 53

55 teremt a WAVE1 aktiválódására (85), de egyes megfigyelések szerint SH2 doménjével a foszforilálódott cortactin foszfotirozin oldalláncaihoz is kapcsolódhat, bár e kapcsolat szerepe a cortactin működésének szabályozásában egyelőre felderítetlen (166). Az Nck emellett egyik SH3 doménjével kötődhet a WIP fehérjéhez is, amely képes a cortactin kötésére és aktiválására (61,98). Végezetül pedig érdemes megemlíteni, hogy a cortactint egyes irodalmi adatok szerint foszforilálhatja a MAP-kináz kaszkádban aktiválódó Erk is (59), újabb potenciális kapcsolatot teremtve ezáltal az aktin citoszkeleton változások szabályozása, valamint a Ras GTPáz között. Az integrin jelpálya A kísérleteinkben alkalmazott eljárás során, melyben előzőleg tripszinnel felszedett, ám egyébként felszínhez rögzülten növekvő sejteket az integrinjeik regenerálódása után fibronektinnel bevont felszínre ültetünk vissza, az integrinekről kiinduló jelpályáknak van fontos szerepe, a következőkben tehát rövid ismertetést adok az integrinekről, valamint kapcsolatukról az aktin citoszkeleton hálózattal. Az integrinek a sejtadhéziós receptorok közé tartozó, a membránt egyszer átívelő, rövid, katalitikus aktivitással nem bíró intracelluláris és jóval kiterjedtebb extracelluláris doménnel rendelkező fehérjék, melyek az extracelluláris mátrix különböző fehérjéi például a fibronektin, a laminin, vagy a kollagén számára szolgálnak receptorként. Felépítésüket tekintve egy α és egy β integrin alegység által alkotott heterodimerek. Az integrinek specificitását éppen a 20-at közelítő α és a 8 β alegység nagyszámú kombinációja biztosítja. A kísérleteinkben használt fibronektin receptora például az α5β1 integrin (201, 202). Amint korábban említettem, az integrinek katalitikus aktivitással nem rendelkeznek, hatásukat a ligand kötődését követően jelentkező, az intracelluláris doménre is kiterjedő konformációváltozás, valamint a két alegység egymáshoz viszonyított helyzetének megváltozása közvetíti (201). Ellenkező irányú szabályozást biztosít, hogy a különböző intracelluláris fehérjék befolyásolhatják az integrin ligand iránti affinitását valószínűleg szintén konformációváltozásokon keresztül. A megfigyelések szerint az integrinek ligand kötése filopodiumok, lamellipodiumok kialakulását, majd a későbbiek során stressz rostok és fokális adhéziók megjelenését eredményezheti, minden egyéb ismeret hiányában is valószínűsíthető tehát, hogy az integrinekről kiinduló jelpályákban a Rho GTPázoknak 54

56 szintén fontos szerepe lehet. Price-nak és munkatársainak kísérleteiből már 1998-ban kiderült, hogy a Rac és a Cdc42 aktiválódik az integrin jelpályában, sőt, működésük elengedhetetlen a sejtek integrin-mediált szétterülése során (203). A Rho GTPázok aktivációjához hasonlóan az EGF jelpályánál látottakhoz több útvonal vezet (12.ábra). A ligandot kötő aktív integrin egyik első azonosított effektora a FAK (fokális adhéziós kináz) volt. A FAK a talinon és a paxillinen keresztül kacsolódik a ligandját kötő integrinhez, autofoszforilálódik és aktiválódik 12. ábra:az integrin jelpálya. Az egyes fehérjék és folyamatok részletes magyarázata a szövegben található. Az ábra áttekinthetősége végett a kicserélődési faktorokat egységesen világos lilával, a különböző kis GTPázokat pedig kékkel jelöltem. A piros vonalak gátlásokat jelölnek. 55

57 (204). E foszforilációs hely számos fehérje kötőhelyéül szolgálhat, ide kapcsolódhat például SH2 doménjével az Src, vagy a Fyn tirozin kináz, de akár a PLCγ és a PI3-K p85 alegysége is. A kikötődött Src a FAK általi kötés miatt aktiválódva képes foszforilálni számos, a fokális adhéziók felépítésében szerepet játszó fehérjét, például a paxillint, vagy a tensint, valamint a p130 CAS dokkolófehérjét, amely így alkalmassá válik az Nck és a Crk adapterfehérjék kötésére, de a PI3-K-t, így aktiválva azt, sőt, érdekes módon magát a FAK-ot is, kötőhelyet hozva létre ezáltal rajta a Grb2 adapterfehérje számára (205). Az eddig leírtak máris több lehetőséget teremtenek rá, hogy a jel a Rho GTPázokhoz jusson. Ahogyan azt láttuk, a PI3-K a PI3,4,5P 3 -on keresztül több Rac GEF-t is aktiválhat, például a Tiam1-t, vagy a Vav2-t, de az Nck-tól is kiindulhat a jel a Rac felé a PAK/PIX kicserélődési faktor/nck komplexen keresztül. A PIX emellett a paxillinnel és a PKL fehérjével alkotott komplexben is aktív (198, 206). További lehetőséget teremt a Rac aktivációjára a p130 CAS, mely fehérje elősegíti a Crk/Elmo/Dock180 komplex létrejöttét (206), ami ahogyan azt korábban már láthattuk a Dock180 Rac-GEF aktivitásának megjelenéséhez vezet. Mindezek mellett az Src által foszforilált FAK-hoz kapcsolódó Grb2 az Sos Ras-GEF-en és a Ras-on keresztül beindíthatja a MAP-kináz kaszkádot is (az integrinek szerepe a sejtproliferációban, valamint a PI3-K- Akt/PKB jelpályán át az apoptózisgátlásban, a sejt túlélésében is vitathatatlan), de az EGF jelpályánál látott kapcsolatokon keresztül akár a Rho GTPázok aktivitására is hatással lehet. Felvázolható egy olyan reakcióút is, amelyben p130 CAS -hoz kötődő Crk-hoz kapcsolódik a C3G fehérje, a Rap1 GTPáz kicserélődési faktora, amely aktiválhatja a Rap1-t. A Rap1 pedig ahogyan azt láthattuk kapcsolódhat a Vav2-höz és a Tiam1-hez, aktiválva azokat, mely aktiváció ismét csak a Rac GTP-t kötő formájának megjelenéséhez vezet (200, 201). A Crk emellett hasonlóan az Nck-hoz SH2 doménje segítségével kapcsolódhat a tirozin oldalláncán foszforilált cortactinhoz is, amely kapcsolatnak bizonyított szerepe van például a Shigellák intracelluláris mozgatásában, nem kizárt tehát, hogy itt is szereppel bír (145). A fentieken túl az aktin citoszkeleton változások szabályozásában egyéb reakcióutaknak is szerepe lehet. A FAK által foszforilált PI4P5-kináz például egyrészt fokozott enzimaktivitással, másrészt pedig megnövekedett talin iránti affinitással bír. Az integrinekhez kapcsolt talinhoz történő kapcsolódása pedig tovább fokozhatja aktivitását, az általa képzett PI4,5P 2 pedig az EGF-receptor aktivációja kapcsán ismertetett módokon befolyásolhatja az aktin citoszkeleton változásait. Szintén a Rac-tól független reguláció lehetőségét teremti meg az ILK (integrin linked kinase), amely fehérje az integrinekkel kapcsolódva képes kötődni a PINCH (particularly interesting new Cys-His protein) 56

58 proteinhez, amihez viszont az Nck, a WASP fehérjecsalád közvetlen aktivátora kapcsolódhat (198,206). Érdemes kitérni rá, hogy az integrin jelpályában az egyes Rho GTPázok működése időben is jól összehangolt, az események elején a Rho csoport tagjainak inaktivációját, a későbbiek során pedig reaktivációját figyelhetjük meg. A kezdeti inaktivációért valószínűleg az Src (és esetleg a FAK) felelős, amely fehérje foszforilálja egyrészt a p190rhogap-ot, aktiválva azt, másrészt pedig a paxillint, ami így képessé válik a p120rasgap fehérje megkötésére, ami ezáltal disszociálódik abból a komplexből, amit ezt megelőzően a p190rhogap-pal alkotott, e disszociáció pedig szintén a p190rhogap fokozott aktivitását eredményezi, a Rho inaktiválódásához vezetve. A később aktiválódó Shp-2 (Src homology region 2 containing protein tyrosine phosphatase 2) foszfatáz aztán defoszforilálja a p190rhogap-ot, csökkentve annak aktivitását, ami a GTP-kötött aktív Rho megjelenését eredményezi (206).. Végezetül pedig meg kell említenünk, hogy az integrinek felől érkező jelek valószínűleg az Src-n keresztül az EGF-receptor foszforilációját és aktivációját idézik elő (207), ami az ismertetett két jelpálya, a növekedési faktor receptor -, valamint az integrin jelpálya szoros és igen komplex együttműködését jelzi. A forbol észter kezelés által aktivált jelpályák A sejtek forbol mirisztát acetáttal (a továbbiakban PMA) történő kezelése a szerin/treonin kináz protein kináz C családba tartozó fehérjéket aktiválva fejti ki hatását az aktin citoszkeletonra, mely hatás az általunk vizsgált sejvonalban, a HepG2 humán hepatoma sejtekben a kolóniákban növekvő sejtek szóródása. A protein kináz C családba tartozó legalább tucatnyi azonosított enzimet szerkezetük és aktivációjuk szerint három csoportba oszthatjuk. A klasszikus PKC-k közé soroljuk a PKC α-t, β-t és γ-t, az új PKC csoportba tartozik a PKC δ, ε, η, és θ, az atípusos PKC-k csoportját pedig a PKC ζ, a ι, valamint a μ alkotja. A klasszikus PKC-k jellemzője, hogy aktivációjukban mind a foszfatidilszerinnek, mind a Ca 2+ -nak, mind pedig a diacilglicerolnak (DAG) szerepe van. Az új típusú PKC-k aktivációjához a Ca 2+ -szignál nem szükséges, míg az atípusos csoport tagjainak aktivációja DAG- és Ca 2+ -independens, szerepe lehet viszont szabályozásukban a foszfatidilszerinnek, valamint a másik két csoport tagjainak. A PMA az enzim C1 doménjéhez kötődik, a DAG 57

59 kötőhelyhez, logikus tehát, hogy a forbol észter kezelés hatását csupán a klasszikus és a új csoport tagjain át fejtheti ki (bár a nagyfokú szekvenciaeltérések miatt egyesek által PKD-nek is nevezett PKC μ képes aktiválódni a PMA kezelést követően) (208, 209). A PKC-k számos szignalizációs útban játszanak szerepet, például a sejtproliferáció szabályozásában, a differenciálódásban, a túlélési jelpályában de az apoptózisban is, a sejttranszformációban, valamint az aktin citoszkeleton és a sejtmozgás szabályozásában. Hatásaik kifejtésének pontos útvonala leggyakrabban ismeretlen, nagyszámú, egymásnak nemritkán ellentmondó közlemény jelent meg a PKC fehérjék szubsztrátjairól, azok foszforilációjának hatásáról. Ennek oka valószínűleg kettős: egyrészt a különböző sejtvonalakban expresszálódó más-más PKC családtagoknak, másrészt pedig a különböző szubsztrátok, vagy feltételezett szubsztrátok szintén változatos expressziós mintázatának köszönhető. Mivel munkám a sejtmozgás és az aktin citoszkeleton változások vizsgálatára terjed ki, ezért csupán az e folyamatokat érintő potenciális utak megemlítésére szorítkozom. Az első említésre érdemes adat, hogy a PKC aktiváció az Src kinázok aktiválódásához vezet. Ennek két lehetséges módját is leírták: egyrészt a PKC közvetlenül is foszforilálhatja az Src-t, annak aktivációját eredményezve (210), másrészt pedig a PKC foszforilálhatja a PTPα-t (protein-tyrosine phosphatase α), a foszforilált PTPα pedig képes defoszforilálni az Src-t, így aktiválva azt (érdekes módon az Src működésében a tirozin foszforiláció kettős szerepet tölt be: amíg a kináz domén foszforilációja az Src aktivitásának fokozódásához, addig a C- terminális rész foszforilációja mivel intramolekuláris kötőhelyet teremt az N-terminálisan elhelyezkedő SH2 domén számára az Src működésének gátlásához vezet; a PTPα-nak ez utóbbi, gátló foszforiláció felfüggesztésében lehet szerepe) (211). Az Src jeltovábbító feladata azonban közel sem olyan egyértelmű, ahogyan azt gondolhatnánk. Egyes megfigyelések szerint a p190rhogap-ot foszforilálva, annak fokozott működéséhez, ezáltal pedig a Rho csoport tagjainak fokozódó GTPáz aktivitásához, így inaktiválódásához vezet (210). Ezzel szemben számos más, így a mi munkacsoportunk által kapott korábbi adatok szerint is az Src ugyan aktiválódik a PKC hatására, ám gátlása nincs hatással az aktin stressz rostok organizálására, sőt, a sejtmozgásra sem (212). Valószínűleg szintén az Src-n keresztül történhet meg a PI3-K PKC általi aktivációja is (213), bár egyes adatok szerint így munkacsoportunk korábbi eredményei alapján is arra lehet következtetni, hogy a PI3-K-nak a PKC által előidézett aktin citoszkeleton változásokban, valamint a PMA által indukált sejtvándorlásban szerepe nincsen (214). Érdekes megfigyelés, hogy egyes PKC családtagok, például a PKCα képesek kapcsolódni az integrinek β láncához, ami a két rendszer keresztregulációjára utal. A PKCα 58

60 in vitro foszforilálni is képes az integrin β1-t, noha e foszforiláció in vivo jelenlétét, illetve esetleges szerepét egyelőre nem vizsgálták. Egy másik mód a két rendszer kapcsolatára, hogy a PKC legalábbis in vitro foszforilálni képes az ezrint, melyről kimutatták, hogy az 567-es treonin oldalláncának foszforilációja felfüggeszti intramolekuláris autoinhibícióját, lehetővé téve számára, hogy az integrinekhez kapcsolódjon és részt vegyen az integrin jelpálya beindításában. Egy további módja a PKC esetleges hatásközvetítésének, hogy képes foszforilálni és ezáltal aktiválni az Arf (ADP ribosilation factor) GEF ARNO-t (ADP ribosilation factor nucleotide exchange factor), mely fehérje a Ras szupercsaládba tartozó Arf fehérjék kicserélődési faktora. Az intracelluláris membránok irányításában, valamint az endocitózis folyamatában szerepet játszó Arf GTPázok effektorairól keveset tudunk, úgy tűnik azonban, hogy az aktin citoszkeleton változásokban is érintett Arf6 részt vehet a Rac aktiváció folyamatában, valamint kapcsolódhat a Rac effektoraként azonosított POR-1 fehérjéhez is, melynek fontos, ám egyelőre nem azonosított szerepe van a lamellipodiumképződésben (216). Számos egyéb elképzelés is ismert a PKC-k hatásának közvetítésére. Egyes megfigyelések szerint foszforilálhatják a Rac GEF Tiam-ot, befolyásolva annak működését, megint mások szerint a RhoGDI fehérjét foszforilálva és gátolva a Rho fokozott aktiválódását eredményezik, de feltételezik, hogy a FAK-ot is foszforilálhatják, fokozva az integrin jelpályán át zajló sejtszétterülést (206), sőt, a PKCθ foszforilálhatja a WIP fehérjét is, amely így leválik a WASP-ról (217), ami egyes megfigyelések szerint annak gátlás alóli felszabadulását jelentheti (62). Mindezeken túl a PKCα ismeretlen módon szerepet játszhat az F aktin kötegekbe rendezésében is. Számos olyan PKC szubsztrát ismert, ami valamilyen módon kapcsolatban állhat az aktinszálakkal. Ilyen például az aktin sapkafehérje adducin, melynek foszforilációja csökkenti annak sapka-aktivitását (218), de a PKCβII közvetlenül is képes az F aktinhoz kapcsolódni A PKC foszforilálja az aktinrostokat keresztkötő filamint, valamint az integrinek két partnerét, a talint és a paxillint is (219). E folyamatok jelentősége egyelőre ismeretlen. Szintén a PKC szubsztrátja a MLC, melynek szerin/treonin foszforilációja a símaizomsejtekben kontrakciót vált ki (219). Érdemes megemlíteni azt is, hogy a PKC kapcsolódhat a NADPH-oxidáz p47-es alegységéhez is, ami viszont a cortactinnal lehet kapcsolatban (138), valamint, hogy szekvenciavizsgálatok alapján potenciális szubsztrátja lehet a cortactin SH3 doménjéhez kötődő MIM fehérje is, melynek szerepe lehet a cortactin aktiválódásában (139). Végezetül érdemes megemlíteni, hogy a PMA nem kizárólagosan a PKC család tagjainak aktivátora. Fokozhatja például a PKD (másik elnevezése PKCμ) működését is, 59

