Tartalomjegyzék 1. RENDELTETÉS 2. HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ 3. ÖSSZEFOGLALÁS ÉS MAGYARÁZAT 4. A MÉRÉS ELVE 5. REAGENSEK

Átírás

1 PLATELIA ASPERGILLUS Ag TESZT A Platelia Aspergillus Ag immuno-enzimatikus szendvics mikrolemez vizsgálat az aspergillus galaktomannan antigén kimutatására szérumban és bal folyadékban (bronchoalveolar lavage). Tartalomjegyzék 1. RENDELTETÉS 2. HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ 3. ÖSSZEFOGLALÁS ÉS MAGYARÁZAT 4. A MÉRÉS ELVE 5. REAGENSEK 6. FIGYELMEZETETÉSEK FELHASZNÁLÓK SZÁMÁRA 7. ÓVINTÉZKEDÉSEK FELHASZNÁLÓK SZÁMÁRA 8. A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE ÉS TÁROLÁSA 9. MINTAVÉTELEZÉS 1. ELJÁRÁS 11. MINŐSÉGELLENŐRZÉS (MEGFELELŐSÉGI SZEMPONTOK) 12. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE 13. AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI 14. VÁRHATÓ ÉRTÉKEK 15. SPECIÁLIS TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK 16. A GYÁRTÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉSE 17. BIBLIOGRÁFIA 1

2 1 RENDELTETÉS A Platelia Aspergillus Ag immunenzimes szendvics mikrolemez vizsgálat az Aspergillus galaktomannan antigén kimutatására szérum- és BAL (bronchus mosó folyadék = bronchoalveolar lavage) mintákban. 2 HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A Platelia Aspergillus Ag olyan teszt, amely egyéb diagnosztikai eljárásokkal együtt alkalmazva - pl. mikrobiológiai tenyészet, biopszia minták szövettani vizsgálata, röntgenvizsgálatok - az invazív Aspergillosis diagnózisára használható. 3 ÖSSZEFOGLALÁS ÉS MAGYARÁZAT Aspergillus fertőzések általában a környezetben jelenlévő Aspergillus spórák belégzése következtében alakulnak ki. A legkomolyabb fertőzéseket jelentő invazív formák megjelenése egyre gyakoribbá vált az utóbbi 1 évben. Ezek elsősorban neutropéniás betegeknél (rákellenes kezelés után), immunszupresszánsokkal (szervátültetés, különösen csontvelő átültetés), vagy kortikoszteroiddal kezelt betegeknél fordulnak elő 1. Az Aspergillus ritkán izolálható hemokultúrából. A diagnózis gyakran nem-specifikus diagnosztikára vagy radiológiai adatokra alapoz (klinikai tünetek, CT letapogatás, mellkasi röntgen, stb.). Jelenleg az oldható galaktomannan antigén jelenlétének vizsgálata a szérumban olyan szerológiai módszernek tűnik, amely segíthet az invazív Aspergillosis diagnózisában 9, 12, 23, 54, 62. Ezen kívül az átültetett szerveket befogadók populációjánál előnyösnek bizonyult a galaktomannan antigén kimutatása 8, 17, 18. BAL mintából az invazív Aspergillosis diagnózisánál 4 A MÉRÉS ELVE 45 A Platelia Aspergillus Ag, egylépéses immunoenzimatikus szendvics mikrolemez vizsgálat a galaktomannan kimutatására humán szérumban és BAL mintákban. A vizsgálat EBA-2 monoklonális patkány antitesteket használ, amelyek az Aspergillus galaktomannan ellen irányulnak, és jellemzésük már megjelent a szakirodalomban 25, 46. Ez a monoklonális antitest használatos egyrészt (1) a mikrolemez tesztlyukainak bevonására és az antigén megkötésére, másrészt (2) az érzékenyített mikrolemezhez kötődő antigén (konjugátum-reagens: peroxidázzal jelzett monoklonális antitestek) kimutatására. A vizsgálatot esetleg zavaró immunkomplexek disszociálása és a szérum fehérjék kicsapása érdekében, a szérum vagy BAL mintákat EDTA jelenlétében hőkezeljük 24. A kezelt mintákat és konjugátumot a monoklonális antitestekkel bevont tesztlyukakba mérjük, majd inkubáljuk. A galaktomannan antigén jelenlétében monoklonális antitest - galaktomannan - monoklonális antitest/peroxidáz komplex jön létre. A csíkokról mosással eltávolítjuk a nem kötődött anyagot. Ezután szubsztrátum oldatot adunk hozzá, amely kék színreakciót ad a tesztlyukakban megkötött komplexekkel. Az enzimreakciót sav hozzáadásával állítjuk le, amely kékről, sárgára változtatja a színt. A minták és kontrollok optikai abszorbanciáját 45 és 62/63nm hullámhosszra állított spektrofotométerrel mérjük. 5 REAGENSEK Platelia Aspergillus Ag: cikkszám (96 teszt) A készletet 2-8 C hőmérsékleten tároljuk. Használat előtt, legalább 3 perccel, a reagenseket szobahőmérsékletre kell melegíteni (18-25 C). Használat után azonnal hűtsük vissza a reagenseket 2-8 C-ra. A felhasználatlan csíkokat/lemezeket helyezzük vissza a tasakba és zárjuk vissza. Ne távolítsuk el a szárítószert. Hígítás után a higított mosóoldatot 14 napig lehet tárolni 2-3 C-on. Az összes többi reagens, kivéve a koncentrált mosóoldat (R2) és a leállító oldat (R1) a felnyitást követő 8 héten keresztül használható. A koncentrált mosóoldat (R2) és a leállító oldat (R1) a felnyitás után a lejárati időig stabil. A reagensek mennyisége elegendő 96 vizsgálat, maximum 9 menetben történő elvégzéséhez. R1 R2 R3 Komponens Tartalom Mennyiség Microplate Concentrated Washing Solution (2x) Negative Control Serum Mikrolemez: - 96 lyuk (12 csík 8 lyukkal egyenként) anti-galaktomannan monoklonális ellenanyaggal bevonva - A csíkok 85 -el jelölve Tömény mosóoldat (2x): - Tris NaCl puffer (ph 7,4) - 2% Tween 2 - Tartósítószer: <1,5% ProClin TM 3 Negatív kontrollszérum: - Humán negatív szérum - Negatív az anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antitestekre és a HBs Ag-ra - Tartósítószer: <1,5% ProClin TM 3 1 lemez / 12 x 8 lyuk 1 x 7ml 2 x 1,7ml 2

3 Komponens Tartalom Mennyiség R4 R5 R6 R7 R9 R1 Cut-off Control Serum Posotive Control Serum Conjugate Sample Treatment Solution Chromogogen TMB Solution Stopping solution Cut-off kontrollszérum: - Galaktomannant tartalmazó humán szérum - Negatív az anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antitestekre és a HBs Ag-ra - Tartósítószer: <1,5% ProClin TM 3 Pozitív kontrollszérum: - Galaktomannant tartalmazó humán szérum - Negatív az anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti-hcv antitestekre és a HBs Ag-ra - Tartósítószer: <1,5% ProClin TM 3 Konjugátum (használatra kész): - Anti-galaktomannan monoklonális antitest / peroxidázzal jelölve - Tartósítószer: <1,5% ProClin TM 3 Mintakezelő oldat (felhasználásra kész): - EDTA savoldat Kromogén TMB oldat (felhasználásra kész): - 3,3,5,5 -tetrametilbenzidin (<,1%) - H 2 O 2 (<1, %) Leállító oldat (felhasználásra kész): - 1 N kénsavoldat (H 2 SO 4 ) 2 x 1,7ml 2 x 1,7ml 1 x 8 ml 1 x 13ml 1 x 28ml 1 x 28ml Plate sealers - Öntapadó fólia mikrolemezek számára 1 x 8 lap Megjegyzés: A TMB (3,3,5,5 -tetrametilbenzidin) a peroxidáz nem rákkeltő és nem mutagén kromogénje. 6 FIGYELMEZTETÉSEK FELHASZNÁLÓK SZÁMÁRA 1. Kizárólag In vitro diagnosztikai felhasználásra. 2. Csak szakember kezéhez. 3. Nem ajánlott a készlet alkalmazása humán szérum illetve BAL mintáktól eltérő mintákra. 4. A pozitív kontroll, Cut-Off kontroll, és negatív kontroll, hővel inaktivált, humán szérumokat CE jelzett tesztekkel megvizsgálták és ezek negatívnak bizonyultak anti-hiv-1, anti-hiv-2, és anti-hcv antitestek, valamint HBs antigén tekintetében. Mindazonáltal, mivel egyetlen módszer sem tudja teljesen szavatolni a fertőző mikroorganizmusok hiányát, minden reagenst, mint potenciálisan fertőzőt kell kezelni. Minden vizsgálatot a vér által közvetíthető kórokozók esetében ajánlott OSHA előírások (2.szintű biológiai biztonság) betartásával kell elvégezni. 5. A készlet reagenseivel és a betegmintákkal való munka során viseljünk védőruházatot és eldobható kesztyűt és kezeljük a reagenseket a Helyes Laboratóriumi Gyakorlat (GLP) előírásainak megfelelően. A vizsgálat után alaposan mossunk kezet. 6. Ne pipettázzunk szájjal. 7. Ne dohányozzunk, igyunk, vagy együnk olyan helyen, ahol mintákkal, vagy a készlet reagenseivel dolgozunk. 8. Kerüljük a minták és mintákat tartalmazó oldatok kifröccsenését. 9. A kiömlött savmentes biológiai terméket alapos letörléssel és hatásos fertőtlenítőszer használatával távolítsuk el. Alkalmazható fertőtlenítőszerek többek között a 1% hypo (,5% nátrium-hipoklorit oldat), a 7%-os etanol, vagy,5% Wescodyne oldatokat. A savtartalmú kiömléseket szárazra kell törölni, illetve nátrium-bikarbonáttal kell semlegesíteni, majd valamelyik fenti fertőtlenítőszerrel eltávolítani. A kiömlések feltörlésére használt anyagokat biológiailag veszélyes hulladékként kell kezelni. FIGYELEM: hypo-tartalmú oldatokat nem szabad autoklávba helyezni. 1. A savat tartalmazó szennyezőanyagokat megfelelő módon fel kell itatni (törölni) vagy nátrium-bikarbonáttal semlegesíteni, a területet pedig leöblíteni majd szárazra törölni; ha veszélyes biológiai anyagot tartalmazott, törölje fel a területet kémiai fertőtlenítőszerrel. 11. A vizsgálatban használt minden mintát és anyagot úgy kell ártalmatlanítani, mintha fertőző anyagot tartalmazna. A megsemmisítés során be kell tartani a hulladékmegsemmisítési előírásokat. 12. FIGYELMEZTETÉS: Az EU és az Egyesült Államok jogszabályozó követelményei alapján egyes reagensek tartalmaznak ProClin TM 3-at < 1,5%. Xi irritáló hatású R43* : Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. S *: Ne lélegezze be a párát/permetet. Kerülje a bőrrel való érintkezést. Megfelelő védőkesztyűt kell viselni. Az anyagot és a tároló edényét veszélyes hulladékként kell kezelni. 3

