CMV-IgA-ELA Test PKS medac. Magyar 112-PKS-VPU/010708

Átírás

1 CMVIgAELA Test PKS medac Magyar PKSVPU/010708

2 GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel./Phone: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ RENDELÉSI CÍM Tel./Phone: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ PKSVPU/010708

3 CMVIgAELA Test PKS medac Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, cytomegalovirus (CMV) elleni IgA antitestek kimutatására Katalógusszám: 112PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA BEVEZETÉS A Cytomegalovirus (CMV) a humán patogén Herpesviridae családba tartozik, melyet dupla szálú DNS genom jellemez. Ezekre a vírusokra jellemzı, hogy latensen perzisztál a szervezetben az elsıdleges fertızés után. Ezért a vírus reaktivációja bizonyos körülmények között elıfordulhat. A CMV fertızés immunokompetens egyénekben rendszerint tünetmentes. Azokban az egyénekben, akik immunszuppresszáltak (pl. transzplantáltak, HIV fertızöttek, tumoros betegek, újszülöttek) komoly tünetek variációja észlelhetı. A CMV egyike a leggyakoribb patogéneknek prenatális fertızésekben, mely komoly rendellenességeket okozhat, szintén beleértve a késıi károsodásokat olyan gyerekekben, melyek tünetek nélkül születtek. Specifikus CMVIgA antitesteket mutattak ki transzplantált betegek szérumaiból és korreláltatták specifikus CMV IgM antitestekkel. Megállapították, hogy a CMV IgA az akut fertızés markere. A CMV specifikus IgA kimutatása kombinálva az antigen, illetve IgM kimutatással megnövekedett specificitáshoz vezet a transzplantált betegek CMV diagnózisában. 112PKSVPU/

4 A TESZT ELVE A lemezt antihumán IgAval vonták be. A mintában levı IgA szelektíven kötıdik a lemez falához. A CMV IgA specifikus antitestek kötıdnek a peroxidázzal jelzett CMV antigénhez. (AG = antigen, P = peroxidáz). Inkubáció a TMBszubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le. A teszt elınyei Nincs nemspecifikus reakció és nincs a reuma faktor által okozott hamis pozitív reakció. A magas IgG titer nem blokkolja az IgA antitesteket. A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetıvé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását. A törhetı mikrotiter lemez lehetıvé teszi a teszt gazdaságos felhasználását. Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerő ELISA készülékeken. 112PKSVPU/

5 A KIT TARTALMA Katalógusszám: 112PKS 1. MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk (kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhetı, Ualakú, kecske antihumán IgAval bevont, BSA és ph indikátor, felhasználásra kész. 2. KONTROLL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, kék színő, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 3. KONTROLL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, kék színő, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 4. WB Mosó puffer: 1 flakon, 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, ProClin TM 300 tartalmú. 5. VIRDIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, felhasználásra kész, ProClin TM 300 tartalmú. 6. ANTIGEN CMVIgAELA (Enzim jelzett antigén): 4 fiola, mindegyik 5,0 ml, liofilizált, FCSt tartalmaz, sárga színő, HRPvel konjugált. 7. TMB TMBszubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész. 8. STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H 2 SO 4 ), felhasználásra kész. 112PKSVPU/

6 1. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS Anyag/Reagens Állapot Tárolás Stabilitás Teszt kit bontatlan C lejárati idı végéig Mikrotiterlemez bontott C zacskóban 6 hét szárítószerrel Kontrollok bontott C 6 hét Mosó puffer hígított C 6 hét Minta hígító bontott C 6 hét CMVIgAELA feloldott C 5 nap TMBszubsztrát bontott C 6 hét Leállító oldat bontott C lejárati idı végéig Ne használjuk a reagenseket a lejárati idın túl. 2. SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK 2.1. Víz injekcióhoz (H 2 O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást Állítható mikropipetták Tiszta üveg, vagy mőanyag edények a mosópuffer hígításához Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó) Inkubátor, 37 ºC Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és nm szőrıkkel. 3. A REAGENSEK ELİKÉSZÍTÉSE A mérés megkezdése elıtt az összes komponenst szobahımérsékletőre kell hozni a kondenzáció elkerülése céljából. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. Megjegyzés: A mikrotiter lemez lyukai halvány zöld színőek. A lyukakban idınként elıforduló zöldesbarna elszínezıdést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítıképességét nem befolyásolja. 112PKSVPU/

