Molekuláris biológiai diagnosztika alkalmazása

Átírás

1 Molekuláris biológiai diagnosztika alkalmazása (HIV, HCV, HBV szabad vírus mennyiség meghatározás) a napi rutin diagnosztikában Reichenberger Anna Mária, Dr. Sárvári Csilla Dr. Ujhelyi Eszter Fıvárosi Önkormányzat Egyesített Szent István és Szent László Kórház Rendelıintézet V. Fertızı Belgyógyászat, Immunológiai Laboratórium

2 PCR Polymerase Chain Reaction Polimeráz Lánc Reakció alig több mint egy évtizede fedezték fel és azóta széles kırben elterjedt vizsgálat

3

4 2007-tıl COBAS Amplicor real-time rendszer

5 Vizsgálati palettánk 2008-ban tovább bıvült A HIV-PCR-en kívül, 2008 februárjában a HCV, 2008 májusában a HBV szabad vírus mennyiség meghatározás is HIV bevezetésre került a napi HBV HCV diagnosztikába.

6 1 nagy csı vagy 2 kis csı EDTA-s vér szükséges

7 A mintákat 6 órán belül centrifugálni kell (1600 g, 20 perc)

8 µl-enként csavaros kupakos mőanyag csövekben -70 C on tároljuk

9 HIV, HBV HCV szobahı : maximum 1 nap nem tárolható 2-8 C : 5 nap 3 nap C : tartósan tárolható tartósan tárolható olvasztható : 5x 2x! RNS/DNS veszteség nélkül Az eredmény szempontjából legideálisabb 2 órán n belül lefagyasztani a centrifugált mintát

10 Ha a mintát t más m s intézm zménybıl l küldik, k a vérvv rvétel elıtt mindenképpen konzultáljanak ljanak a vizsgálatot végzı laboratóriummal! riummal! Mikor, hogyan történjen a minta levétele, szállítása

11 A PCR vizsgálatok eredményét nagyban befolyásolják: Mintavételi módszer Szállítás Feldolgozás Tárolás Betegfaktorok (kor/tünet megléte, a fertızés stádiuma )

12 Human Immunodeficiency Virus sejtmentes gömb alakú 100 nm átmérıjő RNS tartalmú vírus. Az AIDS kórokozója 100 nm

13 HIV Szerzett Immunhiányos tünetegyüttes HIV AIDS A fertızés átvihetı szexuális kontaktussal, fertızött vérrel vagy vérkészítményekkel, fertızött anyáról magzatra valamint anyatejjel.

14

15 ٠a vírus szaporodása és kiürülése dinamikus folyamat ٠a plazma viraemia szintje stabil

16 - HIV mennyiségi PCR (egyéb labor. Markerekkel együtt) a HIV-1 pozitív betegek progressziójára és antivirális monitorozására - Ferttızött anyák újszülötteinek vizsgálatára HIV AIDS

17 Hepatitisek 10 x könnyebben terjed, mint a HIV Második leggyakoribb májbetegségi halál ok Minden 12-dik ember hepatitis fertızött Fıleg fertızött vér útján terjed (i.v. drog, szex, tetoválás, piercing)

18 DNS vírus 42 nm

19 Hepatitis B vírus A 60-as évek óta lehet kimutatni 1981 óta van ellene oltás Nálunk Július óta kötelezı (14 éves korban oltanak) Vírushordozók aránya 0,5 1 % Krónikus májbetegségek legfıbb okozója millió krónikus beteg világszerte Évente 6 millió ember hal meg HBV szövıdményben

20

21 Egy szálú RNS vírus

22 HEPATITIS C vírus 1989-ben regisztrálták Poszt transzfúziós Hepatitisek %-áért felelıs 1992 óta szőrik a véradókat 70 %-ban alakul ki májbetegség a fertızötteknél Magyarországon embert regisztráltak Világszerte 170 millió fertızött Tünetmentes hosszú lappangási idı

23 A fertızöttek 70%-ánál alakul ki májbetegség Súlyos esetben májzsugor vagy akár májcarcinoma

24

25 20 hepatitis centrumban Folyamatosak a szőrések

26 A kétféle hepatitis évente több, mint másfél millió ember halálát okozza világszerte Védekezés: Hepatitis B ellen védıoltás Hepatitis C ellen odafigyelés

27 HBV és HCV PCR vizsgálatok: Egyéb vírusspecifikus markerekkel együtt - segít a diagnózis felállításában - krónikus betegek terápiás gondozásában

28 Kvantitatív HCV PCR Interferon (IF) terápia monitorozása Monogram 1. vizsg. 2. vizsg. 3. vizsg. megjegyzés V. A IU/ml RNS nem detektálható Eredményes E. A IU/ml 48 RNS nem detektálható terápia G. K Interferon (IF) IU/ml IU/ml Kezelés Cs. B a PCR alapján IU/ml IU/ml IU/ml eredménytelen G. L IU/ml M.H.A. Méréshatár alatt Elviekben abba kéne B. Z IU/ml IU/ml 914 IU/ml hagyni az IF terápiát

29 A PCR vizsgálat

30

31

32

33 AmpliPrep feltöltése reagensekkel és egyéb kellékekkel

34

35

36 Az automata 3 fı lépése Minta DNS/RNS izolálása AmpliPrep reverz transzkripció TaqMan48 Amplifikálás, jelölt próba mérése TaqMan48

37 AmpliPrep/TaqMan teszt Valós idejő PCR technológia Adott számú ciklus Ciklusonként növekvı jelzıfesték intenzitás Vizsgált vírus független azonosítása Qualitatív és quantitatív eredmény egyszerre

38 Target Not Detected - RNS/DNS nem kimutatható Méréshatár alatt - van kimutatható, de nem mérhetı vírusmennyiség a mintában Mért érték A méréstartomány : HIV esetében cp/ml HCV esetében IU/ml HBV esetében IU/ml Méréshatár felett - Az adott értékhatár feletti vírusmennyiség

39 A vizsgálatok gyakoriságát protokoll írja elı, amelyet a minden évben megtartott consensus meeting határoz meg. (lsd Infektológia 2008 decemberi száma)

40 összesen 6079 PCR a Real-time rendszer bevezetése - óta: 2007-ben összesen: HIV (februártól) HCV (májustól) HBV ban Összesen: HIV HCV HBV ben Összesen: 2029 (augusztus 25-ig)

41 A negatív szerológiai eredményt adó minták aránya a kért PCR vizsgálatokhoz képest HCV PCR kérés HCV szerológia negatív HBV PCR kérés HBV szerológia negatív 0 14 = 7% HBV HCV 38 = 5%

42 Rutinszerően elvégezzük a konfirmáló ELISA vizsgálatot az igen költséges PCR vizsgálat elıtt

43 Vizsgálat kérések emelkedése havi lebontásban HIV PCR HCV PCR I. III. V. VII. IX. XI HBV PCR I. III. V. VII. IX. XI I. III. V. VII. IX. XI.

44

45