4 * Risk (R) = kockázati és Safety (S)= biztonsági mondatok (21/59/EC) speciális információk a veszélyes anyagok kezeléséhez. C-Maró Az Egyesült Államok jogszabályozó követelményei alapján az 1,N kénsav (H 2 SO 4 ), leállító oldat súlyosan irritáló vagy maró hatással van a bőrre és a szemre, attól függően, milyen mértékben és mennyi ideig van az anyagnak kitéve; a nagyobb mértékű expozíció szemkárosodást okozhat, beleértve a tartós látáskárosodást. Ha az anyag a szembe kerül, bő vízzel mossik ki, és kérjünk orvosi segítséget. Tartsuk távol erős bázisoktól vagy redukálószerektől; ne öntsünk vizet vagy fehérítőszert ebbe a komponensbe. Az ebből az anyagból származó hulladék veszélyes savas hulladéknak minősül, ugyanakkor, ha a helyi, regionális, nemzeti vagy nemzetközi szabályozás megengedi, semlegesíteni lehet 6-8 ph-ra, ami lehetővé teszi a nem veszélyes hulladékként való kezelését, amennyiben vannak erre képzett szakemberek és hozzá való felszerelés. 13. A biztonsági adatlap (Material Safety Data Sheet=MSDS) kérésre beszerezhető vagy letölthető a weboldalról. 7 ÓVINTÉZKEDÉSEK FELHASZNÁLÓK SZÁMÁRA 1. AZ ISMERETELEN KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT TÁROLT FAGYASZTOTT SZÉRUM ÉS BAL MINTÁK TÉVES POZITÍV EREDMÉNYEKRE VEZETHETNEK, GOMBÁKKAL, ILLETVE BAKTÉRIUMOKKAL VALÓ FERTŐZÉS LEHETŐSÉGE MIATT. 2. Ne használjuk a készletet vagy reagenseit a megadott lejárati dátum után. 3. Ne keverjünk különböző gyártási tételszámmal rendelkező készletből származó reagenseket, kivéve a mosóoldatot (R2, azonosító*: 2x zöld színű), a kromogént (R9 azonosító*: TMB türkizszínű) és a leállító oldatot (R1, azonosító*:1n piros színű), feltéve, hogy ezek a reagensek pontosan egyenértékűek, és ugyanaz a gyártási tételszámot használják egy adott vizsgálat lefolyásakor. *a fiola címkéjén MEGYJEGYZÉS: Az (R2, 2x-os zölddel jelölt*) mosóoldat nem keverhető össze az (R2 1x-es kékkel jelölt*) mosóoldattal, amely megtalálható a Bio-Rad reagens készleteiben. * a fiola címkéjén 4. Használat előtt, legalább 3 percig kell hagyni szobahőmérsékletre melegedni a reagenseket. 5. Alaposan rázzunk fel minden reagenst a használat előtt 6. Rázzuk fel alaposan a mosóoldalt-koncentrátumot (R2) mielőtt elkészítjük a higított mosóoldatot, ügyelve arra, hogy elkerüljük a mikrobiális szennyezést. 7. Ne végezzük a vizsgálatot reaktív gőzök (savak, lúgok, aldehidek) vagy por jelenlétében, mivel ezek befolyásolhatják a konjugátum enzimaktivitását. 8. A kontrollok és minták kézi pipettázásakor az átvitel megelőzése érdekében minden mintához külön pipettahegyet használjunk. 9. A tesztlyukak megfelelő mosásának a biztosításához tartsuk be az ajánlott mosási ciklusok számát, és biztosítsuk minden tesztlyuk teljes feltöltését, majd teljes ürítését. A mosást kézzel, mosóflakonnal nem szabad végezni. 1. Ne hagyjuk kiszáradni a mikrolemezt a mosási ciklus befejezése és a reagensek bemérése között. 11. Ne használjuk ugyanazt a flakont a konjugátum és szubsztrátum oldatokhoz. 12. Ne hagyjuk, hogy a konjugátum vagy kromogén-szubsztrát reakcióoldatok fémekkel, vagy fémes ionokkal érintkezzenek. 13. Ne tegyük ki a kromogén-szubsztrát reakcióoldatot erős fény hatásának a tárolás vagy inkubálás ideje alatt. Ne hagyjuk, hogy a kromogén oldat oxidálószerrel érintkezzen. 14. Kerüljük a leállító oldat érintkezését bármilyen oxidálószerrel. Ne hagyjuk, hogy a leállító oldat fémekkel, vagy fémes ionokkal érintkezzen. 15. Használjunk tiszta, pormentes anyagokat (csövek, hegyek, flakonok, stb.), hogy minimalizáljuk a környezeti Aspergillus spórákkal való befertőződés lehetőségét. Mivel a galaktomannan termostabil, az anyag sterilizálása nem szavatolja a szennyező antigéntől való mentességet. Legelőnyösebb a pirogénmentes anyagok használata, de megfelelő óvintézkedések mellett szokványos anyagok alkalmazhatók. 16. Az oldatokat (szérumok, BAL minták, kezelőoldat, konjugátum) és nyitott edényeket (lemezek, csövek, pipetták) csak a lehető legrövidebb ideig hagyjuk szabad levegőn. 17. Ne öntsük vissza az eredeti flakonba a felhasználatlan konjugátumot. 18. A kromogén-szubsztrát reakcióoldatnak színtelennek kell lennie. Kék szín megjelenése a hígítás után azt jelzi, hogy a reagens szennyezett és nem szabad felhasználni. Dobjuk ki, és készítsünk friss reagenst. 8 A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE ÉS TÁROLÁSA Tesztlyuk-csíkokat tartalmazó lemez (R1) Minden 12 csíkot tartalmazó keret tasakba van csomagolva. Vágjuk fel a tasakot ollóval a forrasztás alatt. Nyissuk ki a tasakot, és vegyük ki a keretet. Tegyük a használatlan csíkokat tartalmazó keretet vissza az eredeti tasakba. Gondosan zárjuk vissza a tasakot, és tegyük +2-8 C-os helyre. A vákuumcsomagolás felbontása után, a +2-8 C-on, gondosan visszazárt eredeti tasakjukban tárolt csíkok 8 hétig őrzik meg minőségüket. Ellenőrizzük, hogy van-e még a tasakban szárítószer. 4