61 amely fehérje szerepet tölthet be egyes tumorsejtvonalak inváziókészségében. Megfigyelték ugyanis, hogy az extracelluláris mátrix degradációjának helyén kialakuló invadopodiumban a PKD a cortactinnal és a paxillinnel komplexet formálva van jelen és e hármas komplex létrejötte elengedhetetlen az extracelluláris mátrix lebontásához, a sejtinvázióhoz (154). Említésre érdemes a forbol észter első, nem PKC családtag effektora, a chimaerin is, ami Cdc42/Rac GAP-ként funkcionálhat, noha a PMA kötése a fehérje GAP aktivitását nem befolyásolja (220). Szintén képesek PMA-t kötni számos más fehérje mellett egyes Ras GEF-ek (220), sőt, akár Rho GEF-ek is, például a Vav csoport tagjai, vagy az Fgd1 (216), bár ezek PMA kötés általi szerepe a forbol észter-indukálta jelpályában meglehetősen valószínűtlen (a PKC-k gátlása ugyanis a PMA hatását felfüggeszti, ami a PKC-k központi szerepére utal). 60

62 Célkitűzések Amint az eddigi fejezetekből kiderült, a cortactin működésének szabályozásáról, ezen belül a fehérje transzlokációjáról és foszforilációjáról meglehetősen ellentmondásos kép alakult ki az irodalomban. A mai napig nem tisztázott sem a fehérje szerin/treonin, sem pedig tirozin foszforilációjának pontos szerepe működésének szabályozásában, de gyakran maguk a protein kinázok sem, melyek a foszforilációért felelősek. Kísérleteinkben arra törekedtünk, hogy több jelpályában is megvizsgáljuk a cortactin foszforilációjának a transzlokációban és a fehérje aktivitásában betöltött szerepét, valamint ellenőrizzük azon irodalmi adatokat, melyek szerint a cortactin foszforilálására a Rac effektor PAK is képes (171), közvetlen kapcsolatot teremtve ezáltal a Rac és a cortactin között. Kutatási célkitűzéseink ezért az alábbiakban foglalhatók össze: Vizsgálni kívántuk, hogy 1, rövid idejű EGF kezelés hatására foszforilálódik-e a cortactin tirozin vagy akár szerin/treonin oldalláncokon. 2, szubsztrátja-e a cortactin a PAK kináznak. 3, szerepet játszik-e a cortactin az integrin jelpályában. 4, transzlokálódik-e a cortactin a sejt perifériájára forbol észterrel kezelt HepG2 sejtekben, s ha igen, milyen mechanizmus(ok) szerepel(nek) a cortactin transzlokációjának szabályozásában. 61

63 Anyagok és módszerek Plazmidok és konstrukciók A v-src konstrukciót Julian Downward londoni laboratóriumából, a vad típusú, valamint a foszforilációs mutáns cortactint és a GFP-cortactin (1-334 aminosav), valamint a GFP-cortactin ( aminosav) konstrukciókat Kapus Andrástól, Torontóból, a teljes hosszúságú PAK1-t pedig Ed Manser szingapúri laboratóriumából kaptuk. A GFP-Vav2 konstrukció Tamás Péter kollégám munkájának eredménye. A konstitutívan aktív T423E PAK1 konstrukciót a vad típusú PAK1 felhasználásával, Quick Change site-directed mutagenezis eljárásssal Enyedi Balázs TDK-hallgatónk készítette el a Stratagene leírását követve. Szintén így készítettük el a GFP-cortactin C-term SH3 mutáns W525K konstrukciót is A PAK1 CRIB doménjét PCR-amplifikációt követően EcoR1/Sal1 emésztés után a szintén emésztett EGFP-C2 plazmidba ligáltuk. A GFP-cortactin W525K SH3 mutáns konstrukciót a GST-cortactin SH3 mutáns konstrukció felhasználásával állítottuk elő EcoR1/Sal1 restrikciós enzimek segítségével, az emésztett DNS-t szintén emésztett EGFP-C2 plazmidba ligálva. Az előállított konstrukciókat minden esetben DNS-szekvenálással, valamint a GFP-konstrukciók esetén COS7 sejtekben történt expressziójuk után SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel, majd ezt követő anti-gfp monoklonális antitesttel elvégzett Western blottal is ellenőriztük. A GST fúziós fehérjéket Glutation-agaróz gyantához kötöttük és affinitás kromatográfia segítségével tisztítottuk. Az így nyert fúziós fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelktroforézissel elválasztva, majd a géleket Coomassie-blue festékkel festve a legtöbb esetben egyetlen, határozott csíkot láttunk a fehérje GST-vel megnövelt molekulatömegének megfelelő mérettartományban. Ellenanyagok és reagensek Az anti-gfp monoklonális ellenanyagot a Cancer Research UK Hybridoma Development Unit-tól kaptuk. A 4G10 anti-foszfotirozin, valamint a 4F11 anti-cortactin monoklonális ellenanyagokat az Upstate Biotechnology-tól vásároltuk. Az anti-pak1, anticortactin és anti-erk poliklonális nyúl, valamint az anti-foszfo-erk, illetve az anti-ha monoklonális ellenanyagokat a Santa Cruz Biotechnology-tól, az anti-vav2 monoklonális ellenanyagot pedig a Babraham Bioscience Technologies-tól szereztük be. Az Alexa-Fluor 62

64 488-as és 568-as anti-egér másodlagos ellenanyagokat a Molecular Probes-tól vettük. A TRITC-el jelölt falloidint, az EGF-t, valamint a forbol mirisztát acetátot (PMA) a Sigma Aldrich-tól, a PI3-K inhibitor LY t, a MEK inhibitor PD98059-t és a PKC inhibitor biszindolilmaleimid I-t a Calbiochem-től, az Src-kináz családot gátló PP1-et a BIOMOL Research Laboratories-től, a ROCK inhibitor Y27632-t pedig a Tocris-tól szereztük be. A sejtvonalak transzfekciója során felhasznált Lipofectamine, valamint Lipofectamine 2000 a Life Technologies-től érkezett laborunkba. Sejtvonalak és stimulációjuk A munkánk során használt COS7 epithel, valamint HepG2 humán hepatoma sejtvonalakat 10%-os foetalis bovin szérumot, valamint penicillint (100 U/ml) és streptomycint (50 μg/ml) tartalmazó Dulbecco s modified Eagle s medium-ban (DMEM) tenyésztettük. A 80%-ig konfluens COS7 sejteket stimulációjuk előtt egy éjszakán át szérummentes DMEM tápoldatban tartottuk, majd 10 percig 50 ng/ml-es végkoncentrációjú EGF-fel kezeltük. A HepG2 sejteket 80 nm-os végkoncentrációjú PMA-val kezeltük, azokban a kísérletekben pedig, ahol gátlószereket is alkalmaztunk, azokat 60 perccel a stimuláció előtt adtuk a tápoldathoz, az LY t 20 μm-os, a biszindolilmaleimid I-t 500 nm-os, a PP1-t 20 μm-os, a PD t szintén 20 μm-os, az Y27632-t pedig 10 μm-os végkoncentrációban. Tranziens transzfekció A COS7 sejtek transzfekciójára Lipofectamine-t, a HepG2 sejtekére pedig Lipofectamine 2000-t használtunk, követve a használati útmutató leírását. Hatlyukú, 10 cm² alapterületű edényekre COS7 sejtekből 5x10 4 -t raktunk ki pontonként a transzfektálást megelőző napon. Az egyes DNS-konstrukciók 1-1 μg-jához 7-7 μl Lipofectamine-t raktunk μl Optimem-be és szobahőmérsékleten 45 percig állni hagytuk őket. Ezt követően a sejtekről a DMEM médiumot eltávolítottuk és helyére 1-1ml szérum- és antibiotikummentes Optimem tápoldatot mértünk, majd a sejtekre csepegtettük a DNS-Lipofectamine keveréket is. Öt óra elteltével az Optimemet szérumos DMEM-re, majd amennyiben a sejteket másnap stimulálni szerettük volna újabb öt óra múltán éjszakára szérumot nem tartalmazó DMEMre cseréltük. Emellett a fibronektinre történő sejtszétterülési kísérletek esetén 5x10 5 COS7 sejtet ültettünk ki 25 cm²-es petricsészékre a transzfekció előtti napon, majd másnap a 63

65 fentihez hasonló protokollt követve 2,5 μg DNS-t és 17 μl Lipofectamine-t használva végeztünk trnszfekciót, melynek végén a sejteket szintén szérummentes DMEM tápoldatban tartottuk a kísérletet megelőző éjszakán át. A HepG2 sejtek transzfekciója során 5x10 4 sejtet ültettünk ki 6-lyukú edényekre a transzfekció előtti napon, majd a transzfekció során 5 μg DNS-t és 17 μl Lipocectamine t használtunk és a sejteket 16 órán át tartottuk Optimem oldatban, majd további két napot szérumos DMEM-ben a kezelés előtt. Immunprecipitáció és Western-blot A COS7 és a HepG2 sejteket stimulációjukat követően jéghideg foszfát pufferral (PBS) mostuk, majd a növesztőedény területének megfelelően μl lízis puffer (50 mm Tris-HCl-pH 7,4, 100 mm NaCl, 1% Triton X-100, 20 mm NaF, 1 mm EGTA, 1 mm Na 3 VO 4, 1 mm p-nitrofenil-foszfát, 10mM benzamidin, 1 mm fenil-metil-szulfonil fluorid (PMSF), 25 μg/ml aprotinin, 25 μg/ml leupeptin, 25 μg/ml szója tripszin inhibitor) segítségével, az edény faláról sejtkaparóval eltávolítva, feltártuk. Az így nyert lizátumokat ezt követően /perc-es fordulatszámon 8 percig centrifugáltuk, majd protein G-, valamint protein A-Sepharose gyantához mért 5-5 μg antitest jelenlétében egy órán át 4 C-on forgatva immunprecipitáltuk. A gyantát ezt követően 0,5%-os Triton X-100-t tartalmazó foszfát pufferrel háromszor mostuk, majd a gyantához kötődő fehérjéket SDS-poliakrilamid gélelktroforézissel elválasztottuk és nitrocellulóz membránra történő blottolásuk után a megfelelő elsődleges és peroxidázzal konjugált másodlagos antitest segítségével, a kemilumineszcencia elvén működő eljárással (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) detektáltuk. PAK kináz assay A kináz assay során használt szubsztrát a H4 hiszton, valamint a GST-cortactin volt. Anti-PAK immunprecipitációt követően a gyantát a fent leírt összetételű lízis pufferral, majd foszforilációs pufferral (25 mmtris-hcl-ph 7,4, 10 mm MgCl 2, 0,5 mm EGTA) 4 C-on mostuk, majd 30 μl végtérfogatú reakcióelegyet hoztunk létre a foszforilációs pufferbe 5 μg H4 hisztont, vagy GST-cortactint, immunprecipitált PAK1-t és 100 μm 2μCi [γ- 32 P]-tal jelzett ATP-t mérve. A kináz reakciót az ATP hozzáadásával indítottuk. Fél órán át tartó 64

66 szobahőmérsékleten zajló inkubációt követően a reakciót 10 μl 4x-esen tömény SDSmintapuffer hozzáadásával állítottuk le. A minták fehérjéit ezt követően SDS-poliakrilamid gélelektroforézis segítségével elválasztottuk, majd a gél kiszárítása után az egyes csíkok foszforiláltságát 2-12 órán át végzett autoradiográfia segítségével detektáltuk. Immunfluoreszcencia A COS7, valamint a HepG2 sejteket 20x20mm-es üveglapokra növesztettük, majd transzfekciójukat, illetve stimulációjukat követően foszfát pufferral történő mosás után 4%-os paraformaldehid oldattal 15 percig fixáltuk. Ezt követően a sejteket 5 perces 0,2%-os Triton X-100 PBS kezeléssel permeabilizáltuk és az aspecifikus kötőhelyek lefedésére 1%-os BSA (bovin serum albumin)-pbs oldattal blokkoltuk, majd a megfelelő elsődleges ellenanyaggal 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Háromszori PBS-el történő mosást követően a sejteket az Alexa Fluor fluoreszcens másodlagos ellenanyagok valamelyikével, valamint az F- aktint láthatóvá tevő TRITC-falloidinnel 20 percig festettük, végül pedig négyszer 15 perces PBS-es mosás után a fedőlemezeket 10% Mowiol 4-88-t (Calbiochem), 25% glicerint és 2,5% 1,4-diazabicyclo-[2,2,2,] oktánt (DABCO, Sigma Aldrich) tartalmazó 100mM Tris-HClpH8,5 puffer felhasználásával a tárgylemezekhez rögzítettük. Az így elkészített minták kiértékelésére fluoreszcens (Nikon Eclipse E400) és konfokális mikroszkópot (Zeiss LSM 510) használtunk. COS7 sejtek szétterülése fibronektinnel bevont felszínen Hatlyukú edényekbe helyezett 20x20mm-es fedőlemezeket 24 órán át 1-1ml, 20 μg/ml koncentrációjú fibronektin-pbs oldattal 4 C-on inkubáltunk, majd PBS-sel történő mosást követően a szabadon maradt üvegfelszíneket 1%-os BSA-PBS oldattal egy órán át blokkoltuk és ismételt mosás után a fedőlemezek fölé 1-1ml adott DNS-konstrukcióval transzfektált, az előző éjszakán át szérummentes körülmények közt tartott, majd feltripszinezett, 2000 fordulat/perccel centrifugában ülepített, 0,3 mg/ml szója tripszin inhibitorral felszuszpendált és végezetül 1 órán át 0,5%-os BSA-DMEM tápoldatban tartott COS7 sejtet mértünk. Tíz perc után a sejteket 37 C-os foszfát pufferral mostuk, majd az immunfluoreszcenciánál ismertetett módon fixáltuk és TRITC-falloidinnel festettük. A sejteket ezt követően fluoreszcens mikroszkóp segítségével két csoportba osztottuk, a szétterült és a nem szétterült 65

67 sejtek csoportjába és ezek egymáshoz viszonyított arányát kísérletenként sejt leszámolásával határoztuk meg, eredményeinket pedig 3-3 független kísérlet értékeinek átlagolásával nyerük A cortactin transzlokációjának vizsgálata A cortactin sejtszélhez történő transzlokációját anti-cortactin antitesttel történő immunfestés, majd ezt követő fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat segítségével határoztuk meg. Ötvenezer HepG2 sejtet ültettünk le fedőlemezekre, majd elkerülendő, hogy a sejtek a rájuk jellemző telepeket létrehozva lehetetlenné tegyék egyedi vizsgálatukat, 24 órával a kiültetésük után a sejteket 80 nm PMA-val 15 percig kezeltük, vagy kezeletlenül hagytuk (kontroll), majd a sejtek fixálása után anti-cortactin fluoreszcens festést végeztünk. Minden mintából minden kísérlet esetén sejtet megvizsgálva határoztuk meg a cortactin transzlokációt mutató sejtek arányát. A cortactin transzlokációjának sejttelepek esetén történő bemutatásához a PMA kezelést a kiültetés után órával végeztük el. A sejtek [ 33 P] ortofoszfáttal történő jelölése Tíz cm átmérőjű petricsészére 10 6 COS7 sejtet ültettünk ki, majd a sejteket GFP- Vav2-vel, vagy konstitutívan aktív PAK-T423E-vel, 7 μg DNS-t és 50 μl Lipofectamine-t használva a fentebb ismertetett módon transzfektáltuk. A transzfekciót követően a sejteket foszfátmentes DMEM (Sigma Aldrich) médiummal mostuk, majd éjszakára is e médiumban hagytuk, 0,2 mci [ 33 P]ortofoszfát jelenlétében. Másnap a sejteket 50 ng/ml EGF-fel kezeltük, vagy kontrollnak hagytuk, és a fent ismertetésre került módon feltártuk, majd anti-pak, illetve anti-cortactin immunprecipitációt, illetve SDS-poliakrilamid gélelektroforézist követően a gélt kiszárítottuk és autoradiografáltuk. RNS interferencia A cortactin kiütéséhez használt sirns szekvenciákat in vitro, T7 RNS polimeráz segítségével állítottuk elő a gyártó által mellékelt instrukciók alapján (Silencer sirna construction kit, Ambion). A fenti metodika beállítását Enyedi Balázs TDK-hallgatónk végezte. A 6-lyukú edényre ültetett COS7 sejteket 60, illetve 240 ng sirns-sel, 66

