zis Brown-mozg mozgás Makromolekula (DNS) fluktuáci Vámosi György

Átírás

1 Brown-mo mozgás magyarázata Vámosi György Diffúzi zió és s ozmózis zis Az anyag részeskéi állandó mozgásban vannak Haladó mozgás átlagos energiája: E= 3 / kt Emlékeztető: Mawell-féle sebességeloszlás gázokban: Átlagsebesség: v = 3kT / m f(v)~δn/n 1 T= C T=5 C N 5 1 v (m/s) 15 A Brown-mozgást a megfigyelt részeskék és a közeg részeskéinek ütközései okozzák, energia- és lendület-átadás Brown-mozg mozgás Makromolekula (DNS) fluktuái iója Robert Brown botanikus, 187: vízben lebegő virágpor szemsék zegzugos mozgását figyelte meg A jelenséget valamilyen életerő megnyilvánulásának tekintette Könnyű szemsék (füst, por, apró folyadékseppek) mozgása levegőben

2 Adolf Fik kísérlete: festékmolekulák spontán szétoszlása vízben Diffúzi zió víz festék folyadékok: keveredés néhány hét alatt gázok: néhány másodper alatt Diffúzió: részesketranszport Konentráiókülönbségek (vagy egyéb tényezők, pl hőmérsékletkülönbség, oldékonyságbeli különbség) hatására bekövetkező, a részeskék rendezetlen hőmozgásán alapuló, nettó anyagáramlással járó változás Fik I törvt rvénye Staionárius diffúzió leírása (d/dt =, d/d = állandó) 1 d d ( = 1 d ) ( 1 ) 1 dm dt = DA D: időegység alatt, egységnyi felületen, egységnyi konentráió gradiens hatására átáramló anyagmennyiség [D] = m /s (m /s) d d -felület -diffúziós állandó -diffúziós áram: egységnyi idő alatt átáramló anyagmennyiség -konentráió gradiens Fik II törvt rvénye Nem staionárius diffúzió leírása egy dimenzióban = (,t): a konentráió időben és térben változik adott helyen a kon idő szerinti változási gyorsasága (pariális deriváltja) t = D t adott t időpillanatban a kon hely szerinti második pariális deriváltja Pariális differeniálegyenlet Időben elsőrendű, hely szerint másodrendű A differeniálegyenlet (,t) megoldása a kiindulási feltételektől, a geometriától függ Nins általános analitikus megoldása Fik II megoldása: szabad diffúzi zió 1 dimenzióban Ha t= pillanatban minden molekula az origó kisiny l szélességű környezetében van, a hely szerinti eloszlás egy (időben egyre jobban kiszélesedő) normál eloszlás: l 4 Dt (, t) = e 4πDt Szórásnégyzet (t pillanatban): σ = <Δ > = Dt l σ t 1 t

3 A diffúzi ziós s mozgás s időfügg ggése: lineáris ábrázolás A molekulák átlagos négyzetes elmozdulása, <Δ > (= < > ) a t időpillanatban (az eloszlás szórásnégyzete), Einstein-Shmoluhowski-egy: σ = <Δ > = Dt Diffúzió 3D-ban: <Δr > = <Δ > + <Δy > + <Δz > = 6Dt Az átlagos négyzetes elmozdulás gyöke (rms) Δ = Dt idő Diffúzió: random walk, (véletlenszerű mozgás) rövid távon gyors - hosszú távon lassú Δ = vt A diffúzi ziós s mozgás s időfügg ggése: logaritmikus ábrázolás 1 m 1 m μm -6 Egyenes vonalú egyenletes mozgás -8 1μs 1ms 1s 1nap 1év log t (s) Elég gyors molekuláris/sejtbeli folyamatokhoz Lassú a makroszkopikus transzporthoz keringés szükséges idő Diffúzió különböző fázisokban Mitől függ D értéke? Gázok: Az egy transzláiós szabadsági fokra eső átlagenergia: ½mv = ½ kt D v D hőmérsékletfüggése: -közvetlen (kt) -közvetett (T nő η sökken) Makromolekulák, kolloid részeskék oldatban Stokes-Einstein egyenlet (gömbszerű molekulákra): D = kt f = kt 6πηr T m f: alakfaktor vagy súrlódási együttható megnyúlt molekulaalakra nagyobb mint gömb alakra r: hidratált molekulasugár r 3 MW η: közeg viszkozitása Néhány részeske r diffúzi ziós állandója Diffundáló anyag H O K + H + etanol gliin (75) szaharóz (34) ribonukleáz (13 ) szérum albumin (69 ) tropomiozin (93 ) dohány mozaik vírus (4 millió) H Közeg H O H O H O H O H O H O H O H O H O H O levegő D(m /s) Δ (naponta) m 18 m 4 m 15 m 13 m 9 m 4 m 3 m 19 m 7 m 33 m