5 Mosóoldat (R2) Készítsük el a mosóoldatot, egy rész tömény mosóoldatot 19 rész steril ioncserélt vagy desztillált vízhez adva. Az elkészített mosóoldatot 14 napig lehet tárolni 2-3 C hőmérsékleten. Készítsünk a teljes vizsgálathoz elegendő mosóoldatot (8 ml egy csíkhoz: 4 ml R ml desztillált víz). Felnyitás után a tömény mosóoldatot +2-3 C hőmérsékleten kell tárolni, védve a fertőződéstől, így stabil marad a címkén látható lejárati dátumig. Negatív kontroll szérum (R3), Cut-off kontroll szérum (R4) és Pozitív kontroll szérum (R5) A kontrollokat és a mintákat egyaránt mintakezelő oldattal (R7) kell hőkezelni, azért, hogy azonos körülmények között vizsgálhassuk őket. A reagensek felbontás után, +2-8 C-on tárolva, védve a szennyeződésektől, 8 hétig őrzik meg minőségüket. Konjugátum (R6), mintakezelő oldat (R7) kromogén: TMB-oldat (R9) Ezek a reagensek használatra készek. A reagensek felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a védve a szennyeződésektől, 8 hétig őrzik meg minőségüket. Leállító oldat (R1) Ez a reagens használatra kész. A reagensek felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a védve a szennyeződésektől, a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg minőségét 9 MINTAVÉTELEZÉS A vizsgálatot a szérumon vagy BAL-on végezhetjük. I. SZÉRUM Vegyük le a vérmintákat a szabvány laboratóriumi eljárásoknak megfelelően. A szérum minták nem lehetnek gomba spórákkal, illetve baktériumokkal fertőzöttek. A mintákat lezárt csövekben, a levegőtől védve kell szállítani és tárolni. A felbontatlan mintákat a vizsgálat előtt 2-8 C hőmérsékleten legfeljebb 5 napig lehet tárolni. Az első felbontás után a minták a vizsgálat előtt 2-8 C hőmérsékleten 48 órát tárolhatók. Hosszabb tárolás esetén a szérumot -7 C hőmérsékletre kell fagyasztani. A szérum mintákat maximum 4 fagyasztási / kiolvasztási ciklusnak lehet alávetni. Az előzőleg lefagyasztott mintákat alaposan meg kell keverni a kiolvasztás után és a vizsgálat előtt. Az eredményeket nem befolyásolják a 2mg/l bilirubin tartalmú minták, lipémiás minták, amelyek 2g/l triolein (triglicerid) egyenértékét tartalmazzák vagy olyan hemolizált minták, amelyek 5 mg/l hemoglobint tartalmaznak. Nem vizsgáltuk az albuminfelesleg kölcsönhatásait. Ne távolítsuk el a komplementet a szérumokból. II. BAL Gyűjtsünk BAL mintákat a szabványos laboratóriumi eljárásoknak megfelelően. A BAL mintákat steril sóoldatban kell gyűjteni és hígítatlan mintákon (ahogyan vannak) kell vizsgálni, vagy a (1 -res fordulatszámmal 1 percen át) centrifugált minták felülúszóin, a 1. szakasznak megfelelő kezelés megkezdése előtt. A BAL mintáknak mentesnek kell lenni gomba- és/vagy baktériumfertőzéstől. A mintákat lezárt csövekben, levegőtől elzártan szállítsuk és tároljuk. Az első felbontás után a mintákat 2-8 o C-on maximum 24 óráig lehet tárolni. Hosszabb tároláshoz, a BAL mintákat le kell fagyasztani (-2 C vagy alacsonyabb hőmérsékletre) maximum 5 hónapig. A BAL mintákat maximum 4 alkalommal lehet lefagyasztani/felolvasztani. A lefagyasztott, majd felolvasztott mintákat a vizsgálat előtt alaposan össze kell keverni. 1 ELJÁRÁS A készlettel szállított reagensek Lásd a REAGENSEK fejezetet. Szükséges de nem szállított anyagok 1. Steril desztillált vagy ioncserélt víz, a mosóoldat hígításához. 2. Papírtörlő. 3. Eldobható védőkesztyű. 4. Védőszemüvegek. 5. Nátrium-hipoklorit (hypo) és nátrium-bikarbonát. 6. Egy vagy többcsatornás pipetták, állítható vagy fix térfogatú, amelyek 5µl, 1µl, 3µl, és 1µl térfogatok bemérésére alkalmasak. 7. 1,5ml polipropilén mikrocentrifuga csövek, légmentesen záró dugóval, amelyek elviselik a 12 C (fűtő) vagy 1 C (forrásban lévő vízfürdő) hőmérsékletet. - Csavaros kupakú csövek: 1,5ml kúpos csövek, Bio-Rad kat. sz vagy ezzel egyenértékű. VAGY - Pattintós kupakú csövek: EZ Micro Test Tubes, 1,5ml, Bio-Rad kat. sz vagy ezzel egyenértékű. 5

6 - Mikrocső kupakzáras (az Egyesült Államokban: Fischer Scientific katalógus # NC ) vagy ezzel egyenértékű, az Egyesült Államokon kívül: VWR katalógus # 6541 vagy ezzel egyenértékű). Ezek a zárak biztonságosan lezárják a bepattintott kupakos csöveket, megelőzve a kupakok felnyílását a hőmérséklet és nyomásjellemzők változása során, és a csöveket könnyen kiemelhetővé teszik a fűtőblokkból vagy a forrásban lévő vízfürdőből. 8. Laboratóriumi asztali centrifuga az 1,5ml-es polipropilén csövek számára, amely alkalmas a 1 g gyorsulásra (Brinkman katalógus # vagy VWR Scientific katalógus # vagy ezekkel egyenértékű). 9. Ha fűtőblokkot használunk a szérum/bal minták kezelésére: - Fűtőblokk. A következő fűtőblokk modellek javasoltak: - Egyblokkos modell: Grant Cat. # QBD-1L - az Egyesült Államokon kívül: Grant katalógus # QBD1 forgalmazza a VWR # katalógusszám alatt) - Kétblokkos modell: Grant katalógus # QBD-2L 2L az Egyesült Államokon kívül: Grant katalógus # QBD2 forgalmazza a VWR # katalógusszám alatt) - Blokkok fűtőblokkokhoz: mindkét fűtőblokkot (QBD-1 L, QBD1 és QBD-2L, QBD2) a Grant blokkkal együtt kell használni: katalógus # QB-E1 az Egyesült Államokon kívül forgalmazza a VWR a # katalógusszámmal. Ha vízfürdőt szeretnénk használni a szérum/bal minták kezeléséhez: - Kerek, lebegő mikro-centrifuga állvány 1L űrtartalmú főzőpohárnak (az Egyesült Államokban: VWR Scientific katalógus # vagy Nalgene katalógus # vagy ezekkel egyenértékű). - 1 C-os vízfürdő. 1. Vortex-keverő. 11. Mikrolemez inkubátor 37 ± 1 C hőmérsékleten. 12. Félautomata vagy automata mikrolemez mosó. 13. Mikrolemez leolvasó, 45nm és 62/63nm szűrőkkel felszerelve. Megjegyzések az eljárással kapcsolatban A vizsgálat eredményének validálásához, minden tesztsorozatban vizsgálni kell a negatív, a pozitív, és a Cut-Off kontrollokat. A Szérum/BAL kezelése Minden kontrollszérumnál: a vizsgált mintákkal egyszerre kell tesztelni a negatív (R3), Cut-Off (R4) és pozitív (R5) kontrollokat: 1. Pipettázzunk 3µl térfogatot minden szérum/bal mintából és kontrollszérumból külön 1,5ml polipropilén csövekbe. 2. Adjunk 1µl mintakezelő oldatot (R7) minden csőhöz. 3. Alaposan keverjük meg a csöveket rázással vagy vortex keverővel. Szorosan zárjuk le a csövet, hogy ne nyíljon ki melegítés közben. Fűtőblokk használata esetén: 4. Melegítsük a csöveket 6 percig fűtőblokkban 12 o C hőmérsékleten. A csöveket csak akkor kell a blokkba helyezni, amikor ez már elérte az ajánlott hőmérsékletet.(*) VAGY Vízfürdő használata esetén: Ha vízfürdőt használunk: melegítsük a csöveket 3 percig fűtőblokkban 1 o C hőmérsékleten. (*) 5. Óvatosan távolítsuk el a forró csöveket a fűtőblokkból vagy forrásban lévő vízfürdőből, és helyezzük a centrifugába. Centrifugáljuk a csöveket 1 g gyorsuláson 1 percig. A felülúszót használjuk a galaktomannan antigén kimutatására. 6. A felülúszó vizsgálatához a következő eljárást kell alkalmazni. Elkészítés után a felülúszót el lehet távolítani és 2-8 C hőmérsékleten lehet tárolni legfeljebb 48 órát a vizsgálat előtt. Ha az eredmények a vizsgálat megismétlését igénylik, új szérum mintát kell használni a vizsgálathoz. (*) A vizsgálat sikere érdekében, szigorúan be kell tartani az előírt hőmérsékletet, időhatárokat és ajánlott anyagok alkalmazását. Ne alapozzunk a készülék által kijelzett hőmérsékletre, ásványolajjal töltött centrifugacsőbe illesztett kalibrált hőmérővel ellenőrizzük, hogy a hőmérséklet kielégíti a követelményeket: vízfürdő esetében 1 C-nak, fűtőblokk esetében 12 C-nak kell lennie a cső belsejében. EIA eljárás Szigorúan tartsuk be az ajánlott protokollt. Tartsuk be a Helyes Laboratóriumi Gyakorlat irányelveit. 1. Használat előtt, legalább 3 percet kell hagyni szobahőmérsékletre (18-25 C) melegedni a reagenseket. 2. Készítsük el a mosóoldatot. 3. Készítsünk diagramot a szérumok/bal minták és kontrollok azonosítására a mikrolemezen. Használjunk egy tesztlyukat a negatív kontrollszérumhoz (R3), két tesztlyukat a Cut-Off kontrollszérumhoz (R4), és egy tesztlyukat a pozitív kontrollszérumhoz (R5). 6