68 Oligofectamine segítségével transzfektáltuk a gyártó utasításait követve (Invitrogen). A sejtek vizsgálatát 48 órával a transzfekció után végeztük. A vektor alapú cortactin kiütéshez az sirns-nek megfelelő szekvenciát DNS oligonukleotid formájában rendeltük meg, a megrendelt komplementer oligonukleotidokat a gyári leírásoknak megfelelően egymással hibridizáltattuk (95 C-on 10 percig tartottuk, majd egy órán át szobahőmérsékleten hibridizálódni hagytuk), majd BamH I és Afl II restrikciós endonukleázzal emésztettük, és szintén emésztett prnat-cmv3.1/neo plazmidba ligáltuk (GenScript Corporation). Az így előállított konstrukcióval 6 cm átmérőjű petricsészékre ültetett sejteket transzfektáltunk 17,5 μl Lipofectamine-t, valamint 2,5 μg DNS-t felhasználva a COS7 sejtek tranziens transzfekciójánál ismertetett eljárás szerint. Öt órán át tartó transzfekciót követően a sejteket szérumot tartalmazó médiumon növesztettük, majd 48 órával a transzfekció után vizsgáltuk. Az sirns-t expresszáló sejteket zölt fluoreszcenciájuk alapján azonosítottuk. 67

69 Eredmények Tekintve, hogy az általunk elvégzett kísérletek három jól elkülönthető kísérletsorozatba oszthatók, eredményeinket is ennek megfelelően három alfejezetben tárgyalom. A cortactin foszforilációjának szerepe a fehérje transzlokációjában, valamint az aktin polimerizáció szabályozásában Az EGF kezelés, vagy a Vav2 overexpressziója COS7 sejtekben a cortactin transzlokációjához vezet Az irodalmi adatokból ismert, hogy a különféle növekedési faktorokkal végzett kezelés számos sejtvonalban a cortactin sejtmembránhoz történő transzlokációját eredményezi (165,168,174,221). Első lépésként arra voltunk tehát kíváncsiak, hogy az általunk használt rendszerben, COS7 sejtek esetén, a rövid távú EGF kezelés szintén a cortactin membránlokalizációjához vezet-e. Ennek eldöntésére sejtjeinket 10 percig EGF-el stimuláltuk, majd fixálásukat követően anti-cortactin monoklonális ellenanyaggal immunfestettük, és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. Ahogyan az a 13. ábrán látható, a cortactin nyugvó sejtekben diffúz citoplazmatikus eloszlást mutat (a), míg az EGF kezelést követően a fehérje jelentős része a sejtek perifériájára transzlokálódik, sőt, a sejtek alakja is megváltozik: a nyugalmi állapotban megfigyelhető nyúlványos forma helyett lekerekedett morfológia jelenik meg (b). Megállapíthatjuk tehát, hogy az általunk alkalmazott növekedési faktor, valamint sejtvonal esetén hasonlóan a mások által kapott eredményekhez a kezelés következtében a cortactin szintén a sejtek perifériájára, a sejtmembrán közelébe transzlokálódik. A korábbi megfigyelések szerint a cortactin növekedési faktorok általi transzlokációja valamilyen módon a Rac GTPáz fehérje közreműködését igényli (165,221). Annak vizsgálatára, hogy az általunk választott rendszerben az EGF-receptortól kiinduló jel vajon a fentiekhez hasonlóan legalább részben a Rac-on át vezet-e a cortactinhoz, a COS7 sejteket a Rac aktivációjáért felelős kicserélődési faktorral, a GFP-Vav2-vel transzfektáltuk és anti-cortactin immunfestést követően fluoreszcens mikroszkópia segítségével vizsgáltuk. Az 13. ábra c és d részén látható, hogy a GFP-Vav2-t expresszáló, így zölden világító sejtekben (c) a cortactin hasonlóan az EGF kezelésnél látottakhoz kezelés nélkül is a sejt perifériájára transzlokálódik, sőt, a sejtek 68

70 13. ábra: Az EGF kezelés, illetve a Vav2 overexpressziója COS7 sejtekben a cortactin transzlokációját eredményezi. Az ábra a és b részén nem transzfektált, míg a c és d részén GFP-Vav2- vel tranziensen transzfektált COS7 sejtek láthatók. Az éjszakán át szérummentes körülmények közt tartott sejteket 10 percig EGF-fel kezeltük (b), vagy pedig kezeletlenül hagytuk (a). A cortactint a sejtek paraformaldehides fixációját követően immunfestéssel tettük láthatóvá (a, b és d), melyhez elsődleges ellenanyagként anti-cortactin monoklonális antitestet, másodlagos ellenanyagként pedig vörös színtartományban emittáló Alexa Fluor 568-as anti-egér antitestet használtunk. A GFP-Vav2-t expresszáló sejteket a GFP-fluoreszcenciája segítségével azonosítottuk (c). alakja is az EGF kezelésnél látott lekerekedett morfológiát mutatja (d), míg a GFP fehérje expresszója önmagában nem okoz cortactin transzlokációt (ábrán nem szereplő eredmény). Feltehető tehát, hogy az EGF-receptorról kiinduló, a cortactin transzlokációjához vezető jelpályában a Rac-nak is fontos, mint később látni fogjuk, nélkülözhetetlen szerepe van. A cortactin tirozin foszforilációja nem szükséges annak membrántranszlokációjához, valamint a sejtszéli aktin polimerizációhoz A cortactint ahogyan az az elméleti áttekintésből is kiderült eredetileg az Src tirozin kináz szubsztrátjaként azonosították onkogén v-src-t expresszáló csirke embrió 69

71 fibroblasztokban (120). Ezt követően fiziológiás és pathológiás stimulusok széles skálája vált ismertté, ami a cortactin tirozin foszforilációjához vezethet a különböző növekedési faktor kezelésektől (155,156), az integrineken keresztül zajló sejtadhézión át (151), egyes intracelluláris kórokozók inváziójáig (145). Kiderült az is, hogy a cortactin foszforilációjában az Src tirozin kinázon kívül más nemreceptor tirozin kinázoknak, például a Fyn-nek, vagy a Fer-nek is szerepe lehet ( ). Fény derült arra is, hogy a főbb foszforilációs helyek a fehérje 421-es, 466-os és 482-es tirozinjai (164), és hogy e tirozinok foszforilációja időben meghatározott sorrendben történik (165). Az eredeti elképzelésektől eltérően azonban a ma leginkább elfogadott feltételezések szerint a cortactin tirozin foszforilációja nem elengedhetetlen a fehérje transzlokációjához, jóval valószínűbb, hogy inkább a cortactin Arp2/3 komplexről és F aktinról történő leválását eredményezi, a sejtmozgás során szükséges folyamatos aktin citoszkeleton átrendeződést biztosítva (169). Megvizsgálandó a cortactin esetleges tirozin foszforilációját az általunk alkalmazott rendszerben, COS7 sejteket 18 órán át szérummentes körülmények közt tartottunk, majd 10 percig EGF-fel stimuláltunk, vagy kezeletlenül hagytunk. A sejtek feltárását követően a cortactint a sejtkivonatokból anticortactin monoklonális ellenanyaggal immunprecipitáltuk, és SDS-poliakrilamid gélelektroforézist, valamint nitrocellulóz membránra történő átblottolást követően foszforilációjának mértékét 4G10 anti-foszfotirozin monoklonális ellenanyaggal vizsgáltuk. Amint az a 14. ábra a. részén is látható, az általunk tanulmányozott COS7 sejtekben kismértékű cortactin tirozin foszforiláció sem volt detektálható a rövid ideig tartó EGF kezelés hatására. Valószínű tehát, hogy COS7 sejtekben a cortactin aktivációjához és transzlokációjához nem szükséges annak tirozin foszforilációja. Annak kizárására, hogy a tirozin foszforiláció kimutatásának elmaradása technikai hiba eredménye lenne, kontrollként megvizsgáltuk az EGF receptor ismert szubsztrátjának, a Vav2-nek (196) tirozin foszforilációját is. Hasonlóan az előbb ismertetettekhez, 10 perces EGF kezelést követően anti-vav2 immunprecipitációt végeztünk, majd anti-foszfotirozin Western-blottal vizsgáltuk a Vav2 foszforiláltságát. Ahogyan a 14. ábra b. részén is látható, a 10 perces EGF kezelés a Vav2 jelentős tirozin foszforilációjához vezetett, sőt, egy a Vav2-vel koimmunprecipitálódó 180kDa-os foszforilált fehérje is megfigyelhetővé vált, melyről munkacsoportunk korábbi kísérleteiből ismert, hogy az autofoszforilált EGF-receptor (196). Bizonyítandó, hogy az általunk alkalmazott eljárások kellően érzékenyek a cortactin tirozin foszforilációjának vizsgálatához, COS7 sejtjeinket konstitutívan aktív v-src-vel transzfektáltuk, majd a cortactin foszforilációját anti-cortactin immunprecipitációt követően anti-foszfotirozin Western-blottal vizsgáltuk. 70

72 14. ábra: A rövid ideig tartó EGF kezelés nem eredményezi a cortactin tirozin foszforilációját. Szérummentes körülmények közt tartott COS7 sejteket EGF-fel kezeltünk, vagy kezeletlenül hagytunk. A sejtkivonatokat anti-cortactin (a), vagy anti-vav2 (b) ellenanyaggal immunprecipitáltuk, majd az immunprecipitált fehérjéket 7,5%-os SDS-poliakrilamid gélen megfuttattuk és nitrocellulózra történt átblottolás után anti-foszfotirozin ellenanyaggal Western-blotot végeztünk. A vizsgát fehérjék egy-egy kísérleten belüli azonos mennyiségének igazolására a nitrocellulóz membránokat anticortactin, illetve anti-vav2 ellenanyaggal újrablottoltuk. A kísérlet során négy, 10 cm átmérőjű petricsészét (1-1 millió sejtet kiültetve) használtunk, melyből kettőt v-src-vel tranziensen transzfektáltunk. A transzfekciót követően mind a négy petricsésze sejtjeit egy éjszakán át szérummentes médiumban tartottuk, majd másnap az egyik nem transzfektált edényt EGF-fel 10 percig kezeltük, míg a másik három petricsésze sejtjeit kezeletlenül hagytuk. Ezt követően mind a négy minta sejtjeit feltártuk, majd anti-cortactin immunprecipitációt követően a fentebb elmondottakhoz hasonlóan anti-foszfotirozin Westernblotot végeztünk. Amint a 15. ábrán is látható, a cortactin foszforilációja sem a nyugvó, sem pedig az EGF-fel kezelt sejtekben nem figyelhető meg, míg a v-src-t expresszáló sejtekben erőteljes cortactin tirozin foszforiláció észlelhető. A kísérlet során az immunprecipitált fehérjéket μl SDS-mintapufferrel eluáltuk a protein G-Sepharose gyöngyökről, ám az egyik transzfektált pont esetén nem az összes, 40μl mintát vittük fel az SDS-poliakrilamid 71

73 gélre, hanem 4, 10, illetve 20 μl-t, tehát az összes immunprecipitátum 10, 25, valamint 50%- át, így lehetővé vált annak megállapítása, hogy milyen érzékenységgel tudjuk a cortactin foszforilációját detektálni. Figyelembe véve, hogy a COS7 sejtek Lipofectamine-nal történő transzfekciójának hatásfoka 30-40% körüli, a 4 μl-es ponttal képesek voltunk az összes cortactin maximum 3-4%-ának foszforilációját is detektálni. Valószínűsíthető tehát, hogy az EGF kezelés hatására, ha egyáltalán történik tirozin foszforiláció, az a cortactinnak csak maximum 1-2%-át érintheti. 15. ábra: Az Src kináz in vivo foszforilálja a cortactint. Négy petricsészéből (1-1 millió sejt) kettőt v- Src-vel tranziensen transzfektáltunk, majd a sejteket szérummentes körülmények közt tartottuk, másnap reggel pedig az egyik edény sejtjeit EGF-fel 10 percig kezeltük. Ezt követően a sejteket feltártuk, majd anti-cortactin ellenanyaggal immunprecipitációt végeztünk. A protein G-Sepharose gyantáról az immunprecipitált fehérjéket μl SDS-mintapufferral eluáltuk, majd a mintákat SDSpoliakrilamid gél zsebeibe töltöttük oly módon, hogy az Src-vel transzfektált pontok egyikéből mindössze 4, 10, valamint 20 μl mintát vittünk fel. A gélelektroforézist követően anti-foszfotirozin Western-blotot végeztünk. Az immunprecipitátumban jelenlévő cortactin mennyiségének pontonkénti összevetésére a membránt anti-cortactin ellenanyaggal újrablottoltuk (alsó panel). Érdemes megemlíteni, hogy a v-src-t expresszáló sejtekben a cortactin membránszéli transzlokációját nem lehetett megfigyelni, noha a cortactin mint láttuk e körülmények között erőteljesen foszforilálódott. Ezen eredmény is arra utal, hogy a cortactin tirozin foszforilációja önmagában nem elégséges a cortactin transzlokációjához. 72

74 16. ábra: A foszforilációs mutáns cortactin EGF kezelést követően a sejtmembránhoz transzlokálódik. COS7 sejteket myc-cimkével jelölt vad típusú cortactinnal (a, b), illetve szintén myc-jelzett foszforilációs mutánssal (c, d) transzfektáltunk, majd a szérummentes körülmények közt tartott sejteket EGF-fel 10 percig kezeltük (b, d), vagy kezeletlenül hagytuk (a, c). A kezelést követően a sejteket formaldehiddel fixáltuk, permeabilizáltuk, és anti-myc antitesttel festettük. Másodlagos ellenanyagként Alexa Fluor 568 nyúl anti-egér antitestet használtunk. Amint már említettem, az irodalmi adatokból jól ismert, hogy a cortactin fő tirozin foszforilációs helyei a 421-es, a 466-os és a 482-es tirozin (164,165). Annak vizsgálatára, hogy e foszforilációs helyek bármelyike szükséges-e a cortactin transzlokációjához a COS7 sejteket myc-taggal jelölt vad típusú, illetve olyan, szintén myc-cimkével jelölt, mutáns cortactinnal transzfektáltuk, melyben a három fő foszforilálódó tirozin fenilalaninnal volt helyettesítve. A tranziens transzfekciót követően a szérummentes körülmények közt tartott sejteket 10 percig EGF-fel kezeltük (16. ábra, b, d), vagy kezeletlenül hagytuk (a, c). Ahogyan az a 16. ábrán is megfigyelhető, az EGF kezelést követően a foszforilációs mutáns cortactin is képes a sejtszélre transzlokálódni (d), hasonlóan a vad típusú cortactinnál látottakhoz (b). Ezen eredmény szintén azt a meggyőződést erősíti, hogy a cortactin tirozin foszforilációja nem szükséges a fehérje sejtmembránhoz történő kihelyeződéséhez. 73

75 A cortactin Erk általi szerin/treonin foszforilációja nem szükséges a fehérje transzlokációjához Mindamellett, hogy a cortactin számos tirozin kináz szubsztrátja lehet, több munkacsoport eredményei is arra mutatnak, hogy egyes Ser/Thr kinázok is képesek foszforilálására (59, ). Martinez-Quiles és munkatársainak a közelmúltban sikerült kimutatnia, hogy az Erk által a 405-ös és 418-as szerinen foszforilált cortactin in vitro képes fokozni az N-WASP Arp2/3-t aktiváló képességét, és ezáltal a sejtszéli elágazódó aktin polimerizációt (59), nem vizsgálták azonban, hogy a fehérje Erk általi foszforilációja in vivo befolyásolja-e a cortactin hatását az aktin polimerizációra. Megvizsgáltuk tehát, hogy az általunk használt rendszerben a cortactin aktiválódásában és sejtszélre helyeződésében van-e szerepe a fehérje Erk általi foszforilációjának. Sejtjeinket az EGF kezelés előtt egy órán át tartó, 20 μm-os PD98059 előkezelésnek tettük ki, mely MEK inhibitorral az Erk aktiválódása is kivédhető. A gátlószeres előkezelést, valamint a 10 perces EGF stimulust követően a sejteket a szokásos módon fixáltuk, permeabilizáltuk, majd anti-cortactin monoklonális ellenanyaggal, illetve az aktin hálózatot láthatóvá tevő TRITC-falloidinnel immunfestettük. A 17. ábrán jól megfigyelhető, hogy a kontroll, EGF-fel nem kezelt sejtek diffúz citoplazmatikus cortactin eloszlásával szemben (a) az EGF-fel kezelt sejtek esetén a cortactin jelentős része a sejtszélre transzlokálódott (b), és sejtmembránhoz történő kihelyeződését a MEK inhibitor PD98059 előkezelés nem volt képes kivédeni (c). A d-f ábrák alapján az is jól látható, hogy az Erk kináz gátlása az EGF kezelés hatására bekövetkező sejtszéli aktin polimerizációt és membránfodrozódást sem képes kivédeni. Annak ellenőrzésére, hogy a PD98059 valóban gátolja az Erk aktivitását 3 tenyésztőedény szérummentes körülmények közt tartott COS7 sejt egyikét 1 órás PD98059 előkezelést követően, egy másikát pedig közvetlenül a szérummentes körülmények után 10 percig EGF-fel kezeltük, a harmadik petricsésze sejtjeit pedig kezeletlenül hagytuk. Ezután a sejteket feltártuk és a sejtkivonatokat anti-foszfo-erk immunoblotnak vetettük alá. Jól látható, hogy amíg az EGF kezelés fokozza az Erk autofoszforilációját, addig a PD98059 előkezelés az EGF növekedési faktorral végzett kezelés hatását gyakorlatilag teljesen kivédve, az Erk foszforilációjának mértékét a kontroll értékre szorítja vissza (17. ábra, g panel). A fentiek ismeretében megállapítható, hogy noha a PD98059 előkezelés az Erk működését gátolja, a cortactin transzlokációját és az aktin polimerizációt nem képes kivédeni. Úgy tűnik tehát, hogy az általunk használt sejtes rendszerben a cortactin aktivációjában az Erk kináznak nincs szerepe. 74