4 Miért van nettó anyagáramlás? Molekuláris magyarázat Tfh minden részeske azonos valószínűséggel mozdulhat el a tér bármely (±, ±y, ±z) irányában: p = 1 / 6 Az egyik térrészből a másik felé elinduló molekulák száma: ΔN(1 ) = 1 / 6 N 1 = 1 / 6 1 V 1, N 1, V 1, N, V Eredő anyagáramlás 1-ből -be: ΔN( 1) = 1 / 6 N = 1 / 6 V ΔN(1 ) - ΔN( 1) = 1 / 6 ( 1 - )V > Miért van nettó anyagáramlás? Termodinamikai magyarázat Diffúzió szerepe az élő szervezetben A transzportlán végén az anyagok diffúzióval jutnak el a kapillárisból a sejtekhez és vissza (tápanyagok, salakanyagok, O, CO ) Ekretált, szekretált anyagok, hormonok, gyógyszerek, hatóanyagok sejtekhez való eljutása Transzmembrán (membránon keresztül történő) és a membrán síkjában történő laterális/rotáiós diffúzió Sejten belüli diffúzió, kémiai reakiók, molekuláris felismerési folyamatok A transzmembrán diffúzió mehanizmusai Emlékeztető: Konstans T és p mellett a rendszer szabadentalpiája sökken spontán lejátszódó folyamatokban G(T,p,N) = E + pv - TS, ΔG A kémiai poteniál (egy molekulára jutó szabadentalpia) : μ = μ (T,p) + RT ln [μ (T,p): 1M oldat kémiai poteniálja] G úgy sökkenhet, ha a molekulák a magasabb kémiai poteniálú (magasabb vagy T) hely felől az alasonyabb kémiai poteniálú hely felé áramolnak Statisztikus hajtóerő, G sökkenése ΣS növekedésével ekvivalens! A membrán különféle molekulák számára különböző áteresztőképességű akadályt jelent Passzív diffúzió: alasonyabb konentráió (szabadentalpia sökkenés) irányában Failitált diffúzió: alasonyabb konentráió irányában, transzporter molekulák segítségével megy végbe Aktív transzport: kon gradienssel szemben, energiaigényes (ATP)

5 Passzív v transzmembrán n diffúzi zió Gázsere a tüdőben A sejtmembrán permeabilitása egy molekulára nézve annál kisebb, minél nagyobb a molekula mérete és polárossága/töltése Gázok Kisméretű semleges poláros molekulák Víz Nagyméretű poláros molekulák Ionok Töltött poláros molekulák alveolus alveoláris epithelium interstiiális tér kapilláris endothelium vérplazma vvt O CO Passzív diffúzió Diffúziós kapsolat az alveoláris térrel: ~3 s Δ = Dt D D O CO 9 = 1 m s 9 = 6 1 m s t t O CO = 5μs = 8μs dm dt Passzív v diffúzi zió a membránon keresztül H O Lipid 1,l β>1 1,w,l,w = PA β<1 ( ) 1, w ~Fik I, w H O l β = Megoszlási hányados w (a hidrofobiitás mértéke) P= βd / permeabilitási állandó Mitől függ P értéke? β, ez függ leginkább a molekula típusától D, (kb egyforma ugyanakkora molekulákra) a membrán vastagságától (kb állandó) Failitált lt diffúzi zió Szelektív transzport - alasony lipidoldékonyságú molekulák/ionok speifikus transzportja transzporter molekulák (permeáz fehérjék, ionofórok és ionsatornák) segítségével Nem igényel külső energiát, az alasonyabb konentráiójú hely felé irányul Jellemzői: Példák: Gyorsabb a passzív diffúziónál Szelektív Telíthető Speifikusan gátolható failitált passzív Glükóz transzporter a vvt membránjában Víztranszporter a vvt-ben, vesében és a hólyagban (aquaporin) (ionsatornák, bár ezek nem telíthetők)