7 A R5 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R3 S8 E S1 S9 F S2 S1 G S3 S11 H S4 S12 4. Távolítsuk el a lemeztartót és a tesztlyuk-csíkokat (R1) a lemez tasakjából. A felhasználatlan csíkokat helyezzük vissza a szárítószert tartalmazó tasakba, és zárjuk vissza a tasakot. 5. Használat előtt, felfordítással keverjük meg a konjugátum flakont (R6). Mérjünk 5µl konjugátumot (R6) minden tesztlyukba. Ezután mérjünk minden tesztlyukba 5 µl kezelt szérum/bal felülúszót, a fentiekben leírtaknak megfelelően. Ne mérjük be a tesztlyukakba a szérum/bal mintákat a konjugátum előtt. 6. A párolgás megelőzése érdekében fedjük le a lemezt öntapadós fóliával, vagy mással, biztosítva a teljes felület vízhatlan lefedését. 7. Inkubáljuk a mikrolemezt száraz mikrolemez inkubátorban 9 ± 5 percig 37 C (± 1 C) hőmérsékleten. 8. Távolítsuk el a fóliát. Szívjuk ki a tesztlyuk tartalmát hulladéktartályba (amely nátrium-hipokloritot tartalmaz). Mossuk a lemezt 5x mikrolemez mosóval, legalább 8µl mosóoldattal. Az utolsó mosás után fordítsuk meg a mikrolemezt és az ottmaradt folyadék eltávolításához, gyengéden ütögessük papírtörlőhöz. 9. Gyorsan mérjünk 2µl kromogén-szubsztrát reakcióoldatot (R9) minden tesztlyukba, kerülve az erős fényt. 1. Inkubáljuk a mikrolemezt 3 ± 5 percig sötétben és szobahőmérsékleten (18-25 C). Ennek az inkubációs lépésnek az ideje alatt ne használjunk öntapadó fóliát. 11. Mérjünk 1µl leállító oldatot (R1) minden tesztlyukba, ugyanabban a sorrendben, amelyet a szubsztrátum oldatnál alkalmaztunk. Jól keverjük össze. 12. Alaposan töröljük le minden lemez alját. 13. Olvassuk le minden tesztlyuk optikai denzitását (abszorbancia) 45nm hullámhosszon (referenciaszűrő: 62/63nm). A mikrolemezeket a leállító oldat bemérése után 3 percen belül kell leolvasni. 11 MINŐSÉGELLENŐRZÉS (MEGFELELŐSÉGI SZEMPONTOK) Cut-Off kontroll: Minden Cut-Off kontrollszérum OD értéke legyen,3 és,8 Pozitív kontroll: A pozitív kontrollszérum indexe nagyobb kell hogy legyen, mint 1,5. Pozitív kontroll (R5) OD I = > 1,5 Cut-Off kontroll átlag OD Negatív kontroll: A negatív kontrollszérum indexe kisebb kell hogy legyen, mint,4. Negatív kontroll (R3) OD I = <,4 Cut-Off kontroll OD átlag Amennyiben valamelyik kontroll nem felel meg a fenti megfelelőségi szempontoknak, a vizsgálat érvénytelen, és a betegminta eredményeket nem szabad kiadni. Az eljárás áttekintése után a kezelő dönthet a vizsgálat megismétléséről, vagy segítségért kapcsolatba léphet a gyártóval. A vizsgálat megismétlése esetén ugyanazon mintából új aliquot részt kell használni. Számítási példa: Minta Abszorbancia (OD) Negatív kontroll (R3) OD,116 Cut-Off kontroll (R4) OD,513,533 Pozitív kontroll (R5) OD 1,834 Számítások Cut-Off kontroll átlagértéke Az Cut-Off kontroll (R4) átlag abszorbanciájának kiszámításához, adjuk össze a Cut-Off kontroll duplikátumok OD értékeit és osszuk el az eredményt kettővel: (,513 +,533) 2 =,523 7

8 Negatív kontroll index A negatív kontroll indexének kiszámításához osszuk el a negatív kontroll abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlag abszorbanciájával:,116 I = =,22,523 Pozitív kontroll index A pozitív kontroll indexének kiszámításához, osszuk el a pozitív kontroll abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlag abszorbanciájával: 1,834 I = = 3,51,523 Megfelelőség A fenti példában: Minden Cut-Off kontroll abszorbanciája,3 és,8, ami azt jelenti, hogy a Cut-Off kontroll megfelelt. A negatív kontroll indexe <,4, ami a negatív kontroll megfelelőségét jelenti. A pozitív kontroll indexe > 1,5, ami a pozitív kontroll megfelelőségét jelenti. Ebben a példában szereplő vizsgálatsorozat megfelelő, mivel az eredmények megfelelnek a megfelelőségi szempontoknak minden kontroll esetében. 12 AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE A galaktomannan antigén jelenlétét vagy hiányát a vizsgált mintában minden betegminta esetében az index számításával határozzuk meg. Az index (I), a minta abszorbanciája, osztva a Cut-Off kontrollszérumot tartalmazó tesztlyukak átlag abszorbanciájával. Az Cut-Off kontroll átlag abszorbanciájának kiszámítása: Adjuk össze a két Cut-Off kontrollszérumot tartalmazó tesztlyuk (R4) abszorbanciáját és az eredményt osszuk el kettővel. A vizsgált minták indexének (I) kiszámítása: Számítsuk ki a következő arányt a minden vizsgált minta esetében: minta OD I = Cut-Off kontroll átlag OD A,5-nél kisebb index értékű szérum/bal kiértékelése: A,5-nél kisebb index értékű szérum/bal minta negatívnak tekintendő a galaktomannan antigénre tekintve. Megjegyzés: A negatív eredmény azt is jelentheti, hogy a beteg eredménye a vizsgálat kimutatási határa alatt van. Megjegyzés: A negatív eredmények nem zárják ki az invazív Aspergillosis diagnózisát. A vizsgálat megismétlése javasolt, ha az eredmény negatív, de gyanítható a betegség fennállása. A,5-nél indexértékű szérum/bal kiértékelése A,5 indexű szérumokat/bal mintákat galaktomannan antigénre nézve pozitívnak tekintjük. Minden pozitív beteg számára javasolt a vizsgálat megismétlése ugyanabból a mintából új aliquottal (szérum/bal). Megjegyzés: A, alatti OD érték eljárási-, vagy készülékhibára is utalhat, melyet ki kell vizsgálni. Az ilyen eredmény érvénytelen és a minta vizsgálatát meg kell ismételni. Javasolt a kiemelten fertőzésveszélyes betegek szérum mintáinak rendszeres ellenőrzése (hetente kétszer), a vizsgálat érzékenységének és a betegség korai kimutathatóságának növelése érdekében. Megjegyzés: A Platelia Aspergillus Ag rendeltetése, hogy segítsen az invazív Aspergillosis diagnózisában. A Platelia Aspergillus Ag vizsgálattal nyert pozitív eredmények értékelését össze kell vetni egyéb olyan diagnosztikai eljárások eredményével, mint pl. a mikrobiológiai tenyésztést, biopszia minták szövettani vizsgálatával és röntgen vizsgálatok. Számítási példa: Minta abszorpció Negatív kontroll (R3),116 Cut-off kontroll (R4),513,533 Pozitív kontroll (R5) 1,834 Betegminta #1,134 Betegminta #2,436 Betegminta #3 1,196 8