7 3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minıségő vízzel (pl. 50 ml mosó puffert 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) elıforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 C) és/vagy szobahımérsékleten keveréssel CMVIgAELA A liofilizált CMVIgAELA konjugátumot oldjuk fel 5 ml minta hígítóban. Óvatosan keverjük és ügyeljünk arra, hogy a dugóba ragadt részecskék is feloldódjanak. A CMVIgAELA feloldás után sárga színő és felhasználásra kész. Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, CMVIgAELA) a különbözı gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a minta hígító, a mosó puffer, a TMBszubsztrát és a leállító oldat általában cserélhetı az összes Medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények csak a használati utasítás pontos betartása esetén nyerhetık. 4. MINTÁK 4.1. A teszt szérum minták vizsgálatára alkalmas A szérumok elıkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroroganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket A szérumokat 1:100 arányban hígítsuk a mintahígítóval. Titer meghatározáshoz további hígításokat készíthetünk. 5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a smítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, elımosás nem szükséges Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 µl hígítatlan mintát, negatív és pozitív kontrollt duplikátban a lyukakba. 112PKSVPU/

8 A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kékre változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahımérsékleten 30 percig nedves kamrában, illetve 60 percig 2 8 Con tarthatjuk Inkubáljuk a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 o Con nedves kamrában, vagy fóliával lezárva Oldjuk fel a CMVIgAELAt (ld. 3.3.) Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 µl mosópufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szőrıpapírra. Ne hagyjuk a lyukakat kiszáradni! Azonnal dolgozzuk fel! 5.6. Adjunk a CMVIgAELAt (sárga színő) minden lyukba (kivétel A1). 50 µl ELAt pipettázzunk manuális felhasználás esetén. Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 µl ELAt pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában elıforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerısítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban mőködı automatával való kompatibilitást ellenırizzük Inkubáljuk ismét a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 o Con nedves kamrában, vagy fóliával lezárva Az inkubáció után ismét mossuk a lemezt (ld. 5.5.) Adjunk 50 µl TMBszubsztrát oldatot minden lyukba (A1be is) és inkubáljuk 30 percig (± 2 perc) 37 o Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik Állítsuk le a reakciót 100 µl leállító oldattal minden lyukba (A1be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás elıtt tisztítsuk meg a mikrotiter lemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegıbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni. 112PKSVPU/

9 5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN Negatív kontroll Pozitív kontroll Minta Háttér (A1) Negatív kontroll 50 µl Pozitív kontroll 50 µl Minta 50 µl Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3 x 200 µl mosóoldattal CMVIgAELA 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3 x 200 µl mosóoldattal TMBsubsztrát 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Inkubáljuk 30 percig 37 C sötétben Leállító oldat 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Fotometrikus leolvasás 450 nmen (ref nm) *)Manuális/automatikus módszer (ld. 5.6.) 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG) Olvassuk le az OD értékeket 450 nmen (referencia hullámhossz nm). Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékbıl. Validitási kritériumok A negatív kontroll átlagos OD értéke < 0,150 legyen. A pozitív kontroll átlagos OD értéke > 0,600 legyen. Ismételjük meg a vizsgálatot, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak. Cutoff = negatív kontroll átlag OD értéke + 0,140 Szürke zóna = Cutoff ± 10 % 112PKSVPU/

10 6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE A szürke zóna alsó határánál kisebb OD értékő minták NEGATÍVnak tekintendık. A szürke zónába esı OD értékő minták KÉTESnek tekintendık. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal késıbb friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében. A szürke zóna felsı határánál nagyobb OD értékő minták POZITÍVnak tekintendık. Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal és további diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni. 59 potenciálisan keresztreagáló mintát vizsgáltak. Ezek a minták nem voltak reaktívak az IgA tesztben. A lipidek nagyon nagy koncentrációja bizonyos esetekben befolyásolhatja az eredményt. A Hemoglobin, vagy Bilirubin nagy koncentrációja nem befolyásolja az eredményeket. 7. TELJESÍTİKÉPESSÉG Az alábbi teljesítıképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. FAJLAGOSSÁG 300, véradóktól származó szérum mintát vizsgáltak a CMVIgAELA Test PKS medac teszttel. 296 mintát negatínak találtak. A többi 4 minta három közülük kétes, egy gyengén IgA reaktív erısen pozitív volt IgGre és egyik közülük IgMre is. Ugyanezt a 300 mintát megvizsgálták egy versenytárs IgA ELISAval. A másik tesztben 284 negatív, 2 kétes és 14 pozitív volt. 7.B. ÉRZÉKENYSÉG 105 szérumot találtak pozitívnak a fent említett referencia teszttel. 101 szérum poziív, 2 kétes, 2 negatív volt a CMVIgAELA Test PKS medac teszttel. A relatív érzékenység 96,2 %nak adódott. 112PKSVPU/