76 17. ábra: Az Erk kináz gátlása nem képes kivédeni a cortactin transzlokációját. A COS7 sejteket szérummentes körülmények közt tartottuk, majd EGF-fel kezeltük (b, c, e és f), vagy kezeletlenül hagytuk (a, d). A c és az f pont esetén egy órás, 20 μm-os PD98059 előkezelést is végeztünk. A fixált és permeabilizált sejteket anti-cortactin elsődleges, illetve Alexa Fluor 568 nyúl anti-egér másodlagos ellenanyaggal (a-c), vagy TRITC-falloidinnel (d-f) immunfestettük és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. Az ábra g részén látható kísérletben a sejteket éjszakán át szérummentes médiumban tartottuk, majd EGF-fel 10 percig kezeltük, vagy kezeletlenül hagytuk. A stimuláció előtt az egyik pontot PD98059-cel egy órán át előkezeltük. A sejtek feltárása után anti-foszfo-erk immunoblotot végeztünk. Az Erk pontonként azonos mennyiségét a nitrocellulóz membrán anti-erk antitesttel elvégzett Western-blotjával igazoltuk. 75

77 A PAK nem foszforilálja a cortactint A legújabb megfigyelések szerint a cortactin működését a Rac és Cdc42 GTPázok által aktivált PAK1 szerin/treonin kináz is befolyásolhatja. Vidal és munkatársai azt találták hogy a cortactin és a PAK1 asszociálódott nyugalmi állapotban lévő vérlemezkék kivonatában, és e kapcsolatot a trombin kezelés felfüggesztette. Arra az eredményre jutottak továbbá, hogy in vitro kísérletekben a PAK1 képes volt a cortactin foszforilálására (171). A fentiek megerősítésére, vagy kizárására első lépésként elkészítettünk egy konstitutívan aktív PAK1 mutáns konstrukciót, melyben az aktivátor-hurokban elhelyezkedő foszfo-akceptor 423-as treonint glutamátra cseréltük, mely aminosav oldalláncának COO - csoportja a negatív töltésű foszfát csoportot utánozza (másik autofoszforilációs helyét, a 144- es treonint érintetlenül hagytuk). A PAK1 T423E mutánst a vad típusú DNS felhasználásával Quick-change mutagenezis segítségével állítottuk elő, majd aktivitását in vitro kináz assay segítségével ellenőriztük. Ehhez COS7 sejteket HA-cimkével jelölt vad típusú PAK1-gyel, a konstitutívan aktív, szintén HA-val jelzett PAK1 T423E-vel, illetve kontrollnak üres vektorral tranziensen transzfektáltunk. Az éjszakán át szérummentes körülmények közt tartott sejteket feltártuk, és sejtkivonataikból az expresszált PAK1 konstrukciókat, illetve az endogén PAK1-t anti-pak1 poliklonális nyúl ellenanyag segítségével immunprecipitáltuk. A PAK1 immunkomplexek aktivitását in vitro kináz aktivitás mérés segítségével ellenőriztük, a mintákhoz [γ- 32 P]-tal jelzett ATP-t, valamint szubsztrátnak H4 hisztont adva. Fél órán át tartó szobahőmérsékleten, rázógépen zajló inkubációt követően a reakciót SDS-mintapuffer hozzáadásával leállítottuk, majd 15%-os SDS-poliakrilamid gélelektroforézist és a gél kiszárítását követően autoradiográfiát végeztünk. Amint az a 18. ábra a-val jelölt részén is látható, az üres vektort expresszáló így a szérummentes körülmények közt tartott COS7 sejtek endogén PAK aktivitását mutató minta esetén a H4 hiszton foszforilációja gyakorlatilag kimutathatatlan volt, de a vad típusú PAK1 overexpressziója is csak mérsékelt H4 hiszton foszforilációt eredményezett. Ezzel szemben a PAK1 T423E kifejezése a H4 hiszton foszforilációjának erőteljes fokozódásához vezetett, sőt, a konstitutívan aktív PAK1 autofoszforilációjának mértéke is jelentősen emelkedett. Megállapítható tehát, hogy a PAK1 T423E mutáns valóban jelentősen fokozott kináz aktivitással bír. Mivel a Vidal és munkatársai által elvégzett kísérletek csupán a cortactin in vitro PAK1 általi foszforilációjáról szóltak, első lépésben kíváncsiak voltunk rá, hogy a vad típusú fehérjéhez képest erőteljes aktivitást mutató konstitutívan aktív PAK1 mutánst a COS7 sejtekben kifejezve, az képes-e a sejteken belül, in vivo a cortactin foszforilálására. A fenti 76

78 18. ábra: A PAK nem foszforilálja a cortactint in vivo. (a): COS7 sejteket tranziensen transzfektáltunk üres vektorral, vad típusú PAK-kal, illetve konstitutívan aktív PAK T423E mutánssal. A szérummentes körülmények közt tartott sejtek kivonatát anti-pak1 poliklonális ellenanyaggal immunprecipitáltuk, majd az immunprecipitátumok PAK aktivitását H4 hiszton, valamint [γ- 32 P]-tal jelzett ATP segítségével, in vitro kináz assay -ben határoztuk meg. Az inkubálás után a minták fehérjéit 15%-os SDS-poliakrilamid gélen választottuk szét és a kiszárított gélt autoradiografáltuk. A vad típusú és a mutáns Pak expressziójának azonos mértékét anti-ha immunoblottal igazoltuk. (b): COS7 sejteket üres vektorral, Vav2-vel, illetve PAK1 T423E-vel tranziensen transzfektáltunk. A sejteket a transzfekciót követően foszfátmentes médiummal mostuk, majd egy éjszakán át a foszfátmentes médiumhoz adott 0,2 mci [ 33 P]ortofoszfáttal metabolikusan jelöltük. A sejteket másnap 50 ng/ml EGF-fel stimuláltuk, vagy kezeletlenül hagytuk, és kivonatukat anti-cortactin, illetve anti- PAK1 ellenanyaggal immunprecipitáltuk. Az immunprecipitált fehérjéket 7,5%-os SDS-poliakrilamid gélen megfuttattuk, a gélt kiszárítottuk és autoradiográfiával vizsgáltuk. kérdés eldöntésére 10 cm átmérőjű petricsészékre 1-1 millió COS7 sejtet ültettünk ki, majd a sejteket GFP-Vav2-vel, konstitutívan aktív PAK1-T423E-vel, illetve üres vektorral transzfektáltuk. A transzfekciót követően a sejteket foszfátmentes DMEM médiumban, 0,2 mci [ 33 P]ortofoszfát jelenlétében metabolikusan jelöltük, másnap 10 percig EGF-fel kezeltük, vagy kezeletlenül hagytuk, majd kivonatukból a cortactin, illetve a PAK fehérjéket immunprecipitáltuk. Az immunkomplexekben megjelenő jelölt fehérjéket autoradiográfia segítségével azonosítottuk. A 18. ábra b. részéből kitűnik, hogy a cortactinnak megfelelő 77

79 19.ábra: A PAK nem foszforilálja a cortactint in vitro. A COS7 sejteket üres plazmiddal, illetve PAK1 T423E-vel transzfektáltuk, majd feltárásukat követően anti-pak1 antitesttel immunprecipitációt végeztünk. A cortactin PAK-általi foszforilációját az immunprecipitált PAK1 T423E-hez adott GST-cortactinnal és [γ- 32 P]-tal jelzett ATP-vel vizsgáltuk. Az inkubációt követően a fehérjéket 7,5%-os SDS-poliakrilamid gélen szétválasztottuk és Coomassie-blue festéssel, valamint 32 P autoradiográfia segítségével vizsgáltuk. mindkét csík (p80 és p85; valószínűleg a teljes hosszúságú cortactin, illetve annak SV1 alternatív splice variánsa) erőteljes bazális foszforilációval bír. Mivel az anti-foszfotirozin immunoblott a két csíkot nem ismeri fel, valószínű, hogy e bazális foszforilációért a fehérje szerin/treonin oldalláncainak foszforilációja felelős. E megfigyelés nem egyedi, Campbell és munkatársai szintén leírják a cortactin intenzív bazális foszforilációját, bár ők azt csupán a p85-ös forma esetén tapasztalták (170). Az ábrából az is kiderül, hogy a PAK T423E in vivo igen kifejezett aktivitással bír, ennek megfelelően jelentősen autofoszforilálódik is. Mindezek ellenére a cortactin foszforilációjában semmilyen mértékű fokozódást sem lehet megfigyelni az aktív PAK-ot expresszáló sejtekben a kontroll sejtekhez képest, valószínűsíthető tehát, hogy a PAK-nak in vivo a cortactin nem szubsztrátja. A fentieken túl jól látható az is, hogy a cortactin transzlokációját előidéző EGF kezelés, illetve Vav2 overexpresszió a fehérje foszforilációját nem fokozza, amellett tehát, hogy mint láttuk nem vezetnek a cortactin tirozin foszforilációjához, nem növelik annak szerin/treonin foszforilációját sem, sem a PAKon át, sem más kinázokon keresztül. 78

80 Mivel sikerült kizárnunk annak a lehetőségét, hogy a cortactin a PAK1 szubsztrátja lenne in vivo, megvizsgáltuk, hogy a Vidal és munkatársai által kapott in vitro eredmények reprodukálhatóak-e. Ennek eldöntésére a COS7 sejteket a konstitutívan aktív PAK1 T423Evel transzfektáltuk, majd a kifejeződő PAK mutánst anti-pak1 ellenanyaggal immunprecipitáltuk. Az ily módon tisztított enzimhez [γ- 32 P]-tal jelzett ATP-t, valamint rekombináns, E. coli baktériumokban termelt és affinitás kromatográfiával tisztított GSTcortactint adtunk, majd in vitro kináz aktivitás mérés segítségével, a fent említettek szerint vizsgáltuk a cortactin foszforilációjának mértékét. Ahogyan az a 19. ábrán is látható, a konstitutívan aktív PAK1 nem képes a GST-cortactin foszforilálására, noha olyan koncentrációban van jelen, hogy az SDS-poliakrilamid gél Coomassie-blue-val történő fesésével is megjeleníthető, és olyan aktív, hogy amint az a 32 P autoradiográfián megfigyelhető erőteljes autofoszforilációt mutat. Megállapíthatjuk tehát, hogy az általunk elvégzett kísérletek eredményei alapján a cortactin foszforilációjában a PAK1-nek szerepe sem in vivo, sem pedig in vitro nincsen, a cortactin nem szubsztrátja a PAK1-nek. A cortactin transzlokációja COS7 sejtekben Rac-dependens folyamat Számos irodalmi adat utal rá, hogy a cortactin sejtszélre történő kihelyeződése valamilyen módon Rac-függő folyamat (165,174,177,221), noha a Rac és a cortactin közti pontos kapcsolat egyelőre meglehetősen homályos. Azért, hogy a Rac szerepét igazoljuk az általunk használt rendszerben, sejtjeinket a PAK1 CRIB doménjének GFP fúziós konstrukciójával transzfektáltuk. Mivel a CRIB domén képes megkötni a GTP-t kötő aktív Rac-ot, ezért alkalmas a fent említett GTPáz szekvesztrálására, így hatásainak kivédésére úgy in vitro, mint in vivo (222). A transzfekciót követően a sejteket 12 órán át szérummentes körülmények közt tartottuk, majd EGF-fel 10 percig stimuláltuk (20.ábra b-d), illetve kezeletlenül hagytuk (20.ábra a). A kezelést követően a sejteket a szokásos módon fixáltuk, permeabilizáltuk, majd anti-cortactin monoklonális ellenanyaggal immunfestettük. Ahogyan a 20. ábra a és b részén megfigyelhető, a CRIB domént nem expresszáló sejtekben a cortactin a korábban leírtakhoz hasonlóan az EGF kezelés hatására a sejtek perifériájára transzlokálódott (b), míg a nem kezelt sejtekben a citoplazmában, diffúzan helyezkedett el. Ezzel szemben a GFP-CRIB domént expresszáló sejtekben (c,d) az EGF kezelés nem vezetett a cortactin sejtszélre történő kihelyeződéséhez (c), az megtartotta diffúz citoplazmai lokalizációját. A fentiekhez hasonlóan a CRIB domén expressziója képes kivédeni a Vav2 79

81 overexpressziója által kiváltott cortactin-membrántranszlokációt is. Egyértelműnek tűnik tehát, hogy a Rac-nak a cortactin sejtmembránhoz történő kihelyeződésében a COS7 sejtek esetén elengedhetetlen szerepe van. 20. ábra: A cortactin transzlokációja Rac-dependens folyamat. A COS7 sejteket nem transzfektáltuk (a és b), vagy a PAK1 CRIB doménjének GFP konstrukciójával tranziensen transzfektáltuk (c és d). A szérummentes körülmények közt tartott sejteket 50 ng/ml EGF-fel 10 percig kezeltük (b-d), vagy kezeletlenül hagytuk (a). A kezelést követően a sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, majd a cortactin láthatóvá tételére anti-cortactin monoklonális elsődleges és a vörös színtartományban emittáló Alexa Fluor 568 nyúl anti-egér másodlagos ellenanyaggal immunfestettük (a-c). A CRIB domént expressziáló sejteket a GFP jelölés zöld fluoreszcenciája segítségével azonosítottuk (d). A cortactin szerepe az integrin jelpályában A COS7 sejtek szétterülése fibronektinnel bevont felszínen Rac-függő folyamat Azért, hogy a cortactin, illetve a Rac szerepét dinamikus folyamatokban is vizsgálni tudjuk, ne csupán a cortactin transzlokációját tanulmányozhassuk, egy másik módszerhez folyamodtunk, az integrin jelpálya aktiválódásához vezető fibronektines sejtszétterülési assay -hez. Ezen eljárás során fibronektinnel bevont felszínre előzőleg feltripszinezett 80