9 Számítások Lásd a minőségellenőrzés (megfelelőségi szempontok) fejezetben a számítási példát a vizsgálatban alkalmazott kontrollok megfelelőségének megállapításához. Cut-Off kontroll átlagértéke Az Cut-Off kontroll (R4) átlag abszorbanciájának kiszámításához adjuk össze a Cut-Off kontroll duplikátumok abszorbancia értékeit és osszuk el az eredményt kettővel: (,513 +,533) 2 =,523 Betegminta #1 A betegminta #1 indexének kiszámításához, osszuk el a betegminta #1 abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlag abszorbanciájával:,134 I = =,26,523 Ebben a példában, a betegminta #1 negatív, mivel a,26 indexe <,5. Betegminta #2 A betegminta #2 indexének kiszámításához, osszuk el a betegminta #2 abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlag abszorbanciájával:,436 I = =,83,523 Ebben a példában, a betegminta #2 pozitív, mivel a,83 indexe,5. Betegminta #3 A betegminta #3 indexének kiszámításához, osszuk el a betegminta #3 abszorbanciáját a Cut-Off kontroll átlag abszorbanciájával: 1,196 I = = 2,29,523 Ebben a példában, a betegminta #3 pozitív, mivel a 2,29 indexe,5. Kérjük, olvassa el a pozitív eredmények értelmezéséről szóló részt a 12. fejezetben. 13 AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI 1. A szérum- és/vagy BAL mintákból származó negatív eredmények nem zárják ki az invazív Aspergillosis diagnózisát. Az invazív Aspergillosis veszélyének kitett betegekből vett szérum mintákat hetente kétszer kell vizsgálni. 2. A Platelia Aspergillus Ag eljárást és az eredmények értékelési módját szigorúan tartsuk be a galaktomannan antigén jelenlétének vizsgálatakor. Vizsgálatok elvégzése előtt, a készlet felhasználója olvassa el a csomagban elhelyezett utasítást. Gondosan tartsuk be a minta és reagens pipettázására, a lemezmosásra, és az inkubációs lépések idejére vonatkozó vizsgálati előírásokat. 3. Amennyiben elmulasztjuk a mintának vagy valamely reagensnek az eljárás utasításai szerinti bemérését, ez téves negatív eredményhez vezethet. Aspergillosis jelenlétének klinikai gyanúja, vagy valószínű eljárási hiba esetén meg kell fontolni újabb minták ismételt vizsgálatát. 4. A negatív betegminták tesztlyukainak keresztszennyeződése pozitív kontroll/betegminta által akkor fordulhat elő, amikor a reagensek bemérése közben valamely tesztlyuk tartalma átömlik egy másik tesztlyukba a mikrolemez hanyag kezelése vagy szabálytalan pipettázás miatt. 5. A Platelia Aspergillus Ag vizsgálat teljesítményét nem vizsgálták újszülött mintákon Az európai szakirodalom nagyobb számú hamis galaktomannan eredmény előfordulást mutat az újszülött populációból vett minták esetében 13, 15, 34, A Platelia Aspergillus Ag nehezebben érzékeli a galaktomannan jelenlétét az idült granulomatózisban szenvedő betegeknél (CGD) és Jób-szindrómás betegeknél 56, A penészgombák elleni huzamos anti-fungális kezelés egyes invazív Aspergillosisos betegeknél csökkent érzékenységet okozhat a Platelia Aspergillus Ag vizsgálatban 3, A Platelia Aspergillus Ag vizsgálatot nem vizsgálták plazma, vagy egyéb mintafajták esetében, pl. vizelet vagy liquor. 9. A Platelia Aspergillus Ag teljesítményét nem vizsgálták manuális leolvasás, illetve vizuális eredménymeghatározás esetében. 1. Egyéb családokba tartozó gombák, mint pl. Penicillium, Alternaria Paecilomyces, Geotrichum és Histoplasma reaktivitást mutattak a patkány EBA-2 monoklonális antitestekkel, amelyeket a vizsgálat során az Aspergillus galaktomannan kimutatására használnak 36, 5, 59. Ezek a fajok ritkán velejárói az invazív gombás betegségnek. 11. A BAL-minták esetében a Mycoplasma pneumoniae vagy az altatáshoz használatos gyógyszerek/altatószerek illetve a mintavételnél alkalmazott nyak/torok területének érzéstelenítéséhez használatos kenőcsök keresztreakcióit nem vizsgálták. 9

10 12. Pozitív reakciók klinikai jelek nélkül: Mivel a galaktomannan antigént ki lehet mutatni a szérum, illetve BAL mintában a klinikai, illetve röntgenvizsgálatban való megjelenés előtt is, pozitív reakciót tapasztalhatunk klinikai jelek nélkül is: ezek valódi pozitív eredményeknek felelnek meg olyan betegeknél, akiknél a későbbiekben bizonyított vagy valószínű invazív Aspergillosis diagnózisát állapítják meg 3. Mindazonáltal, egyes egyedi esetekben, figyelembe kell venni bizonyos tényezőket a vizsgálat eredményeinek értékelése során: a. Pozitív reakciókról számoltak be klinikai jelek nélkül, különösen fiatal gyermekeknél 44. Ámbár egyes esetek valóban Aspergillus antigének keringésével 7 lehetnek kapcsolatosak, legtöbbször ezek téves pozitív eredménynek tekinthetők. b. Galaktofuranózt mutattak ki különböző élelmiszerekben, különösen gabonaneműekben és krémes desszertekben 1, 27. Az emberi tejtől eltérően, a humanizált tejek gyakran magas galaktomannantartalmúak 13. Ennek következtében, fiatal gyermekek antigenemiája esetében számolni kell az étrendi tényezővel is, de ez érvényes általában minden megváltozott bél-felszívódású betegre 6, 13. Klinikai jelek nélküli pozitív antigenemia esetében még óvatosabban kell az ilyen populáció eredményeit értelmezni. c. Pozitív galaktomannan vizsgálati eredményekről számoltak be olyan betegeknél, akik piperacillin/tazobactam kezelést kaptak. Beszámoltak továbbá olyan piperacillin/tazobactam gyártási tételekről vagy sarzsokról is, melyek galaktomannan antigénre pozitívnak bizonyultak. Ennek következtében piperacillin/tazobactam kezelésben részesülő betegeknél a pozitív vizsgálati eredményt óvatosan kell értelmezni, és egyéb diagnosztikai módszerekkel is igazolni kell. Galaktomannan kimutatásáról számoltak be egyes amoxicillint és klavulánsavat tartalmazó parenterális készítmények gyártási tételeiben is. Ennek következtében a vizsgálati eredmények 1, 3, értelmezése során a félszintetikus -laktám kezeléseket is figyelembe kell venni 32. Mindazonáltal, mivel a Platelia Aspergillus Ag kimutatja a galaktomannan antigént jóval a klinikai vagy röntgen jelek megjelenése előtt, az invazív Aspergillosis előfordulása nem zárható ki. Ennek következtében, gondosan meg kell figyelni azokat a piperacillin/tazobactam kezelésben részesülő betegeket, akiknél pozitív a vizsgálati eredmény. d. Pozitív reakciók figyelhetők meg a klinikai tünetek hiányában azoknál az egyéneknél, akik galaktomannan antigénnel szennyeződött készítményt kaptak parenterálisan vagy szájon keresztül (a béltraktus barrier funkciójának megváltozása esetén). Ezen készítmények galaktomannan antigénnel történő szennyeződése a gombák segítségével történő fermentációs mechanizmusok alkalmazásával magyarázhatók. Azoknál az egyéneknél figyelhető meg pozitív eredmény, akiknél az exogén galaktomannan szérumkoncentrációja eléri, vagy meghaladja a teszt kimutatási határát. Ennek következtében, ha gyanús pozitív eredmények vannak, egyéb jellegzetes tünet hiányában, javasolt az egyének által szedett készítmények vizsgálata, különös tekintettel a készítmények 14, 41, 49 gyártási folyamatára és a nyersanyagok eredetére. 13. Számos tanulmányban készültek jelentések arról, hogy megfigyeltek galaktomannan pozitivitást szérum és BAL mintákban PLASMA-LYTE TM használata során 14, 41. Ezért a PLASMA-LYTE TM használatát figyelembe kell venni az eredmények értelmezésekor. 14. Nem immunkompromittált betegekből vett BAL minták esetében a Platelia Aspergillus Ag eredményeit óvatosan kell értelmezni Azokat az index értékeket, amelyek Cut-off kontroll körüliek (,5) körültekintően kell értelmezni, és alá kell támasztani az invazív Aspergillosis klinikai, radiológiai vagy laboratóriumi vizsgálatok eredményeivel, mivel a vizsgálat eredményének értelmezésében nincs szürke zóna. 16. Ezen túlmenően, BAL minták,5-1, index értékű eredményeinél, a Platelia Aspergillus Ag prediktív értéke alacsonyabb, mint abban az esetben, ha az eredmény index értéke > 1,; ennek következtében a,5-1, közötti index értékű eredményeket az invazív Aspergillosist bizonyító egyéb klinikai, radiológiai vagy laboratóriumi vizsgálatokkal is felül kell vizsgálni, illetve alá kell támasztani 8, VÁRHATÓ ÉRTÉKEK I. SZÉRUM Az invazív Aspergillosis prevalenciája a betegpopuláció szerint változik; 5-2%-os arányról számoltak be 1, 18. A következő eredményeket az Egyesült Államokban gyermekeken (kor 21 év), és Észak-Amerikában felnőtteken végzett klinikai tanulmányokból vették. A. Gyermekek A klinikai tanulmányt 129 immunkompromittált gyermekből (kor 21 év) vett, összesen 1954 szérum mintán végezték, ezeknél a betegeknél nagy volt a veszélye az invazív Aspergillosis (IA) fertőzésnek, és vagy bizonyított vagy valószínű invazív Aspergillosist diagnosztizáltak náluk. A vizsgálatokat az Egyesült Államok három vizsgálati központjában, azért végezték, hogy meghatározzák a Platelia Aspergillus Ag teljesítményjellemzőit. Az index értékek eloszlását ezeknél, a populációknál a következő diagram szemlélteti. 1