11 7.C. PONTOSSÁG Minta Teszten belüli szórás (n = 24) Minta Tesztek közötti szórás (n = 11) átlag SD VC (%) átlag SD VC (%) OD OD NC 0,047 0, NC 0,044 0, BC 0,341 0,014 4 BC 0,276 0, PC 1,601 0,047 3 PC 1,391 0,119 8 N 1 0,047 0, N 1 0,052 0, N 2 0,223 0,010 4 N 2 0,201 0, N 3 2,473 0,052 2 N 3 2,184 0,187 9 NC = negatív kontroll; BC = gyenge pozitív kontroll (a kit nem tartalmazza); PC = pozitív kontroll ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK A kereszt szennyezés elkerülése érdekében ne cseréljük fel a fiolákat és kupakjaikat. A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében. Használat után a reagenseket az elıírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében. Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekbıl, illetve gyártásból származó reagensekkel történı felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is). EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani. Az emberi eredető reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAgra, HIV1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erısen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredető reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertızıként kezeljük és az összes szükséges elıvigyázatossággal használjuk. 112PKSVPU/

12 MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendık. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és elıírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelı cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében. A kibocsátás dátuma: PKSVPU/

13 IRODALOM Braun, W., Hehr, B., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Serologische Diagnostik der Zytomegalie bei immunsupprimierten Patienten. AIDSForschung (AIFO), Heft 11, (1987). Braun, W., Weber, B., Moell, U., Hamann, A., Doerr, H. W.: Immunoglobulin A and M patterns to human cytomegalovirus during recurrent infection in patients with AIDS using a modified Western blot. J. Virol. Methods 43, 6576 (1993). Delacroix, D. L.: The human immunoglobulin A system, its vascular compartment. Thesis European Medical Press (1985). Doerr, H. W., Rentschler, M., Schleifer, G.: Serologic detection of active infections with human herpes viruses (CMV, EBV, HSV, VZV) diagnostic potential of IgA class and IgG subclassspecific antibodies. Infection 15, 9398 (1987). Engelhard, D., Weinberg, M., Or, R., Shaked, O., Naparstek, E., Haikin, H., Slavin, S., Sarov, I.: Immunoglobulins A, G and M to cytomegalovirus during recurrent infection in recipients of allogenic bone marrow transplantation. J. Infect. Dis. 163, (1991). Levy, E., Margalith, M., Sarov, B., Sarov, I., Rinaldo, C. R., Detels, R., Phair, J., Kaslow, R., Ginzburg, H., Saah, A. J.: Cytomegalovirus IgG and IgA serum antibodies in a study of HIV infection and HIV related diseases in homosexual men. J. Med. Virol. 35, (1991). Linde, G. A., Hammarström, L., Persson, M. A. et al.: Virusspecific antibody activity of different subclasses of immunoglobulins G and A in cytomegalovirus infections. Infect. Immun. 42, (1983). Merlino, C., Angeretti, A., Segoloni, G. P., Giacchino, F., Rossetti, M., Negro Ponzi, A.: CMVspecific polymeric and monomeric IgA antibodies in serum of renal transplant patients. Panminerva Med., Vol. 33, Nr. 4, (1991). Nielsen, L. N., Sorensen, I., Andersen, H. K.: Kinetics of specific immunoglobulins M, E, A, and G in congenital primary, and secondary cytomegalovirus infection studied by antibodycaptured enzymelinked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 26, (1988). Porath, A., Hanuka, N., Keynan, A., Sarov, I.: Virusspecific IgG, IgM, and IgA antibodies in cytomegalovirus mononucleosis patients as determined by immunoblotting technique. J. Med. Virol. 22, (1987). 112PKSVPU/

14 Rautenberg, P., Fischer, L., Tönnies, R., Franke, D.: Evaluation of a novel immunoglobulin A capture enzyme immunoassay for diagnosis of cytomegalovirus infection in renal and heart transplant recipients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, (1997). Sarov, I., SiqueiraLinhares, M., Chardonnet, Y., Levy, E., Aymard, M., Bosshard, S., Nord, E., Revillard, J. P.: Detection of specific IgA antibodies in serum of kidney transplant patients with recurrent cytomegalovirus infection. Intervirology 15, (1981). Sarov, I., Haikin, H.: Human cytomegalovirus specific IgA antibodies detected by immunoperoxidase assay in serum of patients with cytomegalovirus infections. J. Virol. Methods 6, (1983). Strand, O. A., Hoddewick, G. M.: The diagnostic significance of specific serum IgA detection in cytomegalovirus infections. Arch. Virol. 82, (1984). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U., Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or longterm human cytomegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA (1997). Torfason, E. G., Källänder, C. and Halonen, P.: Solidphase radioimmunoassay of serum IgG, IgM and IgA antibody to cytomegalovirus. J. Med. Virol. 7, 8596 (1981). Weber, B., Hamann, A., Ritt, B., Rabenau, H., Braun, W., Doerr, H. W. : Comparison of shell viral culture and serology for the diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompromised subjects. Clin. Investig. 70, (1992). Weber, B., Klinghardt, U., Lux, A., Braun, W., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Detection of neutralizing antibodies against human cytomegalovirus: influence of strain variation. J. Med. Virol. 40, 2834 (1993). 112PKSVPU/