82 sejteket pipettázunk, majd adott idő után vizsgáljuk a szétterült sejtek arányát az összes sejthez képest. Ha a sejtekben különféle fehérjéket, illetve fehérje doméneket expresszálunk, majd összehasonlítjuk a szétterült sejtek arányát a konstrukciót nem expresszáló sejtek esetén kapott aránnyal, akkor megállapítható, hogy egy adott konstrukció kifejt-e bármilyen gátló, esetleg aktiváló hatást az integrin jelpályára, illetve a kortikális elágazódásképződéssel járó aktin polimerizációra, így a sejtek lamellipodiumképződésére (hiszen a szétterülés tulajdonképpen a sejtszéli aktin polimerizációt, majd a membrán kitüremkedését igényli). Price és munkatársainak 1998-ban publikált eredményei alapján ismert, hogy a RhoGTPázok, és főként a Cdc42, valamint a Rac, a sejtek integrin mediált szétterülése során aktiválódnak, gátlásuk pedig a sejtszétterülés gátlója is (203). Annak vizsgálatára, hogy az általunk alkalmazott COS7 sejtek esetén a fenti eredmények reprodukálhatóak, sejtjeinket a PAK kináz aktív Rac-ot szekvesztrálni képes CRIB doménjének GFP-vel jelölt konstrukciójával transzfektáltuk. A transzfekciót követő napon sejtjeinket tripszinnel a korábbi felszínükről felszedtük, és 0,5%-os BSA-DMEM tápoldatban egy órán át tartó regenerációjukat követően, mely idő alatt a tripszinnel elemésztett sejtfelszíni struktúrák, így az integrinek is, helyreállítódnak, előzőleg fibronektinnel bevont üveglap felszínre ültettük. Tíz percig tartó, 37 C-on zajló inkubációt követően a sejteket foszfát pufferral megmostuk, majd a szokásos módon fixáltuk, permeabilizáltuk és a konstrukciókat nem expresszáló, így GFP-fluoreszcenciát nem mutató sejtek láthatóvá tétele érdekében az F aktinhoz kötődő, így az aktin citoszkeletont festő, TRITC-cel jelölt falloidinnel festettük. Amint az a 21. ábra c. részén is megfigyelhető, a GFP-CRIB domén igen jelentősen, mintegy a negyedére, csökkentette az őt expresszáló szétterült sejtek arányát a kontroll, nem expresszáló sejtek hasonló arányához képest. Ez a 76±3,1%-os gátlás igen jelentős inhibíciónak számít (még akkor is, ha figyelembe vesszük, hogy a GFP-C2 plazmid önmagában is képes a sejtszétterülés kismértékű 7,7±4,2%-os gátlására), hisz általában a hozzávetőlegesen 30%-os gátlást, e metodika során, még kifejezett hatásként fogadják el (203). A 21. ábra a. és b. részén a fentieket jól szemléltető fluoreszcens mikroszkópos képek láthatók. A b képen a GFP-CRIB domént expresszáló sejtek figyelhetők meg zölden világítva. E sejteket az aktin citoszkeletont festő TRITC-falloidines képen (a) nyilakkal jelöltem. Igen szembetűnő, hogy amíg a CRIB konstrukciót expresszáló sejtek mindegyike kis, lekerekedett morfológiát mutat, a sejtszétterülés teljes hiányával, addig a többi, nem expresszáló sejt szinte mindegyike teljesen szétterült. Mivel a CRIB domén a Rac mellett a Cdc42-t is szekvesztrálja, ezért, hogy kizárhassuk a Cdc42 esetleges szerepét és igazolhassuk a Rac kulcsfontosságát, a fenti 81

83 21. ábra: A COS7 sejtek fibronektinre történő szétterülése Rac-dependens folyamat. COS7 sejteket GFP-CRIB doménnel történ transzfekciót követően 12 órán át szérummentes körülmények közt tartottunk, majd feltripszineztük és egy órás 0,5%-os BSA-DMEM-ben történő regenerációjukat követően előzőleg fibronektinnel bevont fedőlemezre ültettünk. Tíz perces inkubálást követően a sejteket paraformaldehiddel fixáltuk, permeabilizáltuk, majd aktin citoszkeletonjuk láthatóvá tételére TRITC-falloidinnel 30 percig festettük. A szétterült sejtek arányát fluoreszcens mikroszkóp segítségével határoztuk meg, majd az expresszáló sejtek esetén kapott arányokat a nem expresszáló belső kontroll arányaihoz hasonlítottuk. A kísérletek során nyert értékeket pontonként sejt megszámolásával nyertük; a kísérleteket minden esetben háromszor végeztük el. kísérletet a GDP-kötését preferáló, így domináns negatív mutánsként funkcionáló (184,221), N17Rac-kal is elvégeztük. E kísérletből kiderült, hogy a DN-Rac a CRIB-doménhez hasonló mértékben képes a sejtszétterülés gátlására (ábrán nem bemutatott kísérlet). A Rac szerepe tehát egyértelműnek tűnik a COS7 sejtek fibronektinnel bevont felszínre történő szétterülésében, az integrinek felől kiinduló jelátviteli utakban. 82

84 A cortactin N-, illetve C-terminális felének expressziója gátolja a sejtek szétterülését Az irodalomból ismert, hogy a cortactin NTA doménjét, valamint tandem ismétlődéseit tartalmazó N-terminális fele növekedési faktor, vagy PMA kezelés hatására (56), valamint fibronektinen növesztett sejtekben (50) szemben a fehérje C-terminális felével a sejt perifériájára transzlokálódik, sőt, in vitro a cortactinhoz hasonló mértékben képes az Arp2/3 komplex aktiválására (50). Annak vizsgálatára, hogy a cortactin N- és C- terminális fele milyen hatást gyakorol in vivo az Arp2/3 komplexen át a sejtszéli aktin polimerizációra, így a lamellipodiumképződésre, a fehérje két felét GFP-fúziós protein formájában fejeztük ki, majd az őket expresszáló sejtekkel fibronektines sejtszétterülési vizsgálatot végeztünk. Három petricsésze COS7 sejtet rendre GFP-C2 üres vektorral, GFP- 22. ábra: A cortactin N- illetve C-terminális felének expressziója a sejteszétterülés gátlója. Négy petricsésze COS7 sejtet GFP-C2-vel, GFP-cortactin(1-334aminosav)-nal (N-term), GFPcortactin( aminosav)-nal (C-term), illetve GFP-cortactin( ) (C-term) SH3 mutánssal tranziensen transzfektáltunk, a sejteket a transzfekció után 12 órán át szérummentes körülmények közt tartottuk, feltripszineztük, majd fibronektin-felszínre ültettük, fixáltuk, permeabilizáltuk és TRITCfalloidinnel festettük. A szétterült sejtek arányát sejt leszámolásával határoztuk meg. Az expresszáló sejtek esetén kapott arányokat a nem expresszáló, belső kontroll arányaihoz hasonlítottuk. A kísérletet háromszor végeztük el, s az így kapott értékeket a fenti diagrammon ábrázoltuk 83

85 cortactin N-terminálissal (1-334 aminosav), illetve GFP-cortactin C-terminálissal ( aminosav) transzfektáltunk, majd éjszakán át szérummentes körülmények közt tartottunk. Másnap a sejteket a petricsészékről tripszinnel felszedtük és a szokásos eljárást követve fibronektinnel bevont felszínre 10 percig ültettük. Az ültetést követően a sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, majd az aktin hálózatukat festő TRITC-falloidinnel kezeltük. Az így nyert metszeteket fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk és az egyes konstrukciók sejtszétterülésre kifejtett hatását kísérleti pontonként sejt tanulmányozásával értékeltük. A fenti kísérletet háromszor elvégezve arra az eredményre jutottunk, hogy mind a cortactin N-, mind pedig C-terminális fele a sejtszétterülés kifejezett gátlója: az N-terminális cortactin 55,3±5,8%-os, míg a fehérje C-terminális fele még erőteljesebb, mintegy 63,4±6,2%-os szétterülés-gátlást okoz (22. ábra). Emellett érdemes megemlíteni azt is, hogy a cortactin konstrukciókat expresszáló, ám mégis szétterült sejtekben sem a cortactin C- sem pedig N-terminálisának membrán transzlokációját megfigyelni nem tudtuk, ami azért meglepő, mert mind Weed és munkatársai (56), mind pedig Uruno-ék (50) arra a megállapításra jutottak, hogy a cortactin N-terminálisa különféle stimulusok hatására a sejt perifériájára transzlokálódhat. A fenti adatok tükrében kijelenthetjük, hogy a fibronektin jelpályában mind a cortactin C-, mind pedig N-terminális fele expressziója során domináns negatív konstrukcióként funkcionál. Annak tisztázására, hogy a cortactin C- terminálisának mely doménje lehet felelős a kapott gátlásért, elkészítettük a C-terminális SH3 doménjét elrontó W525K mutánst is. A kísérletet ezzel elvégezve kiderült, hogy az SH3 domén mutációja felfüggesztette a C-terminális konstrukció gátló hatását, tehát a cortactin transzlokációjában jóval inkább az SH3 doménje által mediált fehérje-fehérje interakcióknak, mint a foszforilációs helyeknek, vagy a prolinban gazdag doménnek lehet szerepe. Itt kell megemlítenünk azt is, hogy a vad típusú cortactin expressziója gyakorlatilag nem befolyásolja a sejtek szétterülését (ábrán nem bemutatott eredmény). A cortactin fontos szerepet tölt be a sejtek fibronektin felszínhez történő adhéziójában és szétterülésében Agerernek és munkatársainak a közelmúltban publikált eredményeiből kiderült, hogy a cortactin sirns-sel történő kiütése erőteljesen gátolja a S. aureus α5β1 integrindependens internalizációját (223). Tekintve, hogy ez az integrin felelős a fibronektin megkötéséért is, a fenti kísérlet arra enged következtetni, hogy a cortactin az általunk vizsgált, 84

86 23. ábra: A GFP-cortactin C-terminális gátolja a sejtszétterülést. Az egymásra vetített képen a konstrukciót expresszáló sejtek zöldessárgán világítanak, a nem expresszálók a TRITC-falloidin festés miatt pirosak. Megfigyelhető, hogy amíg az expresszáló sejtek mindegyike kis, lekerekedett morfológiával bír, addig a nem expresszáló sejtek közt nagyszámú szétterült sejtet is találunk. 85

87 fibronektinről kiinduló integrin jelpálya fontos résztvevője. Annak vizsgálatára, hogy a cortactin milyen szerepet tölt be a COS7 sejtek fibronektinen történő szétterülésében, sejtjeinkben a cortactin fehérje termelődését RNS-interferencia segítségével visszaszorítottuk. 24. ábra: A cortactin 607. bázispárjától tervezett sirns szekvencia alkalmas a cortactin termelődésének visszaszorítására. Három petricsésze COS7 sejtet Oligofectamine segítségével kontroll kettős szálú RNS-sel, illetve két cortactinra specifikus sirns konstrukcióval transzfektáltunk, majd a transzfekció utáni második napon a sejteket feltártuk és a kivonatok fehérjéit 7,5%-os SDSpoliakrilamid gélen szétválasztottuk, majd nitrocellulóz membránra blottoltuk. A cortactin expressziójának mértékét anti-cortactin ellenanyaggal végzett Western-blot segítségével ellenőriztük. A gélre felvitt kivonatok azonos mennyiségét fehérjekoncentrációméréssel, valamint a membrán anti- Erk1/2 ellenanyaggal végzett újrablottolásával ellenőriztük. Első lépésként a cortactin mrns-ének két eltérő szakasza ellen tervezett, kettős szálú RNS oligonukleotidok hatását ellenőriztük anti-cortactin immunoblott segítségével. Ehhez sejtjeinket a tervezett sirns oligonukleotidokkal, vagy egy velük azonos hosszúságú, ám nem kódoló szekvenciájú kontroll RNS-sel (e kontroll annak kizárására szolgál, hogy az eredményül kapott fehérjeszint csökkenés egy generális, a kettős szálú RNS által kiváltott interferon válasz eredménye lenne) transzfektáltuk, majd a transzfekciót követő második napon feltártuk és a sejtkivonatokból anti-cortactin immunoblotot végeztünk. Amint a 24. ábrán látható, szemben a kontroll RNS szekvenciával, a cortactin mrns-e ellen tervezett egyik oligonukleotid a cortactin termelődését erőteljesen gátolta, míg a másik RNS nem volt működőképes. A további kísérleteinkben a hatásos sirns-t használtuk, és e konstrukció segítségével szerettük volna kiütni a cortactint a COS7 sejtekben, ám az anti-cortactin 86

88 immunfestési kísérletekből kiderült, hogy az sirns expresszióját követően is megfigyelhető maradt a sejtek anti-cortactin festődése. Ennek oka valószínűleg abban keresendő, hogy a cortactin igen nagy mennyiségben van jelen a sejtekben és mennyiségének jelentős, Westernblottal már könnyen detektálható csökkenése sem vezet a jóval érzékenyebb immunfestés teljes megszűnéséhez. Ráadásul mint utólag kiderült a cortactin kiütése gátolja a sejtek szétterülését, a kis, nem szétterült sejtek festődése pedig normál állapotban is jóval intenzívebb, mint a szétterülteké, hisz a cortactin kisebb területen oszlik el a sejten belül. Az sirns önmagában tehát nem bizonyult alkalmasnak arra, hogy rendszerünkben használva, a sejtszétterülést befolyásoló hatását közvetlenül vizsgáljuk, s így reprodukálható eredményeket nyerhessünk.. A fentiek kiküszöbölésére egy újabb eljárást hívtunk segítségül, melynek során a kívánt sirns szekvenciát egy speciális DNS-vektor segítségével (prnat plazmid), eredetileg DNS formájában juttatjuk a sejtekbe és e plazmidról már a sejten belül történik meg a megfelelő DNS-szekvencia alapján a kettős szálú, sirns szintézise (a kettős szálú RNS úgy készülhet a sejten belül, hogy a plazmidba inzertált DNS-szekvencia palindromszerűen, középen egy hajtű-struktúrával kétszeresen tartalmazza az sirns bázissorrendet, majd a róla átíródó, egyszálú mrns középtől számított két fele fog hibridizálni saját magával a palindrom struktúrának köszönhetően). Mivel a fent említett plazmid tartalmazza a GFP fehérje génjét is, ezért a hagyományos GFP-plazmidokhoz hasonlóan, a zöld-fluoreszcencia követésével azonosíthatóvá válnak a cortactin-kiütött, transzfektált sejtek. A fenti plazmiddal előállítása és hatékonyságának anti-cortactin Western-blottal történő ellenőrzése után (25.ábra d) sejtjeinket transzfektáltuk, majd megvizsgáltuk a cortactin kiütésének hatásait a sejtszétterülésre. A kísérlet során két petricsészére kitett fél-fél millió COS7 sejtet a cortactin kiütésére alkalmas plazmid-konstrukcióval, vagy az üres plazmiddal transzfektáltunk, majd a transzfekció utáni második napon 12 órai szérummentességet követően feltripszineztünk és BSA-DMEM-es regenerációjukat követően a szokásos módon fibronektinnel bevont üveglap felszínre ültettünk. Tíz perces inkubációt követően a sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, majd aktin citoszkeletonjukat TRITC-falloidinnel történő festéssel láthatóvá tettük (25.ábra b). Pontonként sejtet megszámolva, három független mérés eredményei alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a cortactin mennyiségének visszaszorítása a sejtek szétterülésének 67,7±7,2%-os, tehát több mint háromszoros gátlásához vezet (25.ábra c). Megfigyeltük továbbá, hogy a sejtek a szétterülést megelőző adhéziója is erőteljes zavart mutat, hisz amíg a cortactin termelődésének visszaszorítására alkalmas vektort 87

89 expresszáló sejtek aránya a feltripszinezés előtt kísérletenként változóan 30-40%, addig ez az arány a leültetés után mindössze 6-8%. A cortactin sirns-sel történő kiütése tehát a sejtek adhéziójának igen erőteljes, mintegy 80,7±6%-os gátlását eredményezi. A sejtek vizsgálatából kiderült továbbá, hogy a szétterült, a cortactin termelődését gátló plazmidot expresszáló sejtek 25. ábra: A cortactin expressziójának gátlása gátolja a sejtek szétterülését. Két petricsésze COS7 sejtet üres vektorral, vagy a cortactin kiütésére alkalmas szekvenciát kódolóval transzfektáltunk, majd a transzfekció utáni második napon a 12 órán át szérummentes tápoldatban tartott sejteket tripszinnel felszedtük és a szokásos eljárás szerint fibronektinnel bevont fedőlemezre ültettük vissza. Tíz perces ültetést követően a sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, TRITC-falloidinnel festettük, majd a szétterült sejtek arányát sejt leszámolásával határoztuk meg. Az expresszáló sejtek esetén kapott arányokat a nem expresszáló belső kontroll arányaihoz hasonlítottuk. A kísérletet háromszor végeztük el. Az ábra d részén az sirns szekvenciáját tartalmazó GFP-vektor kipróbálása látható. Az üres-, illetve az sirns-t kódoló vektorral COS7 sejteket transzfektáltunk, majd a transzfekciót követő második napon a sejteket feltártuk és a kivonatokból anti-cortactin immunoblotot végeztünk. A kapott eredményeket denzitometrálva a cortactin szintjének 44%-os csökkenését regisztráltuk. Figyelembe véve a Lipofectamine-os transzfekció 40% körüli maximális hatásfokát kijelenthetjük, hogy a cortactin expressziójának visszaszorítására a GFP-konstrukció valóban alkalmas. Az anti-erk immunoblot a d ábra alján kontrollként szolgál. 88