11 Invazív Aspergillosissal nem diagnosztizált gyermekek (kontroll populáció) 18 immunkompromittált gyermekből vett összesen 1625* szérum mintát vizsgáltak meg három vizsgálóhelyen az Egyesült Államokban, hogy meghatározzák a Platelia Aspergillus Ag teljesítményjellemzőit. Az indexértékek eloszlását, ezeknél a populációknál, a következő diagram szemlélteti. 1. ábra Number Szérumok of száma Sera A szérum Distribution indexértékének of the Serum megoszlása Index Value a gyermek from the kontrollpopulációból Pediatric Control Population (Szám=1625) (N=1625) Index *Megjegyzés: 8 minta, 4 galaktomannan antigén eredménnyel rendelkező kontroll betegből, a piperacillin/tazobactam (Zosyn ) terápia alkalmazása kizárva. >1.5 8 Invazív Aspergillosissal diagnosztizált gyermekek Ebben a tanulmányban a szórásdiagram az EORTC/NIAID által meghatározott definíciókkal írja le a bizonyított és valószínű invazív Aspergillosissal diagnosztizált 17 betegből vett 249 szérum minta galaktomannan vizsgálat eredményeit. Az egyes betegektől származó szérum minta eredménye várhatóan nem minden esetben pozitív. Az invazív Aspergillosis várt prevalenciája betegpopulációnként változik; 5-2%-os arányokról számoltak be 1, 24. A tanulmány prevalencia aránya 13,6% volt. 2. ábra Index > Pediatric Gyermekmintákon Proven/ Probable kimutatott Aspergillosis: Feltehető aspergillosis Distribution of Indexmegoszlás Pediatric Gyermekek Patient (N=17) Index/ (Szám=17) Patient Betegek Number szám B. Felnőttek A klinikai tanulmányt 172 invazív Aspergillosissal, vagy anélkül diagnosztizált csontvelő-átültetéses (bone marrow transplant=bmt) és leukémiás betegből vett összesen 1724 szérum mintán végezték el három észak-amerikai vizsgáló központban, hogy meghatározzák az Platelia Aspergillus Ag teljesítményjellemzőit. Az index értékek eloszlását, ezeknél a populációknál, a következő diagram szemlélteti. Invazív Aspergillosissal diagnosztizált felnőtt betegek (kontroll populáció) 143 csontvelő-átültetéses (BMT) és leukémiás betegből vett 1262 szérum mintát vizsgáltak meg három vizsgálóhelyen Észak-Amerikában Platelia Aspergillus Ag teszttel. Az index értékek eloszlását, ezeknél a populációknál, a következő diagram szemlélteti. 11

12 3. ábra Szérumok Number száma of Sera A szérumok Distribution indexértékének of the Serum Index megoszlása Value from a felnőtt the kontrollpopulációból Adult Control Population (Szám=1262) (N=1262) Index >1.5 Invazív Aspergillosissal diagnosztizált felnőtt betegek Ebben a tanulmányban a szórásdiagram az EORTC/NIAID által meghatározott definíciókkal írja le a bizonyított és valószínű invazív Aspergillosissal diagnosztizált 29 betegből vett 422 szérum minta galaktomannan teszt eredményeit. Az egyes betegektől származó szérum minta eredménye várhatóan nem minden esetben pozitív. Az invazív Aspergillosis várható prevalenciája betegpopulációnként változik; 5-2%-as arányokról számoltak be 1, 24. A prevalencia arány erre a vizsgálatra 16,9% volt. 4. ábra Index > Adult Felnőttmintákon Proven/ Probable kimutatott Aspergillosis: Feltehető Distribution aspergillosis of Indexek megoszlása Index/ Adult Felnőttbetegek Patient (N=29)(Szám=29) Betegek Patient száma Number Az alábbi grafikonok bemutatnak egy példát egy invazív Aspergillosis klinikai tüneteivel nem rendelkező (negatív Aspergillusos) betegre, és egy bizonyított vagy valószínűsíthetően invazív Aspergillusos (pozitív Aspergillusos) betegre. 5. ábra Negatív beteg Index CONTROL Kontrollbetegek PATIENT Napok Days 12

13 6. ábra Pozitív beteg PROVEN Betegek INVASIVE kimutatott ASPERGILLOSIS invazív aspergillosisszal PATIENT 15 Index Index Napok Days II. BAL Két tanulmányt végeztek az Egyesült Államokban 178 Aspergillosissal, vagy anélkül diagnosztizált szervátültetéses (SOT) és tüdő transzplantált betegekből vett összesen 449 BAL mintán, hogy meghatározzák a Platelia Aspergillus Ag teszt teljesítményjellemzői. Ezek közül 167 szervtranszplantált és tüdőtranszplantált betegből vett 43 BAL minta invazív Aspergillosistól mentes volt. Továbbá egy tanulmányban, egy retrospektív analízist végeztek az Egyesült Államokon kívül, magas kockázatú hematológiai betegekből vett 99 értékelhető BAL mintából, melyek közül 58 esetben bizonyított vagy valószínű volt az Aspergillosis diagnózisa. A kevert invazív Aspergillosis diagnózis nélküli SOT és tüdőtranszplantált betegekből vett BAL minták várt eredményeit mutatjuk az alábbi táblázatban. Az eredmények a penészgomba-kolonizációval rendelkező vagy attól mentes szervátültetéses betegektől vett mintákból származnak. 1. táblázat Várható értékek mintánként Kevert szervtranszplantált és tüdőtranszplantált, invazív Aspergillosissal nem rendelkező betegek N = 43 BAL minta Diagnózis N Pozitív (%) Negatív (%) Kontrollok kolonizáció nélkül /341 (3,2%) 33/341 (96,8%) Kontrollok kolonizációval 62 12/62 (19,4%) 5/62 (8,6%) Kontroll Összesen 43 23/43 (5,7%) 38/43 (94,3%) A kevert szervtranszplantált és tüdőtranszplantált, invazív Aspergillosissal nem diagnosztizált betegekből vett BAL minták várható értékét az átültetett szervek típusaként mutatja az alábbi táblázat. 2. táblázat Várható értékek mintánként Kevert szervtranszplantált és tüdőtranszplantált, invazív Aspergillosissal nem rendelkező betegek az átültetett szervek típusa szerint N = 43 BAL minta Az átültetett szerv típusa N Pozitív (%) Negatív (%) Szív 28 3/28 (1,7%) 25/28 (89,3%) Vese 25 3/25 (12,%) 22/25 (88,%) Máj 23 1/23 (4,3%) 22/23 (95,7%) Tüdő /327 (4,9%) 311/327 (95,1%) Kontroll Összesen 43 23/43 (5,7%) 38/43 (94,3%) 41 hematológiai betegségben szenvedő beteg, összesen 41 BAL mintáinak várható eredményeit is értékelték invazív Aspergillosis diagnózis hiányában, az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza: 13

14 3. táblázat Várható értékek mintánként Invazív Aspergillosissal nem rendelkező hematológiai betegek N= 41 BAL minta Diagnózis N Pozitív (%) Negatív (%) Controllok 41 8/41 (19,5%) 33/41 (8,5%) 15- SPECIÁLIS TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK A- REPRODUKÁLHATÓSÁG a) Tanulmányok a szérumban történő reprodukálhatóságról A vizsgálatok közötti és vizsgálaton belüli Platelia Aspergillus Ag varianciáját tanulmányban határozták meg, 6 kevert betegszérum mintával (egy negatív, egy gyenge pozitív, két pozitív, és két magas pozitív), amelyek három klinikai kísérlet helyszínéről származtak Észak-Amerikából. Mind a 6 kevert mintát háromszor vizsgálták (x3) három különböző napon, azonos gyártási számú kittel, két helyszínen (ismétlések száma minden helyszínen = 9). Mind a 6 kevert mintát kétszer vizsgálták (x2) három különböző napon, azonos gyártási számú kittel, a harmadik helyszínen (ismétlések száma a harmadik helyszínen = 6). Egy (1) dolgozó végzett el minden pontossági vizsgálatot, minden helyszínen. Az adatokat CLSI (korábban NCCLS) előírásai szerint elemezték. Az átlag optikai denzitás (OD) és az átlag index érték, szórás (SD), százalékos variációs koefficiens (%CV), egy vizsgálaton belül pontosság (intra-assay) és a vizsgálatok közti (interassay) pontosság minden kevert mintára, minden helyszínen, a következő táblázatokban látható. 4. táblázat N/A= nem értelmezhető 14

15 b) Reprodukálhatóság a BAL mintáknál A vizsgálatok közötti és vizsgálaton belüli Platelia Aspergillus Ag varianciáját tanulmányban határozták meg, amelyben 4 kevert betegmintát, amelyek tisztított galaktomannannal lettek beoltva (egy negatív, egy magasabb negatív, egy alacsony és egy közepesen pozitív) 3 vizsgálati helyen (két klinikai vizsgáló hely az USA-ban és egy belső vizsgáló hely). Mind a 4 mintát és a kontrollokat két-két párhuzamossal (x2) naponta 2 sorozatban 5 különböző napon, azonos gyártási számú kittel (az eredmények száma az egyes helyszíneken összesen = 12) vizsgálták. Két (2) dolgozó végzett el minden pontossági vizsgálatot, minden helyszínen. Az adatokat a CLSI (korábban NCCLS) előírásai szerint elemezték. Az átlag optikai denzitás (OD) és az átlag index érték, szórás (SD), százalékos variációs koefficiens (%CV), egy vizsgálaton belül pontosság (intra-assay) és a vizsgálatok közti (inter-assay) pontosság minden kevert mintára, minden helyszínen, a következő táblázatokban látható. 5. táblázat+ Kevert helyszínek Összegzés Összegzés Magasabb Alacsony Közepesen Pozitív Negatív Negatív negatív pozitív pozitív kontroll kontroll N= 6 N=6 N=6 N=6 N=6 N=6 OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index OD Index Átlag Sorozaton belüli (Intra- Assay) Összesen (Inter- Assay) SD N/A N/A N/A N/A %CV N/A N/A 17.4% 2.5% 9.3% 8.9% 5.% 5.% 7.% 7.1% N/A N/A SD N/A N/A N/A N/A %CV N /A N/A 19.6% 18.9% 16.2% 13.9% 12.2% 1.2% 12.% 11.8% N/A N/A B- Keresztreaktivitás A, Keresztreaktivitás - Szérum A Platelia Aspergillus Ag készlet egy gyártási tételével tanulmányt végeztek, hogy felmérjék az olyan potenciálisan zavaró egészségügyi körülmények hatását, melyek nincsenek kapcsolatban az invazív Aspergillosissal. A következő szérum mintákat vizsgálták keresztreaktivitás szempontjából a Platelia Aspergillus Ag készlettel. Összesen 151 szérumot vizsgáltak. 6. táblázat Kórtan # Vizsgált minták # Pozitívak Reumatoid-faktor 1 ANA Pozitív 1 IgG Hypergammaglobulinemia 1 IgM Hypergammaglobulinemia 1 Rák* 11 Nem vírusos cirrhozis (epével kapcsolatos; alkoholos eredetű; gyógyszer indukált) 1 Többszörös vérátömlesztés 1 Többször szült nők 1 HAV 1 HCV 1 Rubeóla 1 CMV 1 Szifilisz (RPR+) 1 Toxoplasmosis 1 Mycoplasma 1 * Húgyhólyag, mell (2), vastagbél, endometrium, tüdő, prosztata, vese és laphám eredetű (3.) 15