6 Failitált lt diffúzi zió kötődés transzlokáió disszoiáió Laterális diffúzi zió mérése a sejtmembránban I FRAP: (Fluoresene Reovery After Photobleahing) fehérje megjelölése fluoreszens antitesttel, v membrán jelölése lipid analóggal fókuszált lézernyalábbal megvilágítjuk a membrán kisiny darabját, CCD kamerával/fotoelektronsokszorozóval megmérjük a fluoreszenia intenzitást 1-szeres intenzitással kiégetjük a fluoreszeniát Időben követjük a fluoreszenia visszatérését időállandó: τ~1/d R visszatérési hányad: mobilis hányad (lipidek: 9-1%, fehérjék: 1-9%) v ma ½v ma K M v v = K ma + M K M : Mihaelis-állandó (kon, melynél v = ½ v ma ) F k F k -F F τ R F F F F = idő k F Diffúzi zió a plazma membrán n síkjs kjában Laterális diffúzi zió mérése a sejtmembránban II A sejtmembrán dinamikája A membránban elhelyezkedő fehérjék és lipidek laterális (és rotáiós) diffúziós mozgást végeznek viszkozitás: η membrán >> η víz (-1 ) Különböző molekuláris összetételű, fluid és gél állapotú lipid domének A membránfehérjék kapsolódhatnak egymáshoz, az etraelluláris mátrihoz, a itoszkeletonhoz, mozgásukat gátolhatja a itoszkeleton membránhoz asszoiált hálózata, a membrán szkeleton mindez gátolhatja a diffúziót Fehérjék: D ~ m /s Lipidek: D ~ 1-8 m /s Kísérleti módszerek a laterális diffúzió mérésére: Fotokioltás utáni fluoreszenia visszatérés (FRAP) Részeske/festékmolekula nyomkövetés (SPT, SDT) Fluoreszenia korreláiós spektroszkópia (FCS) SPT: (Single Partile Traking), részeske nyomkövetés A vizsgált molekulát fluoreszensen v kolloidális aranygömbbel jelölik CCD kamerával közvetlenül nyomon követik a részeske mozgását membrán domének megjeleníthetők A diffúzió különböző formái elkülöníthetők: szabad diffúzió, <Δr > = 4Dt irányított diffúzió, <Δr > ~ v t gátolt diffúzió, <Δr > negatív irányban tér el a szabad diffúzióra jellemző időfüggéstől membrán szkeleton aranygömb reeptor Ld a transzferrin reeptor gátolt diffúzióját bemutató mozit ( Prof Akihiro Kusumi, Department of Biology, Nagoya University, Japan)

7 Részeske nyomkövet vetés s Aonális transzport II Δr Δr ~ v t irányított diff Δr = 4Dt szabad diffúzió 1μm Δr < 4Dt ha t nagy gátolt diffúzió Δt(s) Vezikulák transzportja tintahal óriás aonjában Aonális transzport: irányított mozgás Gyors: vezikulák, 5 mm/nap Közepes: mitokondrium, 5 mm/nap Lassú: polimerizált itoszkeletális proteinek,,-1 mm/nap

8 Fluoreszenia korreláiós spektroszkópia A diffúziós állandó mérésére alkalmas módszer etrém alasony konentráió esetén is (1-1 M),3 μm 1,5 μm A vizsgálandó molekula (fehérje, lipid, stb) fluoreszens jelölése Kisiny, <1μm 3 -es térfogat megvilágítása fókuszált lézernyalábbal A fluoreszenia időbeli változásának detektálása érzékeny fotodetektorral A jelenlévő molekulák száma kisi az ingadozás relatív értéke jelentős A fluoreszenia időfüggése: δf(t) G( τ ) = τ D A fluoreszenia ún időbeli autokorreláiós függvénye: δf ( t) δf ( t + τ ) F G () ~1/ N G(τ) diffúziós idő = T τ D δf ( t) δf ( t + τ ) dt ~1/D F t A fluktuáió analízis elve Milyen kölsk lsönhatások vizsgálhat lhatók? A fluoreszensen jelölt molekula fotonokat emittál, míg a lézer által megvilágított térfogatelemen áthalad Az időegység alatt kibosátott fotonok száma függ a molekulaszámtól (kon) a kvantumhatásfoktól instrumentális paraméterektől Az ingadozás kinetikája függ a diffúziós állandótól a megvilágított térfogatelem nagyságától Fehérje DNS Antigén antitest kötődés Nukleinsavak hibridizáiója Jelölt oligonukleotid próba Tesztelt nukleinsav szekvenia Reeptor ligandum kötődés