90 jóval kevésbé intenzíven világítanak zöld-fluoreszcenciával vizsgálva, mint a kontroll vektort expresszáló szétterült sejtek, tehát feltehetőleg azon sejtek terülnek szét, melyekben a cortactin kiütése a kevesebb bejutott vektor következtében kevésbé kifejezett. A fentiek alapján megállapítható, hogy a cortactin igen fontos szerepet tölt be mind a sejtek fibronektin felszínhez történő adhéziójában, mind pedig az ily módon kitapadt sejtek szétterülésében. 26. ábra: A cortactin prnat vektorral történő kiütése csökkenti a sejtek anti-cortactin immunfestődésének mértékét. A szokásos módon fibronektin felszínre ültetett sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, majd a megszokott anti-cortactin ellenanyagmennyiség negyedével (1μl/ml) immunfestettük. Az ábra a. részén a sejtek anti-cortactin festődése, b. részén pedig a GFP-t kifejező sejt zöld fluoreszcenciája látható. Az ábra c. része a másik két kép egymásravetítésével nyert szummációs kép. A GFP fehérjét is expresszáló prnat vektor segítségével végrehajtott cortactin kiütés esetén mivel az érintett sejtek a zöld fluoreszcencia miatt felismerhetők lehetővé vált, hogy az anti-cortactin immunfestés során felhasznált elsődleges- és másodlagos ellenanyagok koncentrációját csökkentve az eljárás érzékenységét úgy csökkentsük, hogy a cortactin mennyiségének csökkenése ne csupán Western-blottal, hanem mikroszkóposan is érzékelhetővé váljon. Ezt hivatott szemléltetni a 26. ábra, melynek a. része a sejtek anticortactin immunfestődését, míg b. része a GFP-t expresszáló sejtek zöld fluoreszcenciáját mutatja, c. része pedig a fenti két kép egymásravetítésével nyert szummációs kép. Az ábrán jól látható, hogy amíg az sirns szekvenciát nem tartalmazó sejtek anti-cortactin festődése érintetlen, addig a zölden világító, ennek megfelelően az sirns-t is tartalmazó sejt cortactin festődése erőteljesen lecsökkent. 89

91 A cortactin transzlokációjának vizsgálata forbol észterrel kezelt hepatociták mozgása során A forbol észter kezelés HepG2 sejtek esetén a sejtkolóniák Rho-kináz-independens szóródását idézi elő A további kísérleteinkben a cortactin viselkedését migráló sejtekben tanulmányoztuk, melyre kiváló modellnek bizonyultak a Dr. Faragó Anna professzor asszony munkacsoportja 27. ábra: A ROCK-gátló Y7632 előkezelés nem gátolja a HepG2 sejtek PMA által kiváltott szóródását. Három napos növesztés után az üveglap felszínre kiültetett HepG2 sejteket egy órán át 10 μm ROCK gátló Y27632-vel előkezeltük (d), vagy kezeletlenül hagytuk. Az egy órát követően a sejteket 80 nm PMA-val kezeltük (b-d), illetve kezeletlenül hagytuk (a). A kezelést követően az inkubációs idő lejárta után a sejteket a COS7 sejtek esetén ismertetett metodika szerint paraformaldehiddel fixáltuk, permeabilizáltuk, majd aktin citoszkeletonjukat TRITC-falloidinnel festettük és szóródásukat fluoreszcens mikroszkópia segítségével vizsgáltuk. Jól látható, hogy szemben a nem kezelt kontrollal (a) a sejtek a PMA kezelés hatására már 6 óra alatt is távolodnak egymástól (b), 24 óra alatt pedig teljesen szétválnak (c,d). Megfigyelhető, hogy a ROCK gátlása a sejtek szétvándorlására hatást nem gyakorol. 90

92 által évek óta alkalmazott HepG2 humán hepatoma sejtek. E sejtekről tudni érdemes, hogy felszínre ültetésüket követően kolóniát képezve növekednek (27.ábra a), és hogy a protein kináz C aktivátor forbol észter kezelés e kolóniák sejtjeinek szóródását eredményezi (212, 214, 224, 27.ábra b és c), amely szóródás a protein kináz C gátlásával megakadályozható. Szemben a HGF hatására létrejövő HepG2 sejtvándorlással, melynek mechanizmusa a COS7 sejtek esetén az EGF kezelés hatására létrejövő lamellipodiumképződéshez hasonlóan a PI3-kináz Rac útvonalon át zajlik, a PMA kezelés hatására létrejövő sejtszóródás mechanizmusa és a benne szerepet játszó szignalizációs utak egyelőre ismeretlenek. A korábbi kísérletek, melyek a sejtek mozgásának egy későbbi, több órás PMA kezelést követő fázisát regisztrálták, arra utaltak, hogy a forbol észterrel aktivált PKC nem a növekedési faktorok, illetve az integrin jelpálya által használt útvonalakon át indukál migrációt (212, 214). A fluoreszcens mikroszkópiával a PMA kezelés hatására megjelenő stressz rostok (27.ábra b) a Rho szerepére utaltak. Ismerve azokat az új eredményeket, melyek szerint egyes sejtvonalak mozgásáért egy speciális, Rho-kináz-dependens mechanizmus felelős (25), első kísérletünk arra irányult, hogy a Rho-kináz szerepét tisztázzuk a HepG2 sejtek forbol észteres szóródása során. Mindehez a kiültetett sejteket 3 napig növesztettük, majd miután kolóniát képeztek egy órán át ROCK inhibitor Y27632-vel előkezeltük, vagy kezeletlenül hagytuk. Az előkezelés után a sejtekhez PMA-t adtunk, és 24 órás inkubációt követően a sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, TRITC-falloidinnel festettük és fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. Az elvégzett kísérletekből kiderült, hogy a ROCK gátlása nem befolyásolja a HepG2 sejtek forbol észter kiváltotta vándorlását (27.ábra d). A forbol észter kezelés HepG2 sejtekben a cortactin transzlokációjához vezet Mivel kísérleteinkből nyilvánvalóvá vált, hogy a sejtkolóniák PMA-kiváltotta szóródását a Rho-kináz inhibitor Y27632 előkezelés meggátolni nem volt képes, így a pusztán Rho által közvetített sejtmozgás lehetősége kizárható volt. Evidensnek tűnt tehát, hogy a sejtvándorlás e formája sejtszéli, új elágazódások képződésével járó aktin polimerizáció eredménye, vagyis lamellipodiumképződéssel történő sejtmozgás. Ebben az esetben viszont a sejtszóródást a cortactin transzlokációja kell, hogy kísérje, aminek vizsgálata lehetővé tenné, hogy a forbol észterrel kiváltott migráció mechanizmusának korai fázisát tanulmányozzuk. A fenti feltevés tisztázására a sejteket a PMA kezelést követően anti-cortactin 91

93 28. ábra: A PMA kezelés a cortactin transzlokációját eredményezi HepG2 sejtekben. HepG2 sejteket fedőlemezre ültettünk, majd másnap 15 percig 80 nm PMA-val kezeltünk (b,d), vagy kezeletlenül hagytunk (a,c). A kezelést követően a sejteket a fixáltuk, permeabilizáltuk, majd a cortactin láthatóvá tételének érdekében anti-cortactin monoklonális elsődleges és Alexa Fluor 568-as anti-egér másodlagos ellenanyaggal immunfestettük. A festést követően a sejteket fluoreszcens, valamint konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. Az ábra a részén egy tipikus kontroll, a cortactin sejtzszéli lokalizációját nem mutató sejt, b részén pedig egy PMA-val kezelt sejt fluoreszcens képe látható a cortactin membrántranszlokációjával (nyillal jelölve). Az ábra c részén egy kontroll, d részén pedig egy tipikus PMA-val kezelt sejt a membrán menti cortactin felhalmozódást mutató, 1 μm-es szeletvastagságú konfokális mikroszkópos képe látható. ellenanyaggal immunfestettük, így a cortactin sejtbéli lokalizációjának esetleges megváltozása fluoreszcens mikroszkóp segítségével követhetővé vált. A kísérlet elvégzése során azért, hogy különálló sejteket vizsgálhassunk, így eredményeinket számszerűsíthessük is a HepG2 sejtek PMA kezelését a leültetésüket követő napon végeztük el, amikorra azok még nem képezhettek kolóniákat. Kísérleti pontonként sejtet vizsgálva és a kísérletet nyolcszor elvégezve arra az eredményre jutottunk, hogy amíg a kontroll sejteknek mindössze 19±2%- 92

94 ánál volt megfigyelhető a cortactin sejtszéli elhelyezkedése, addig 15 perces PMA kezelés hatására ez az arány 79±3%-ra növekedett (28. és 32.ábra). Annak kizárására, hogy az általunk látottak a membrán visszahajlása okozta műtermékek lennének, kísérleteinket a felülnézeti szummációs képet adó fluoreszcens mikroszkópia mellett a sejtek szeleteinek vizsgálatát lehetővé tevő konfokális mikroszkóp segítségével is kiértékeltük. Így bizonyossá vált, hogy a PMA kezelés HepG2 sejtekben a cortactin sejtszélre helyeződéséhez vezetett, ami viszont a vagy már eleve aktív Arp2/3 komplex további aktivációját eredményezi, vagy maga vezet az említett komplex aktiválódásához. Egyértelmű tehát, hogy a HepG2 sejtek vándorlása a sejtszéli, új elágazódások képződésével járó aktin polimerizáció által eredményezett lamellipodiummal történő sejtmozgás következménye. A fenti kísérletet COS7 sejteken is elvégezve arra az érdekes eredményre jutottunk, hogy azokban a PMA kezelés nem vezet a cortactin transzlokációjához, úgy tűnik tehát, hogy ahhoz szükség lehet a PKC valamilyen sejtspecifikus szubsztrátjára, vagy olyan szignalizációs út(ak) működésére, mely(ek) a COS7 sejtekben a PKC aktiválódás hatására nem működik/működnek. 29. ábra: A cortactin transzlokációja a sejtszóródás egésze alatt fennálló folyamat. HepG2 sejteket üveglap felszínre ültettünk, majd a kiültetésük után 72 órával 6 órán át 80 nm PMA-val kezeltünk. A kezelést követően a sejteket fixáltuk, permeabilizáltuk, majd a zöld színtartományban emittáló Alexa Fluor 488 anti-egér másodlagos ellenanyag felhasználásával anti-cortactin immunfestést végeztünk (b) a sejtek aktin citoszkeletonját pedig TRITC-falloidinnel vizualizáltuk (a). Nyilakkal a cortactin transzlokációját jelöltem. 93

95 Annak eldöntésére, hogy a cortactin transzlokációja csupán átmeneti jelenség, vagy a sejtszóródás egész folyamata alatt megfigyelhető esemény, sejtjeink kolóniáit 6 órán át tartó forbol észter kezelésnek tettük ki, majd fixálást és permeabilizálást követően anti-cortactin (a), valamint TRITC-falloidin (b) immunfestést végeztünk. Ahogyan az a 29. ábra b. részén is látható, a cortactin 6 órás kezelést követően is a sejtszélen található. Megállapíthatjuk tehát, hogy a cortactin sejtszélre helyeződése az egész sejtszóródást végigkísérő folyamat. Érdemes megfigyelni azt is, hogy a cortactin kizárólag a kolóniából centrifugálisan szétvándorló sejtek mozgásirányba eső felén mutat felhalmozódást, utalva rá, hogy értelemszerűen csak itt zajlik az Arp2/3 komplex által előidézett sejtszéli aktin polimerizáció és hogy ténylegesen e folyamat biztosítja a sejtek egymástól történő szétvándorlását. A forbol észter kezelés HepG2 sejtekben a cortactin Src kináz-dependens foszforilációjához vezet Ahogyan az az irodalmi adatokból is ismert, a PKC aktiváció az Src tirozin kinázok aktiválódásához vezet (210,211). Figyelembe véve továbbá, hogy a cortactin az Src ismert szubsztrátja (120,121), felmerült a lehetősége annak, hogy szemben a COS7 sejtekben EGF kezelés hatására kapott eredményeinkkel a cortactin foszforilációjának szerepe lehet a fehérje PMA kezelés hatására bekövetkező transzlokációjában. Ennek eldöntésére első lépésben megvizsgáltuk, hogy foszforilálódik-e a cortactin a PMA kezelés hatására. Három 75cm²-es flaskára HepG2 sejteket ültettünk, majd három nap múlva az egyik flaska sejtjeit egy órán át PP1-gyel, az Src kináz család ismert inhibitorával előkezeltük, végezetül pedig az előkezelt, valamint az egyik nem kezelt flaska sejtjeit 15 percig PMA-val kezeltük, a harmadik flaska sejtjeit pedig kezeletlenül hagytuk. A kezelést követően a sejteket feltártuk, majd anti-cortactin immunprecipitációt és anti-foszfotirozin immunoblotot végeztünk. Amint az a 30. ábra a. részén is megfigyelhető, HepG2 sejtekben a PMA kezelés erőteljes cortactin tirozin-foszforilációt eredményezett. Mivel a PP1 előkezelés e hatást teljesen kivédte, sőt, a cortactin foszforilációjának mértékét a kontroll szint alá szorította, megállapítható, hogy a cortactin PMA kezelés hatására bekövetkező foszforilációjáért a PKC-ken keresztül aktiválódó Src kinázok felelősek. A fenti hatások egyébként a nyers kivonatok antifoszfotirozin immunoblotján is nyomon követhetőek (több fehérje is foszforilálódik), ami szintén az Src kinázok PMA kezelésre bekövetkező aktiválódására utal. Mivel COS7 sejtekben a PMA kezelés nem eredményez cortactin transzlokációt, kíváncsiak voltunk rá, 94

96 hogy a PMA kezelés hatására, ami a HepG2 sejtekben cortactin foszforilációhoz vezetett, foszforilálódik-e a cortactin a COS7 sejtekben is. 30. ábra: A PMA kezelés HepG2 sejtekben szemben a COS7 sejtekkel a cortactin Src-függő foszforilációjához vezet. (a): Három flaska konfluens HepG2 sejtből egyet 20 μm-os végkoncentrációjú PP1-gyel egy órán át előkezeltünk, majd az előkezelés után kettőt 15 percig 80 nm PMA-val kezeltünk, egyet pedig kontrollnak hagytunk. A kezelés után a sejteket feltártuk, anticortactin immunprecipitációt végeztünk, majd a cortactin foszforilációjának mértékét antifoszfotirozin blottal vizsgáltuk. A kísérletet denzitometriásan is kiértékeltük és az így nyert eredményeket az ábrán intenzitás felirattal jelöltük. (b): Két petricsésze COS7 sejtet 15 percig PMAval kezeltünk, illetve kezeletlenül hagytunk, a sejteket feltártuk, anti-cortactin immunprecipitációt végeztünk, majd a foszforiláció mértékét anti-foszfotirozin blottal vizsgáltuk. A pontonként felvitt fehérjemennyiségek azonosságát mindkét esetben anti-cortactin Western-blottal ellenőriztük. A fent részletezett kísérletet COS7 sejteken elvégezve arra az eredményre jutottunk, hogy e sejtvonalban a PMA kezelés nem vezet a cortactin foszforilálódásához (30.ábra b), noha a sejtkivonatokat vizsgálva jól megfigyelhető, hogy egyes fehérjék foszforilációja fokozódik, ami arra enged következtetni, hogy a PKC és ezt követően az Src kináz e sejtekben is aktiválódik a PMA kezelés hatására. Összevetve ezt a megfigyelést azzal az 95

97 eredményünkkel, hogy COS7 sejtekben a PMA kezelés nem vezet a cortactin transzlokációjához sem, mindez azt az irodalomból is ismert felfogást erősíti (165), hogy a cortactin tirozin-foszforilációja jóval inkább a fehérje transzlokációjának következménye, mint annak okozója lehet. Mindezek mellett érdemes megemlíteni azt a tényt is, hogy kísérleteink alapján a cortactin foszforilációja a hosszabb ideig tartó PMA kezelés alatt lecseng, 6 órás kezelés után gyakorlatilag a kontroll értékre tér vissza (31.ábra). Ez pedig figyelembe véve azt a megfigyelésünket, hogy a cortactin ekkor még a sejtszélhez lokalizált előrevetíti annak a lehetőségét, hogy a cortactin tirozin foszforilációja nem játszik szerepet a fehérje transzlokációjában a PMA kezelés hatására sem. 31. ábra: A cortactin forbol észter indukálta foszforilációja HepG2 sejtekben tranziens folyamat. Három, 75 cm²-es, HepG2 sejtet tartalmazó flaska egyikét 15 percig, másikát 6 órán át PMA-val kezeltük, a harmadik flaskát pedig kezeletlenül hagytuk. A kezelést követően a sejteket feltártuk, a lizátumokból anti-cortactin immunprecipitációt végeztünk, majd a precipitálódott cortactin foszforilációjának mértékét anti-foszfotirozin immunoblottal vizsgáltuk. Az eredményeket denzitometriával számszerűsítettük és az így kapott értékeket az ábrán intenzitás felirattal tüntettük fel. A felvitt cortactin mennyiségek azonosságát a membrán anti-cortactin ellenanyaggal végzett újrablottolásával ellenőriztük. 96