16 C- Klinikai vizsgálatok KLINIKAI VIZSGÁLATOK ÉSZAK-AMERIKÁBAN I. SZÉRUM MINTÁK A Platelia Aspergillus Ag érzékenységének, specificitásának és prediktív értékének értékelésére klinikai vizsgálatot végeztek gyermekeken (kor 21 év) három vizsgálóhelyen az Egyesült Államokban, valamint felnőtteken, három vizsgálóhelyen Észak-Amerikában. A tanulmányokat 129 gyermektől vett összesen 1954 szérum mintát, és 172 felnőttől vett összesen 1724 szérum mintát használva készítették el a következő populációkból*: az invazív Aspergillosis jeleit nem mutató betegek (kontroll betegek) betegek valószínű invazív Aspergillosis betegséggel betegek bizonyított invazív Aspergillosis betegséggel * Az Invazív Gombás Fertőzés Együttműködési Csoport (Fungal Infection Cooperative Group - IFICG) amely az Európai Rákkutatási és Kezelési Szervezet (European Organization for Research and Treatment of Cancer - EORTC) tagja, és a Mycosis Tanulmány Csoport (az MSG - Mycosis Study Group - az Országos Allergológiai és Fertőző Betegségek Intézete [National Institute of Allergy and Infectious Diseases - NIAID] tagja) definiálták az invazív Aspergillosis (IA) diagnózisának szempontjait rosszindulatú hematológiás vagy vérsejtképző őssejt transzplantációs betegeknél 2, 39. ÉRZÉKENYSÉG A. Gyermekek E vizsgálat eredményeit a beteg érzékenysége szempontjából elemezték. Érzékenységi vizsgálatot végeztek a Platelia Aspergillus Ag-t használva három vizsgálóhelyen összesen 17 immunkompromittált kevert bizonyított vagy valószínű invazív Aspergillosissal diagnosztizált betegen. 7. táblázat *Megjegyzés: 17 betegből 8 esetén adott a teszt negatív Aspergillus galaktomannan eredményt. Mind a 8 negatív Aspergillus galaktomannan eredményt adó beteg többszörös antifungális terápiában részesült. A penészgombára aktív kísérő antifungális terápia egyes Invazív Aspergillosisos betegnél csökkentheti a vizsgálat érzékenységét 31. B. Felnőttek Érzékenységi vizsgálatot végeztek a Platelia Aspergillus Ag teszttel három helyszínen, összesen 29 csontvelő transzplantált (BMT) és leukémiás felnőtt betegnél, akiknél bizonyított vagy valószínű Aspergillosist diagnosztizáltak. 8. táblázat Diagnózis Betegek száma Érzékenység 95%-os konfidencia Bizonyított Aspergillosis 9 44,4% (4/9) 18,9-73,3% Valószínű Aspergillosis 8 62,5% (5/8) 3,6-86,3% Kevert bizonyított és valószínű Aspergillosis 17* 52,9% (9/17) 31,-73,8% Diagnózis Betegek száma Érzékenység 95%-os konfidencia Bizonyított Aspergillosis 11 81,8% (9/11) 52,3-94,9% Valószínű Aspergillosis 18 77,8% (14/18) 54,8-91,% Kevert bizonyított és valószínű Aspergillosis 29 79,3% (23/29) 61,6-9,2% 16

17 SPECIFICITÁS A. Gyermekek estén Specificitás gyermekenként Specificitás vizsgálatot végeztek a Platelia Aspergillus Ag-t használva három vizsgálóhelyen összesen 18* immunkompromittált invazív Aspergillosis tüneteitől mentes gyermeken (kontroll betegek). 9. táblázat Kombinált 18 87,% (94/18) 79,4-92,1% vizsgálóhelyek *Megjegyzés: 8 mintából ki lett zárva 4 pozitív galaktomannan antigén eredményekkel rendelkező beteg, akiket piperacillin/tazobactam terápiával kezeltek. Specificitás gyermek mintánként Specificitás vizsgálatot végeztek a Platelia Aspergillus Ag-t használva három vizsgálóhelyen 18 immunkompromittált, invazív Aspergillosis tüneteitől mentes gyermektől (kontroll betegek) vett összesen 1625* kevert mintán. 1. táblázat Vizsgálóhely Minták száma Specificitás 95%-os konfidencia ,9% (785/794) 97,9-99,4% ,8% (715/731) 96,5-98,6% 3 1 1% (1/1) 96,3-1% Kombinált ,5% (16/1625) 97,7-99,% vizsgálóhelyek *Megjegyzés: 4 pozitív galaktomannan antigén eredményekkel rendelkező, piperacillin/tazobactam terápiával kezelt betegtől származó 8 mintát kizártak. B. Felnőttek Specificitás felnőtt mintánként Specificitás vizsgálatot végeztek a Platelia Aspergillus Ag-t használva három vizsgálóhelyen összesen 143 kevert csontvelő-átültetéses (BMT) és leukémiás, az invazív Aspergillosis tüneteitől mentes felnőttön (kontroll betegek). 11. táblázat Vizsgálóhely Betegek száma Specificitás 95%-os konfidencia ,4 % (38/44) 73,3-93,6% ,4 % (51/59) 75,5-93,% 3 5 1% (5/5) 56,6-1% Vizsgálóhely Betegek száma Specificitás 95%-os konfidencia ,6% (22/28) 6,5-89,8% ,4% (71/77) 84,-96,4% ,5% (34/38) 75,9-95,8% Kombinált vizsgálóhelyek ,8% (127/143) 82,9-93,% Specificitás felnőtt mintánként Specificitás vizsgálatot végeztek a Platelia Aspergillus Ag-t használva három vizsgálóhelyen 143 csontvelőátültetéses (BMT) és leukémiás, az invazív Aspergillosis tüneteitől mentes felnőttől (kontroll betegek) vett összesen 1262 mintán. 17

18 12. táblázat Vizsgálóhely Minták száma Specificitás 95%-os konfidencia ,% (342/349) 95,9-99,% ,6% (552/56) 97,2-99,3% ,9% (349/353) 97,1-99,6% Kombinált vizsgálóhelyek ,5% (1243/1262) 97,-99,% PREDIKTÍV ÉRTÉK Ez a tanulmány pozitív és negatív prediktív értékeket elemzett a betegpopuláción. Az aktuális átlagos prevalencia arány alapján, mely gyermekeknél 13,6%, felnőtteknél pedig 16,9 a pozitív és a negatív értékeket az alábbiak szerint számolták ki: A. Gyermekek Prevalencia vizsgálat 13,6% PPV: 39,1% 95%-os konfidencia-: 22,2-59,2% NPV: 92,2% 95%-os konfidencia-: 85,3-96,% B. Felnőttek Prevaelncia vizsgálat 16,9% PPV: 59,% 95%-os konfidencia-: 43,4-72,9% NPV: 95,5% 95%-os konfidencia-: 9,5-97,9% Az invazív Aspergillosis várt prevalenciája betegpopulációnként változik; 5-2%-os arányokról számoltak be 1, 24. A közzétett prevalencia alacsonyabb értékein szereplő betegpopulációnak a pozitív és negatív prevalenciáit, 5%-os prevalencia arányt alkalmazva, újra kiszámították. A. Gyermekek Számított prevalencia 5% PPV: 17,6% 95%-os konfidencia-: 6,5-39,8% NPV: 97,2% 95%-os konfidencia-: 92,1-99,1% B. Felnőttek Számított prevalencia 5% PPV: 27,2% 95%-os konfidencia-: 13,7-46,7% NPV: 98,8% 95%-os konfidencia-: 95,4-99,7% II. BAL-MINTÁK - TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK A Platelia Aspergillus Ag-nak BAL mintáknál való érzékenységét és specificitását két tanulmányban vizsgálták az Egyesült Államokban, 62 szervtranszplantált invazív Aspergillosisos és anélküli betegből vett 116 mintán, és 116 tüdőtranszplantált invazív Aspergillosisos és anélküli betegből vett 333 mintán, valamint egy tanulmányt készítettek az Egyesült Államokon kívül, ahol 99 magas kockázatú hematológiai betegből vett (invazív Aspergillosis és anélküli) 99 mintát vizsgáltak. A. ÉRZÉKENYSÉG Az érzékenységet szervtranszplantált és tüdőtranszplantált, valamint hematológiai betegséggel és invazív Aspergillosissal diagnosztizált betegeknél értékelték ki az EORTC/MSG kritériumoknak megfelelően. I. Invazív Aspergillosisos szerv transzplantációs betegek Az egy vizsgálatban szereplő 62 szerv transzplantációs betegtől vett összesen 116 mintából 5 invazív Aspergillosissal diagnosztizált betegnél mutattak ki érzékenységet, ezt az alábbi táblázat mutatja. 13. táblázat Bizonyított vagy valószínű invazív Aspergillosis szervtranszplantáltaknál Betegenként Diagnózis N Index,5 Érzékenység 95%-os konfidencia Bizonyított Aspergillosis 2 2 2/2 (1%) 34,2-1% Valószínű Aspergillosis 3 3 3/3 (1%) 43,8-1% Kevert bizonyított és valószínű Aspergillosis 5 5 5/5 (1%) 56,5-1% 18