9 Ozmózis Ozmózis: oldószermolekulák termodinamikai egyensúlya féligáteresztő hártya két oldalán Csak a térrész tartalmaz (a membránon átjutni képtelen) oldott molekulákat Az oldószer konentráiója (és kémiai poteniálja) az 1-es térrészben magasabb Oldószer áramlás a -es térrész felé p megnő μ megnő A kialakuló egyensúly neve ozmotikus egyensúly (ozmózis: behatolás ) 1 h oldószer oldószer oldat van t Hoff egyenlet μ v,1 = μ (p,t) + RT lnx v,1 + V v (p 1 -p ) μ v, = μ (p,t) + RT lnx v, + V v (p -p ) μ : tiszta oldószer normál kémiai poteniálja μ v,i : oldószer kém pot-ja az 1 és térrészben X v,i : oldószer móltörtje, V v : moláris térfogata π = Egyensúly feltétele: μ v,1 = μ v, p = p1 RT π: ozmózisnyomás oldott anyag konentráiója Az ozmózisnyomás orvosi, biológiai jelentősége Sejt ozmotikus egyensúlyának feltétele: a külső és belső ozmózisnyomás megegyezzen A vér ozmolalitása: kb 3 milliosm (ozmózisnyomása π~7, atm) alasonyabb ozmolalitású oldat: hipotóniás magasabb: hipertóniás a vérrel izotóniás pl 55% (3M) glükóz 87% (15M) NaCl, fiziológiás sóoldat vvt hipotóniás közegben duzzadás, kipukkanás (hemolízis) hipertóniás közegben zsugorodás (plazmolízis) Ozmózis Hipertóniás oldatok Oldat ozmózisnyomása, ha az oldatban több ozmotikusan aktív anyag is jelen van: π = RT i sak a konentráió számít, az anyagi minőség közömbös disszoiáló anyagoknál a részeskék összkonentráióját kell figyelembe venni Ozmolalitás: az oldott anyagok összegzett konentráiója pl 1 mol/liter glükóz: 1 milliosm 1 mol/liter NaCl (Na +, Cl - ): 1 = milliosm 1 mm glükóz oldat ozmózisnyomása: π = RT = 81 dm 3 atm/(m K) 93 K 1M = 4 atm i Növények A gyökér vízfelvétele, a turgor létrejötte Gyógyítás Keserűsós borogatás Hashajtók: MgSO 4, Mgitrát (rosszul felszívódó sók) Ödémák kezelése hipertóniás infúzióval

10 Dialízis Dialízis: makromolekulák ozmózison alapuló szétválasztása Celofán: <1 kd-t enged át, vágó membránok Hemodialízis: kiszűri a véráramból az oldható salakanyagokat membrán nyomásszabályozók A Starling-effektus A Starling-effektus A vérplazma fehérjéi (albumin, globulinok, fibrinogének) képesek az ozmotikus nyomást szabályozni, kihatnak a szervezet vízháztartására Nyomásviszonyok a kapillárisban artériás vég vérplazma 35 Hgmm hidrosztatikai 15 Hgmm vénás vég vérplazma 5 Hgmm fehérjék ozm 5 Hgmm kötőszöveti folyadék Hgmm hidrosztatikai 1 Hgmm vérplazma Hgmm fehérjék ozm 3 Hgmm 8 Hgmm nettó nyomás 8 Hgmm dializáló oldat ultraszűrő vérpumpa vénás visszavezető ág Bal szívfél hibája: a tüdőkből a szívbe menő vénában pang a vér nő a nyomás a tüdő ereiben tüdő-ödéma Ödéma további okai: hipoproteinémia: (alasony fehérje-tartalmú étrend; májbetegség, vesegyulladás kevés albumin) tüdők B J szív test Jobb szívfél hibája: a testből a szívbe vezető vénákban pang a vér nyomásnövekedés az erekben végtagi ödéma Fordított ozmózis zis Ha az ozmózis ellen ható nyomás meghaladja az ozmotikus nyomást, az oldószer a hígabb oldat felé áramlik tiszta H O tengervíz sótalanítása