98 A cortactin forbol észterrel kiváltott transzlokációja Src kináz- és PI3-K-independens folyamat Dr. Faragó Anna professzor asszony munkacsoportjának korábbi, a HepG2 sejteken végzett kísérletei arra engedtek következtetni, hogy a PMA által kiváltott sejtszóródás HepG2 sejtek esetén nem igényli sem az Src (212), sem pedig a PI3-K (214) aktivitását. Valószínűnek tűnt tehát, hogy e fehérjéknek nincs szerepe a cortactin transzlokációjában sem. A fenti feltételezés tisztázására hatlyukú edénybe, üveglap felszínre HepG2 sejteket ültettünk ki, majd 24 óra elteltével (így különálló sejteket vizsgálhattunk, tehát eredményeinket sejtszámolással kvantifikálhattuk) két-két pontot PI3-K inhibitor LY vel, Src inhibitor PP1-gyel, illetve PKC gátló biszindolilmaleimid I-gyel (BIM) egy órán át előkezeltünk, majd az így kezelt pontokból egyet-egyet 15 percig PMA-val inkubáltunk, a másik három pontot pedig kezeletlenül hagytuk. A kezelést követően a sejteket anti-cortactin monoklonális elsődleges és Alexa Fluor 568 anti-egér másodlagos ellenanyaggal festettük, majd a cortactin transzlokációját kísérleti pontonként sejt számolásával vizsgáltuk. A kísérletet az eredmények pontosságának biztosítására nyolcszor végeztük el. Amint az a 32. ábrán is jól látható, sem a PP1, sem pedig az LY előkezelés nem volt képes a cortactin transzlokációjának gátlására. Az Src inhibitor PP1 előkezelés esetén a sejtek 77,8±5%-ánál, a PI3-K gátló LY előkezelés esetén pedig a sejtek 74,5±6,8%-ánál volt megfigyelhető a cortactin transzlokációja 15 perces PMA kezelést követően, mely értékek gyakorlatilag nem térnek el az előkezelésben nem részesült sejtek esetén kapott 78,9±3,1%-os értéktől. Valószínűsíthető tehát, hogy a cortactin PMA kezelés hatására bekövetkező transzlokációjában HepG2 sejtek esetén az Src kináznak, így a cortactin foszforilációjának, illetve a PI3-K-nak szerepe nincsen. Az ábrán látszik ugyanakkor az is, hogy az LY előkezelés önmagában a kontroll sejtek cortactin transzlokációjának jelentős gátlásához vezet (6,9±1% a PI3-K gátlása esetén, míg 19,3±1,9% a kontroll esetén). Ez nem meglepő, ha figyelembe vesszük, hogy sejtjeinket egyrészt szérumot is tartalmazó tápoldatban tartottuk, tehát a különböző növekedési faktor jelpályák, ha nem is maximálisan, de aktívak voltak, másrészt pedig a sejtek felszínhez történő adhéziója is elvezethet a PI3-K aktiválódásához. Az pedig az irodalomból is ismert, hogy a PI3-K-nak fontos szerepe van a cortactin ezen utakon át történő transzlokációjában. Ha tehát gátoljuk a PI3-K aktivitását, az nyilván negatívan hat a bazális cortactin transzlokációra. További érdekes megfigyelésre jutottunk az PP1 Src inhibitor hatásának vizsgálata során. Az így kezelt sejtek esetén ugyanis a cortactin transzlokációja hozzávetőlegesen kétszeresére fokozódott a kontrollhoz képest, ami arra utal, 97

99 hogy bizonyos körülmények közt a cortactin foszforilációja negatív regulátorként funkcionálhat (59,167). A cortactin transzlokációt mutató sejtek aránya (az össze sejt százalékában) Kontroll PMA BIM PMA+BIM Ly PMA+Ly PP1 PMA+PP1 32. ábra: Különböző inhibitorok hatása a cortactin sejtszéli transzlokációjára. HepG2 sejteket 6-lyukú tenyésztőedénybe helyezett üveglapokra ültettünk, majd másnap két-két pontot 20 μm LY vel, 20 μm PP1-gyel, valamint 500 nm biszindolilmaleimid I-gyel (az ábrán BIM) egy órán át előkezeltünk, vagy kezeletlenül hagytunk. Egy órás előkezelés után minden párosból a pontok egyikét 15 percig 80 nm PMA-val kezeltük, majd a sejteket a szokásos módon fixáltuk, permeabilizáltuk és a cortactin vizualizálására anti-cortactin monoklonális elsődleges és Alexa Fluor 568 anti-egér másodlagos ellenanyaggal immunfestettük. Ezt követően a mintákat fluoreszcens mikroszkóp segítségével vizsgáltuk, és pontonként sejt esetén határoztuk meg a cortactin lokalizációját. A diagramm nyolc független kísérlet eredményeit összesíti. Irodalmi adatok alapján ismert, hogy a forbol észter kezelés hatására nem csupán a PKC család klasszikus és új tagjai aktiválódhatnak, hanem számos más, a sejtmozgással szintén összefüggésben álló fehére is (154,216,220) ezért a PKC-k szerepét azok specifikus inhibitorával, a biszindolilmaleimid I-gyel ellenőriztük. Az elvégzett kísérleteinkből kiderült, hogy a biszindolilmaleimid I kezelés önmagában a cortactin transzlokációjának gyenge fokozója. Ennek oka valószínűleg abban, a Faragó Anna professzor asszony munkacsoportja által korábban tett megfigyelésben keresendő, hogy a PKC-k gátlása a PI3-K bazális aktivitásának mérsékelt fokozódásához vezet (214), ami viszont a COS7 sejtek esetén 98

100 ismertetett módon, a Rac-on át a cortactin aktiválódását eredményezheti. Ha a biszindolilmaleimid I előkezelést követően a sejteket 15 percig PMA-val is kezeltük, akkor viszont a kontroll, PMA-val kezelt sejteknél látott 80% körüli cortactin transzlokációval szemben mindössze 40% körüli értéket láthattunk, vagyis a biszindolilmaleimid I a PMA által kiváltott cortactin transzlokáció erőteljes gátlója (kontroll sejtek esetén a PMA kezelés 20%- ról 80%-ra növeli a cortactin transzlokációt mutató sejtek arányát az összes sejten belül, ami hozzávetőlegesen négyszeres, 400%-os növekedést jelent; ezzel szemben a PKC gátló biszindolilmaleimid I-gyel előkezelt sejtek esetén 30%-ról nő 40%-ra a cortactin transzlokációt mutató sejtek aránya, vagyis a növekedés mindössze 30%-os, tehát nincs tizede sem a kontrollnál látott növekedési mértéknek). Kijelenthető tehát, hogy a cortactin transzlokációját a PKC család valamely PMA-val aktiválódó izoformája stimulálja. A cortactin forbol észter indukálta transzlokációja Cdc42/Rac-independens folyamat A Rac kardinális szerepe a sejtek lamellipodiumképződéssel járó mozgásában, valamint a cortactin transzlokációjában mind az irodalmi adatokból, mind pedig az általunk elvégzett, korábban általam is részben ismertetett kísérletekből jól ismert (165,174,177, ,221, 20.ábra). Mivel a Rac aktivációjában a PI3-K-nak igen fontos szerepe van (196), és mint láttuk, a PMA kezelés általi cortactin sejtszélre helyeződésben a PI3-K nem érintett, felmerült a lehetősége annak, hogy a PMA által indukált cortactin transzlokációban, valamint lamellipodiumképződéssel történő sejtmozgásban a Rac esetleg nem is szerepel. A fenti sejtés igazolására sejtjeinkben a Rac-ot a PAK CRIB doménjének GFP fúziós fehérjéjével szekvesztráltuk, majd a sejteket 15 percig PMA-val kezeltük és a cortactin lokalizációját anticortactin ellenanyaggal végzett immunfestés segítségével vizsgáltuk. Mivel a HepG2 sejtek transzfekciója meglehetősen rossz, mindössze 5% körüli hatásfokkal működött kísérleteinkben, ezért mindössze sejt leszámolását végezhettük el pontonként. A kísérletet háromszor elvégezve azonban így is egyértelművé vált, hogy a GFP-CRIB domén expressziója, így a Rac szekvesztrálása semmilyen hatást nem gyakorol a PMA kezelés hatására bekövetkező cortactin transzlokációra (33.ábra), tehát a sejtszéli aktin polimerizációra, így a sejtek PMA-val kiváltott, lamellipodiumképződéssel járó mozgására sem. A CRIB domént kifejező sejtekben a kontrollhoz hasonlóan a PMA kezelés a sejtek hozzávetőleg 80%-ánál eredményez cortactin transzlokációt. A korábbi általam is ismertetett kísérleteink alapján a GFP-CRIB domén működőképességéhez kétség sem férhet 99

101 (20. és 21.ábra), de a CRIB domén Rac-ot gátló hatása az irodalomból is jól ismert (222). Mindezek alapján az általunk tapasztaltak egyetlen magyarázata az lehet, hogy a HepG2 sejtek PMA kezeléssel kiváltott cortactin transzlokációjában, valamint az ezt követő sejtszéli aktin polimerizáció következtében lezajló lamellipodiumképződésben, szemben a COS7 sejteknél, az EGF- és az integrin jelpályában kapott eredményeinkkel, a Rac nem érintett. Minthogy a PAK CRIB doménje a Cdc42-t is szekvesztrálja, így annak szerepe is kizárható. 33. ábra: A GFP-CRIB domén expressziója nem gátolja a cortactin PMA kezelés hatására bekövetkező transzlokációját. Hatlyukú edénybe helyezett üveglapokra HepG2 sejteket ültettünk, majd másnap a sejteket Lipofectamine 2000-rel transzfektáltuk, és a transzfekció utáni harmadik napon paraformaldehiddel fixáltuk, permeabilizáltuk, majd a cortactin elhelyezkedését anti-cortactin monoklonális elsődleges és Alexa Fluor 568 anti-egér másodlagos ellenanyaggal végzett immunfestés segítségével (a), a CRIB domén expresszióját pedig a GFP-fluoreszcencia követésével (b), fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltuk. A gátlás pontos mértékének meghatározására sejtet vizsgáltunk és a kísérletet háromszor végeztük el. 100

102 A kísérleti eredmények megbeszélése Tekintve, hogy az elvégzett kísérleteket három, jól elválasztható csoportban ismertettem, ezért az eredmények megbeszélésére is három alfejezet formájában térnék ki, követve az eredmények ismertetésénél látott sorrendet. A rövid idejű EGF stimulus hatására kialakuló cortactin transzlokáció, illetve aktin polimerizáció nem igényli a cortactin indukálható foszforilációját Az irodalomban jól dokumentált, hogy a különböző növekedési faktorokkal végzett kezelés a sejtvonalak széles skálája esetén a cortactin sejtszélre helyeződéséhez vezet (165,168,174,221). A fenti megállapítást az általunk használt COS7 sejtek esetén vizsgálva arra a következtetésre jutottunk, hogy a rövid idejű EGF kezelés sejtjeinkben, az irodalomban elfogadottakhoz hasonlóan, a cortactin sejtszélre történő áthelyeződéséhez vezet. A cortactin transzlokációja mellett ugyanakkor megfigyelhetők a sejtszéli aktin polimerizációra utaló, mikroszkóposan vizsgálható jelek, a membránfodrozódás, illetve a lamellipodiumképződés is, ami jó összhangban van a cortactin az Arp2/3 komplex aktiválásában betöltött szerepével. Mivel ismert tény volt, hogy a cortactin számos protein tirozin és szerin/treonin kináz szubsztrátja (120,59, ), ezért logikusnak tűnt, ha első lépésben a cortactin EGF kezelés hatására bekövetkező foszforilációját vizsgáljuk meg. Az általunk elvégzett kísérletek eredményei alapján egyértelmű, hogy az EGF kezelés hatására transzlokálódó cortactin tirozin oldalláncain nem foszforilálódik. A foszforiláció hiánya semmiképpen nem lehet méréseink nem kellő érzékenységének a következménye, hisz az Src-t expresszálva sejtjeinkben, igen kifejezett cortactin foszforilációt tudtunk detektálni, és kiderült, hogy módszerünkkel akár a cortactin 1-2%-ának foszforilációja is érzékelhető. Tovább erősíti a tirozin foszforiláció szükségtelenségét a cortactin transzlokációjában az a megfigyelésünk, hogy a tirozin oldalláncain foszforilálódni képtelen hármas cortactin mutáns, a vad típusú fehérjéhez hasonlóan, EGF kezelés hatására a sejtszélre transzlokálódik, de szintén a foszforiláció szerepét zárja ki az is, hogy a konstitutívan aktív Src-t expresszáló és igen jelentős cortactin tirozin foszforilációt mutató sejtekben a fehérje transzlokációját megfigyelni nem lehet. Az általunk kapott eredmények összecsengenek azokkal az irodalmi adatokkal, melyek arra 101

103 engednek következtetni, hogy a cortactin tirozin foszforilációjának sokkal inkább a fehérje inaktiválásában, a sejtszéltől, az Arp2/3 komplextől történő eltávolításában lehet szerepe, mintsem a fehérje transzlokációjában (167,169). A Head és munkatársai által kapott, ezzel ellentmondó eredmények oka részben az lehet, hogy ők kísérleteik során olyan sejtvonalat (C3H 10T1/2) használtak, melyben az EGF-receptor negyvenszeres mennyiségben van jelen (165), eredményeik tehát közel sem tekinthetők a cortactin foszforilációja szempontjából fiziológiásnak. Ugyanakkor elképzelhető az is, hogy a cortactin tirozin foszforilációjának nem is a fehérje általános transzlokációjában, vagy a membrántól történő eltávolításában lehet szerepe, hanem kötőhelyet teremtve más fehérjék SH2 doménje számára fehérje-fehérje interakciók kialakításában, a cortactin speciális helyekre szállításában és e speciális helyeken zajló Arp2/3 aktivációban. Erre utalnak a Bougnères és munkatársai által elvégzett kísérletek is, melyekből kiderült, hogy a cortactin tirozin foszforilációja kötőhelyet teremt a Crk adapterfehérje SH2 doménje számára és e kapcsolat gátlása megnehezíti a Shigellák intracelluláris, aktin csóva segítségével zajló mozgását (145). Úgy tűnik tehát, hogy e folyamathoz valószínűleg a cortactin transzportján, nem pedig aktivitásának szabályozásán keresztül szükséges a cortactin tirozin foszforilációja, míg más folyamatokhoz nem, sőt egyes megfigyelések szerint vannak olyan események, például a cortactin általi WASP aktiváció (59), amikre az kifejezett gátló hatást gyakorol. A cortactin amellett, hogy tirozin kinázok szubsztrátja, számos szerin/treonin kináz által is foszforilálódhat (59, ), sőt, egyes megfigyelések szerint a fehérje Erk általi foszforilációja fokozza az N-WASP aktiváló képességét is (59), így együttműködve a fehérje gátló, tirozin foszforilációjával egy ki-bekapcsoló mechanizmust biztosít. Annak vizsgálatára, hogy COS7 sejtek és EGF kezelés esetén szükséges-e a cortactin Erk általi foszforilációja a fehérje transzlokációjához, sejtjeinket MEK inhibitorral kezeltük és immunfestéssel vizsgáltuk. Kísérleteinkből kiderült, hogy noha az Erk aktivitása jelentősen csökken a kezelés hatására, a cortactin transzlokációjában gátlás nem következik be, ahhoz tehát az Erk általi szerin/treonin foszforiláció nem szükséges. Ezt erősíti az a [ 33 P]ortofoszfáttal jelölt sejteken tett megfigyelésünk is, hogy sem az EGF kezelés, sem pedig a Vav2 overexpressziója nem vezet a cortactin foszforilációs szintjének fokozódásához. Kísérleteinkből ugyanakkor kiderült, hogy a cortactin igen jelentős bazális foszforilációval bír, ami a negatív anti-foszfotirozin immunoblotot figyelembe véve a fehérje szerin/treonin foszforilációjának következménye lehet. Mindez felveti annak a lehetőségét, hogy ugyan a cortactin indukált szerin/treonin foszforilációja nem vezet a fehérje sejtszélre helyeződéséhez, és nem játszik szerepet az EGF kezelésssel, vagy a Vav2 overexpresszióval kiváltott 102