19 14. táblázat Bizonyított vagy valószínű invazív Aspergillosis szerv transzplantáltaknál Szervenként Az átültetett szerv típusa Szám Index.5 Érzékenység II. Tüdőtranszplantált betegek invazív Aspergillosissal Egy másik vizsgálatban szereplő 116 tüdőtranszplantált betegtől vett összesen 333 mintából 6 invazív Aspergillosissal diagnosztizált betegnél vizsgálták az érzékenységet, ezt az alábbi táblázat mutatja. 15. táblázat Bizonyított vagy valószínű invazív Aspergillosis tüdőtranszplantáltaknál Betegenként III. Hematológiai betegek invazív Aspergillosissal Egy harmadik tanulmányban, 58 olyan hematológiai beteg összesen 58 mintáján, akinél invazív Aspergillosis diagnosztizáltak, vizsgálták a teszt érzékenységét, ennek eredményét az alábbi táblázat mutatja. A tanulmányban a Platelia Aspergillus Ag teszttel retrospektív vizsgálatot végeztek magas kockázatú hematológiai betegek mintáin. Az alábbi adatok, melyek ebből a publikált tanulmányból származnak, alá kívánják támasztani BAL vizsgálati minták esetében a teszt teljesítményjellemzőit. 16. táblázat Bizonyított és valószínű Aspergillosis hematológiai betegeknél. B. SPECIFICITÁS 57 nem invazív Aspergillosisos szervtranszplantált betegből vett összesen 98 BAL mintán, és 11 nem invazív Aspergillosisos, tüdőtranszplantált betegből vett összesen 35 BAL mintán vizsgálták a specificitást, ahogyan ezt az alábbi táblázat is mutatja. Az eredmények a penészgomba-kolonizációval rendelkező vagy attól mentes szervtranszplantált betegektől vett mintákból származnak. 17. táblázat Specificitás mintánként Kevert, nem invazív Aspergillosisos szervtranszplantált és tüdőtranszplantált betegek N = 43 BAL 95%-os konfidencia Szív 1 1 1/1 (1%) 2,6-1% Vese 3 3 3/3 (1%) 43,8-1% Máj 1 1 1/1 (1%) 2,6-1% Összesen 5 5 5/5 (1%) 56,5-1% Diagnózis N Index,5 Érzékenység 95%-os konfidencia Bizonyított Aspergillosis 2 1 1/2 (5,%) 9,4-9,6% Valószínű Aspergillosis 4 3 3/4 (75,%) 3, - 96,4% Kevert bizonyított és valószínű Aspergillosis 6 4 4/6 (66,7%) 3, - 9,3% Diagnózis N Index,5 Érzékenység 95%-os konfidencia Bizonyított Aspergillosis /31 (1%) 89,- 1% Valószínű Aspergillosis /27 (96,3%) 81,7 99,3% Kevert bizonyított és valószínű Aspergillosis /58 (98,3%) 9,8-99,7% 95%-os Index Diagnózis N Negatív (%) konfidencia <,5 Kontrollok kolonizáció nélkül /341 (96,8%) 94,3-98,2% Kontrollok kolonizációval /62 (8,6%) 69,1-88,6% Kontroll Összesen /43 (94,3%) 91,6-96,2% A kevert, nem invazív Aspergillosisos szervtranszplantált és tüdőtranszplantált betegekből vett BAL minták specificitását az alábbi 18. táblázat mutatja be az átültetett szervek típusaként. 19

20 18. táblázat Specificitás mintánként Kevert, nem invazív Aspergillosisos szervtranszplantált és tüdőtranszplantált betegek Átültetett szervtípus szerint N = 43 BAL Az átültetett szerv típusa 41 nem invazív Aspergillosisos betegből származó összesen 41 BAL mintán szintén vizsgálták a teszt specificitását, melynek eredményeit az alábbi táblázat mutatja: 19. táblázat Specificitás mintánként Hematológiai betegek Invazív Aspergillosis diagnózis nélkül N= 41 N Index <,5 Negatív (%) 95%-os konfidencia Szív /28 (89,3%) 72,8-96,3% Vese /25 (88,%) 7, - 95,8% Máj /23 (95,7%) 79, - 99,2% Tüdő /327 (95,1%) 92,2-97,% Kontroll Összesen /43 (94,3%) 91,6-96,2% Index 95% konfidencia Diagnózis N Negatív (%) <,5 Kontroll betegek /41 (8.5%) % 16- A GYÁRTÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉSE Minden gyártott reagenst minőségi rendszerünknek megfelelően készítünk, a nyersanyag átvételétől kezdve a végső termék forgalmazásáig. Minden gyártási tételt minőségellenőrzésnek vetnek alá, és csak akkor szabadítják fel forgalmazásra, ha megfelel az előre meghatározott elfogadhatósági szempontoknak. Minden egyes tétel gyártásával és ellenőrzésével kapcsolatos feljegyzéseket a Bio-Rad cégen belül őrizzük. 17- BIBLIOGRÁFIA 1. Ansorg, R., R. Van Den Boom, and P.M. Rath Detection of Aspergillus galactomannan antigen in foods and antibiotics. Mycoses 4:p Ascioglu, S., J. H. Rex, B. De Pauw, J. E. Bennett, J. Bille, F. Crokaert, D. W. Denning, J. P. Donnelly, J. E. Edwards, Z. Erjavec, D. Fiere, O. Lortholary, J. Maertens, J. F. Meis, T. F. Patterson, J. Ritter, D. Selleslag, P. M. Shah, D. A. Stevens and T. J. Walsh. 22. Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus. Clin.Infect.Dis. 34 : p Aubry, A., R. Porcher. J. Bottero, S. Touratier, T. Leblanc, B. Brethon, P. Rousselot, E. Raffoux, J. Menotti, F. Derouin, P. Ribaud and A. Sulahian 26. Occurrence and Kinetics of False-Positive Aspergillus GalactomannanTest Results following Treatment with β-lactam Antibiotics in Patients with Hematological Disorders. J. Clin. Microbiol. 44: p Barnes P. D. and K. A. Marr. 27 Risks, diagnosis and outcomes of invasive fungal infections in haemotopoeitic stem cell transplant recipients. Brit. Journ. Haemotol. 139: p Becker M. J., E. J. Lugtenburg. J. J. Cornelissen, C. V.D. Schee, H. C. Hoogsteden and S. D. Marie. 23 Galactomannan detection in computerized tomography-based broncho-alveolar lavage fluid and serum in haemotological patients at risk for invasive pulmonary aspergillosis. Br. J. Haemotol. 121(3): p Blijevens, N. M., J. P. Donelly, J. F. Meis, P. E. Verweij, and B. E. De Pauw. 22 Aspergillus galactomannan antigen levels in allogeneic haemotopoietic stem cell transplant receipients given total parenteral nutrition. Transpl. Infect. Dis. 4: p Chambon-Pautas, C.,J. M. Costa, M.T. Chaumette, C. Cordonnier, and S. Bretagne. 21 Galactomannan and polymerase chain reaction for the diagnosis of primary digestive aspergillosis in a patient with acute myeloid leukaemia. J. Infect. 43: p Clancy C., R. A. Jaber, H. L. Leather, J. R. Wingard, B. Staley, J. L. Wheat, C. Cline, K. H. Rand, D. Schain, M. Baz and M. H. Nyugen. 27 Bronchoalveolar Lavage Galactomannan in Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis among Solid-Organ Transplant Recipients. J. Clin. Microbiol. 45(6): p de Repentigny, L., L. Kaufman, G. T. Cole, D. Kruse, J. P. Latge, and R. C. Matthews Immunodiagnosis of Invasive Fungal Infections. J Med Vet Mycol 32: p Denning, D. W Invasive Aspergillosis. Clin Infect.Dis. 26: p Desai R, L.A. Ross and J. A. Hoffman Poster AAA 28. The Role of Bronchoalveolar Lavage Galactomannan Assay in the Diagnosis of Invasive Aspergillosis in Pediatric Populations. 2