104 transzlokációban, de esetleg a bazális foszforiláció által előidézett konformációváltozás előfeltétele lehet a cortactin működésének. Mivel a [ 33 P]ortofoszfáttal jelölt sejteken végzett kísérleteinkből kiderült, hogy a cortactin foszforilációjának mértéke EGF kezelés hatására nem változik, feltételezhető, hogy valószínűleg az Erk-en kívül más szerin/treonin kinázok sem vesznek részt a cortactin EGFfüggő transzlokációjában. Kísérleteinkből kiderült továbbá az is, hogy a domináns aktív PAK expressziója sem képes fokozni a cortactin foszforilációját, sőt, szemben a Vidal és munkatársai által kapott eredményekkel (171), a cortactin in vitro sem szubsztrátja a PAKnak. A fenti ellentmondás azért is meglepő, mert mi a sejtekben overexpresszált, majd immunprecipitációval tisztított és igen aktívnak bizonyult domináns aktív PAK konstrukcióval sem tudtuk kimérni a rekombinánsan termelt GST-cortactin foszforilációjának kisfokú növekedését sem, Vidal-ék viszont csupán a trombin kezeléssel aktivált, majd anti- PAK immunprecipitációval tisztított endogén PAK-ot használva tapasztalták azt. Kísérleteink alapján valószínűsíthető tehát, hogy a PAK sem in vivo, sem pedig in vitro nem képes a cortactin foszforilálására. A cortactin szerepe az integrin jelpályában Az eddig ismertetett cortactin transzlokációs vizsgálatokkal szemben a cortactin sejtszéli aktin polimerizációra és lamellipodiumképződésre kifejtett hatásának sokkal látványosabb és egyértelműbb vizsgálatát teszi lehetővé a fibronektines sejtszétterülési assay. Ezen eljárás során a fibronektin receptor integrin α5β1-ről kiinduló jelpálya résztvevőit vizsgálhatjuk az egyes DNS-konstrukciók transzfekciójának, a sejtek szétterülésére kifejtett hatását megfigyelve. A COS7 sejtekben aktiválódó integrin jelpályában a Rac fontos szerepet tölt be Price és munkatársainak 1998-ban publikált eredményei óta ismert, hogy a Rho GTPázoknak, és főként a Cdc42-nek, illetve a Rac-nak az integrin jelpályában is központi szerepe van (203). Ezt a GTP-t kötő Cdc42-höz, illetve Rac-hoz kapcsolódó és azokat ily módon szekvesztráló PAK CRIB domén expressziójának a sejtek szétterülésére kifejtett hatásával mi magunk is igazolni tudtuk (21.ábra). Munkacsoportunk korábbi, illetve az 103

105 általam elvégzett kísérletei, valamint az irodalmi adatok alapján felvázolható tehát egy olyan reakcióút, melyben az integrinek felől a jel valószínűleg a PI3-K-on, valamint a Vav2-n át a Rac-hoz jut, majd innen halad tovább az aktin citoszkeleton felé, annak sejtszéli polimerizációját, így a sejtek szétterülését eredményezve. A cortactin N- és C-terminális felének expressziója gátolja a sejtszétterülést Kísérleteink elkezdésekor az irodalomban nem volt egyértelmű bizonyíték rá, hogy a cortactin részt vesz az integrin jelpályában. Első lépésként tehát a teljes hosszúságú, vad típusú cortactint expresszáltuk sejtjeinkben, azonban ez érdemben nem befolyásolta a sejtek szétterülését (nem bemutatott adat). Ezért elkészítettük a fehérje N- és C-terminális felét, majd megvizsgáltuk e két konstrukció hatását az őket expresszáló sejtek szétterülésére. Az irodalomból ismert, hogy a cortactin Arp2/3-t kötő NTA doménjét, valamint F aktinhoz kapcsolódó tandem ismétlődéseit tartalmazó N-terminális fele növekedési faktor, vagy PMA kezelés hatására (56), valamint fibronektinen növesztett sejtekben (50) szemben a fehérje C- terminális felével a sejt perifériájára transzlokálódik, sőt, in vitro a cortactinhoz hasonló mértékben képes az Arp2/3 komplex aktiválására (50), a C terminális fehérjefél pedig különféle fehérje-fehérje interakciókon, valamint a foszforilációs helyeken keresztül befolyásolhatja a fehérje aktivitását. A fenti irodalmi adatok tükrében az volt várható, hogy amennyiben a cortactin szerepel az integrin jelpályában, úgy N- és C-terminális felének kifejezése a sejtszétterülést befolyásolni fogja. Eredményeinkből kiderült, hogy a fehérje mindkét felének önálló expressziója a sejtszétterülés jelentős gátlásához vezet. Könnyebb magyarázni a C-terminális fél gátló hatását, mely arra enged következtetni, hogy a cortactin aktivitásához szükséges lehet, hogy a fehérje C-terminális felének prolinban gazdag, vagy még inkább SH3 doménjével egy másik fehérje létesítsen kapcsolatot, mely kapcsolat a cortactin transzlokációjához (esetleg a már transzlokált fehérje aktiválásához), így az Arp2/3 komplex fokozott működéséhez, tehát a sejtek szétterüléséhez vezet. Nyilvánvaló tehát, hogy amennyiben a fenti kapcsolat a C-terminális cortactin konstrukció szekvesztráló hatása miatt elmarad, úgy a cortactin nem képes a membránhoz transzlokálódni (esetleg aktiválódni), így elmarad az Arp2/3 komplex aktiváló hatása is, tehát a sejtek szétterülése gátlást szenved (34.ábra). Az N-terminális fehérjefél gátló hatásának magyarázata ennél jóval bonyolultabb, és elvileg három elképzelhető lehetőség van rá. Az első feltevés esetén ugyan a cortactin N- terminálisa képes lehet az Arp2/3 komplexhez, valamint az F aktinhoz kapcsolódni (ahogyan 104

106 34. ábra: A cortactin C-terminális fele gátolja a sejtszétterülést. A cortactin C-terminális fele a fehérje SH3 doménjéhez kapcsolódni képes proteinekért (X-el jelölve) verseng az endogén cortactinnal, azok egy részét megköti, s mivel a cortactinra jellemző aktivitás kifejtésére nem képes, ezért mindez gátlásként jelentkezik. az az Uruno-ék és Weed-ék által látott transzlokáció alapján valószínűsíthető (50,56)), azonban kapcsolódása esetén sem képes az Arp2/3 komplex olyan mértékű aktiválására, mint a teljes hosszúságú, így más fehérjék által esetlegesen aktivált cortactin. Ennek megfelelően tehát az N-terminális mintegy kompetícióban van az endogén cortactinnal az Arp2/3-hoz történő kötődésért és mivel gyengébb aktivátor, mint a teljes hosszúságú cortactin, ezért hatását gátlásként érzékeljük. Erre mutatnak Schafer és munkatársainak eredményei, miszerint a cortactin in vitro Arp2/3 aktiváló képességét fokozza a fehérje SH3 doménje és a dynamin közti interakció (175) (noha nem kizárt, hogy e fokozódás az újonnan létrejött elágazódások stabilizálása, azok féléletidejének megnövelése miatt tapasztalható), de Martinez-Quiles-ék azon megfigyelése is, hogy a cortactin SH3 doménjével kapcsolódhat az N-WASP-hoz és aktiválhatja azt (59), így áttételesen eredményezve az Arp2/3 komplex fokozott működését. Kézenfekvő tehát, hogy amennyiben a cortactin hatásában a fehérje C-terminális doménjei is szerepet játszanak, úgy az N-terminális cortactinfél a fent említett kompetíció miatt in vivo 105

107 35. ábra: A cortactin N-terminális fele gátolja a sejtszétterülést. Amennyiben a cortactin szerepet játszik az aktin elágazódásképződés helyének kijelölésében azáltal, hogy az Arp2/3 komplexet ide rögzíti, esetleg szállítja, úgy az N-terminális fél szétterülést gátló hatása azzal magyarázható, hogy ugyan képes az Arp2/3 komplex megkötésére (sőt azért verseng is az endogén cortactinnal), ám mivel nem rendelkezik az SH3 doménnel, nem képes kötni az ide kapcsolódó, az aktivációban fontos szerepet betöltő fehérjéket (az ábrán X-el jelölve), ezért transzlokációja, aktiválódása elmarad, tehát a hozzá kapcsolódó Arp2/3 komplex az elágazódásképződéssel járó sejtszéli aktin polimerizáció számára elvész. domináns negatív konstrukcióként funkcionál. Csökkenti az előbbiekben ismertetett feltevés valószínűségét, hogy egyrészt a cortactin aktin polimerizátor képességében jóval inkább az újonnan képzett elágazás N-terminális (NTA domén és tandem ismétlődések) általi stabilizálásának van szerepe, mint magának az Arp2/3 komplex aktivációnak (51), másrészt pedig az általánosan elfogadott felfogás szerint amennyiben a cortactin köti az F aktint, és NTA doménjéhez kapcsolódik az Arp2/3, úgy egyben aktiválja is azt (az Arp2/3 komplex bázikus foltjához kapcsolódó acidikus domén az Arp2/3 aktív konformációjának kialakulását eredményezi). Meglehetősen valószínűtlen tehát, hogy a szétterülést gátló N-terminális cortactin a megfelelő helyen egyszerre kösse az F aktint és az Arp2/3-t, hisz ebben az esetben egyrészt képes lenne az aktin elágazódás stabilizálására, másrészt pedig az Arp2/3 komplex aktin polimerizáló képességének, a cortactinra jellemző, gyenge mértékű fokozására. Az 106

108 viszont nem kizárt és ez szolgálhat második magyarázatul az N-terminális cortactinfél viselkedésére hogy a cortactin N-terminálisa nem képes egyszerre az F aktinhoz és az Arp2/3 komplexhez kapcsolódni, csupán a kettő közül az egyikhez, így tehát valamelyik partner tekintetében az előbbi magyarázatnál látottakhoz hasonlóan szintén kompetícióban van az endogén, teljes hosszúságú cortactinnal. Elképzelhető, sőt az általunk tapasztaltakkal sokkal inkább összhangban van, egy harmadik magyarázat is a cortactin N-terminális gátló hatására. Kowalski és munkatársai kísérleteikben arra a következtetésre jutottak, hogy nem a WASP fehérjék aktiválódása az elsődleges, majd a cortactin Arp2/3-hoz történő transzlokációja a másodlagos folyamat, hanem a cortactin Arp2/3 komplexhez kapcsolódása történik meg először és ezt követi részben éppen a cortactin hatására a WASP fehérjék aktiválódása (60). Elképzelhető tehát, hogy a cortactin azzal, hogy mind az F aktinhoz, mind pedig az Arp2/3 komplexhez kapcsolódik, nem csupán stabilizálja az Arp2/3 komplex által újonnan képzett elágazást, de szerepet játszik abban is, hogy az Arp2/3 komplex aktivitásának kifejtése előtt az aktin polimerizáció helyére, a meglévő F aktin lánc oldalához, vagy végéhez szállítódjon. Ha viszont ez így van, és figyelembe vesszük azt, hogy a cortactin transzlokálódásában a fehérje C-terminális felével kapcsolatot létesítő proteinek is szerepet játszhatnak, úgy egyértelműen következik az Arp2/3 komplexhez való kötődésben a cortactinnal versengő N-terminális fehérjefél gátló hatása. Ebben az esetben az N-terminális tulajdonképpen szekvesztrálja az Arp2/3 komplexet, lehetetlenné téve, hogy a teljes hosszúságú cortactin transzlokációja során azt a sejtmembrán közelébe, az F aktin anyafilamentumhoz szállítsa (35.ábra). Ezt a felfogást támogatja az a megfigyelésünk is, hogy a cortactin N-terminális felét expresszáló sejtekben az N-terminális cortactin nem transzlokálódik a sejt perifériájára a szétterülés során. Annak eldöntésére, hogy a cortactin C-terminális felének mely része lehet felelős a C- terminális sejtszétterülést gátló hatásáért az irodalmi adatok ismeretéből kiindulva és elsődlegesen az SH3 domén szerepét feltételezve a sejtszétterülési kísérletet elvégeztük a cortactin C-terminális felének egy olyan mutánsával is, ahol az SH3 domén más fehérjék prolinban gazdag doménjéhez kapcsolódni nem képes. Mivel ez az SH3 mutáns C-terminális cortactin konstrukció a sejtszétterülést nem gátolta, nyilvánvalóvá vált, hogy a C-terminális gátló hatásáért annak SH3 doménje felelős, tehát a cortactin SH3 doménjéhez kapcsolódó fehérjék lehetnek érintettek a cortactin aktiválásában. 107

109 A cortactin kitűntetett szerepe az integrin-függő sejtadhézióban és kiterülésben Mint láttuk, a cortactin N-, illetve C-terminális felének overexpressziója gátolta a sejtek kiterülését. E megfigyelés arra engedett következtetni, hogy a cortactinnak a fenti folyamatban fontos szerepe lehet. Ugyanerre utalnak Agerernek és munkatársainak a közelmúltban, munkánk megkezdése után publikált eredményei is, melyekből kiderült, hogy a cortactin sirns-sel történő kiütése erőteljesen gátolja az S. Aureus α5β1 integrindependens internalizációját (223). Mivel a fent említett integrin egyben a fibronektin receptora is, igen valószínű volt, hogy a cortactin, a Rac-hoz hasonlóan érintett az integrin jelpályában. Annak tisztázására, hogy a fenti folyamatban a Rac közvetett, vagy közvetlen effektoraként milyen módon szerepel a cortactin, illetve ténylegesen szerepel-e, sejtjeinkben RNS-interferencia segítségével, a cortactin expresszióját visszaszorítottuk, majd vizsgáltuk a cortactin ily módon elvégzett kiütésének hatását a sejtszétterülésre. Eredményeinkből kitűnik, hogy a cortactin nem csupán a sejtek szétterülésében, hanem azok fibronektin felszínhez történő adhéziójában is igen fontos szerepet játszik, expressziójának visszaszorítása mindkét folyamatot erőteljesen gátolja. Összevetve a cortactin funkcióját (Arp2/3 komplex aktiváció) a sejtszétterülés során zajló folyamatokkal (az Arp2/3 komplex által mediált sejtszéli aktin polimerizáció), nem meglepő a cortactin szerepe a sejtek integrin-mediált szétterülésében. A cortactin kiütésének hatása a sejtadhézióra szintén magyarázható a fehérje funkcióival. Minthogy a cortactin jelentős szerepet játszhat a vezikulatranszportban, illetve a vezikulák aktin polimerizáció segítségével történő mozgatásában, expressziójának visszaszorítása értelemszerűen a fenti folyamatot is befolyásolhatja. A fibronektines sejtszétterülés vizsgálata során a sejteket leültetésük előtt feltripszinezzük, tehát tulajdonképpen a sejtfelszínen található integrinek extracelluláris részeit elemésztjük. Az ezt követő egy órás regeneráció során történik meg az integrinek pótlása az intracelluláris vezikula raktárakból. Feltehető tehát, hogy amennyiben a cortactin érintett a vezikulák mozgatásában, úgy hiányában a vezikulatranszport gátlása miatt gátlódik a fenti folyamat is, tehát a sejtek felszínén a regeneráció után is jóval kevesebb az ép integrin, mint a kontroll esetén. Nem meglepő hát, hogy már a sejtek adhéziója is zavart szenved. A vezikulatranszport gátlása a csökkent sejtmembránbeli integrin mennyiségen keresztül természetesen szintén befolyásolhatja a sejtszétterülést, hozzájárulva a cortactin kiütésének a sejtszétterülésre kifejtett gátló hatásához. További elvi lehetőséget teremthet a szétterülés 108

110 36. ábra: A cortactin szerepe a sejtek adhéziójában. Mivel a fehérje részt vehet a vezikulák mozgatásában, ezért fontos szerepe lehet a feltripszinezést követő regeneráció alatti integrintranszportban. Emellett nem elképzelhetetlen, hogy az emésztett integrin maradékok endocitózissal történő eltávolításához is szükséges a cortactin jelenléte, s ha a fenti folyamat a cortactin kiütése miatt gátolt, úgy a membránban maradó funkcióképtelen integrin maradványok versenghetnek kötőpartnereikért az ép integrinekkel, így gátolva az integrin jelpálya működését. gátlására, hogy a cortactinnak szerepe lehet az extracellulárisan emésztett, funkcióképtelen integrinek endocitózisában, eltakarításában is, és e folyamat szintén zavart szenvedhet a cortactin expressziójának visszaszorítása során. Az így a sejtmembránban maradó, működésképtelen, a tripszin által extracellulárisan emésztett integrinek aztán intracelluláris doménjükkel kompetálhatnak az ép integrinekkel, az effektor fehérjékért, azok egy részét ezáltal szekvesztrálva. Nem elképzelhetetlen az sem, hogy a cortactin valamilyen módon szerepet játszik az úgynevezett inside-out jelben, az integrinek érzékenyítésében, az intracelluláris domének konformációváltozását előidézve, mely folyamatot az extracelluláris domének konformációváltozása kísérheti. Figyelembe véve az eddig ismertetett kísérleti eredményeinket, azok egy olyan modell meglétét támogatják, melyben az integrinek által aktivált Rac aktiválja effektorait, mely 109