/11 1. FELHASZNÁLÁS

Átírás

1 PLATELIA CMV IgM 1 lemez CITOMEGALOVÍRUS ELLENI IgM ANTITESTEK MINŐSÉGI KIMUTATÁSA HUMÁN SZÉRUMBÓL VAGY PLAZMÁBÓL ENZIM-IMMUNOASSAY TECHNIKÁVAL /11 1. FELHASZNÁLÁS A Platelia CMV IgM egy immunkötéses immunpróba a citomegalovírus elleni IgM antitestek minőségi kimutatására humán szérumban vagy plazmában. 2. KLINIKAI JELENTŐSÉG A humán citomegalovírusok (CMV) igen elterjedtek az emberi népességben. A CMV a herpeszvírus-család tagja, és közvetlen kontaktussal terjed, (vizelet, nyál, anyatej, vér, könnyek, sperma és hüvelyváladék). A fertőződést követően a CMV több évig is lappanghat a fertőzött beteg szervezetében, majd reaktiválódva újra és újra megjelenő fertőzéseket okoz, melyek során fennáll a lehetősége a másokra való továbbterjedésnek is. A gazdaszervezet többféle módon és különböző életszakaszokban fertőződhet meg (congenitalis, post-natalis fertőzések) Egy bizonyos lappangási fázist követően a másodlagos fertőzés alakulhat ki exogén vírus okozta reinfekció vagy a lappangó vírus reaktiválódása útján is. A lakosság 50-85%-a a felnőttkor előtt fertőződik meg, de a fertőzések többsége tünetmentes marad; mindössze a betegek 2%-ánál jelentkeznek atípusos tünetek, például láz, gyengeség, izom- vagy ízületi fájdalom. A CMV-fertőzés azonban súlyos kimenetelű is lehet, ha terhes nőket, újszülötteket vagy legyengült immunrendszerű egyéneket érint. Terhesség alatt a nők 1-3%-a fertőződik CMV-vel, és a betegek 40-50%-ánál figyelhető meg magzati fertőződés a placentán keresztül. A magzati fertőzések 95%-a tünetmentes, de 5% esetén a szövődmények rendkívül súlyosak: hepatosplenomegalia, microcephalia, hydrocephalia, koraszülés, pszichomotoros retardáció és magzatelhalás. A tünetmentes fertőzések 10%-ában az újszülötteknél késleltetve jelennek meg a szövődmények, mint például a részleges vagy teljes süketség vagy vakság. Immunszuppresszált egyéneknél (AIDS-es betegekben, transzplantáción átesett egyéneknél, limphoproliferatív vagy rákos betegségben szenvedőknél) a súlyos szövődmények a disszeminált és/vagy viscerális fertőzéssel vannak összefüggésben: splenomegalia, chorioretinitis, hepatitis, pneumonia, myocarditis, encephalitis. Ilyen betegeknél a fertőzés akár fatális kimenetelű is lehet. A CMV-fertőzés után néhány héttel az immunválasz következtében megjelennek a specifikus IgM antitestek, majd néhány nappal később a specifikus IgG antitestek. A CMV szerológiai diagnózisa szerokonverzióval vagy az IgG titer jelentős növekedésével igazolható. A specifikus anti-cmv IgM antitestek kimutatása elősegíti a primer és a congenitális CMV-fertőzések diagnosztizálását. 3. ALAPELV A Platelia CMV IgM egy kvalitatív teszt a humán szérumban vagy plazmában lévő citomegalovírus elleni IgM antitestek kimutatására, az IgM szilárd fázison történő megkötéses enzim-immunoassay technika segítségével. A szilárd fázis (a mikrolemez mélyedései) antihumán µ-lánc elleni antitestekkel van bevonva. Konjugátumként a CMVantigén és a peroxidázzal jelzett monoklonális anti-cmv antitest keverékét használjuk. A teszt menete: 1. lépés A betegmintákat, kalibrátor oldatokat és kontrollokat 1:21 arányban kell hígítani, majd bemérni a mikrolemez mélyedéseibe. Az egy órán keresztül tartó, 37 C-os inkubálás alatt a mintában jelen lévő IgM antitestek kötődnek a mikrolemez mélyedéseiben megkötött anti-µ antitestekhez. Inkubálás után az IgG-t és az egyéb szérumfehérjéket mosással el kell távolítani. 2. lépés A konjugátumot (CMV-antigén és peroxidázzal jelzett monoklonális anti-cmv antitest keveréke) bemérjük a mikrolemez mélyedéseibe. Az újbóli egyórás, 37 C-os inkubálás alatt a konjugátum kötődik a mikrolemezen maradt anti-cmv IgM antitestekhez. A feleslegben maradó konjugátumot az inkubálás végén mosással el kell távolítani. 3. lépés Az immunkomplexek (antihumán µ-lánc / anti-cmv IgM / CMV-antigén / peroxidázzal jelzett anti-cmv monoklonális antitestek) jelenlétét enzimes előhívó oldat adagolásával mutatjuk ki

2 4. lépés Szobahőmérsékleten ( C) történő inkubálás után az enzimreakciót 1 N kénsavoldat hozzáadásával állítjuk le. A spektrofotométerrel, 450/620 nm hullámhosszon mért optikai denzitás arányos a mintában jelen lévő CMV elleni IgM antitestek mennyiségével. 4. TERMÉKINFORMÁCIÓK A készletben található reagensek mennyisége 96 teszt elvégzéséhez elegendő. A reagensek kizárólag in vitro diagnosztikai célokra használhatóak. Címke A reagens leírása Kiszerelés R1 Mikrolemez Mikrolemez (használatra kész) 12 sor, amelyek 8-8 leválasztható lyukból állnak, antihumán µ-lánccal bevonva R2 Koncentrált mosóoldat (20x) Koncentrált mosóoldat (20x) TRIS-NaCl puffer (ph 7,4), 2% Tween 20 Tartósítószer: 0,04% ProClin 300 R3 Negatív kontroll Negatív kontroll A CMV elleni IgM antitestekre, valamint HBs-antigénre, anti- HIV1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum Tartósítószer: 0,15% ProClin 300 R4 Kalibrátor Kalibrátor A CMV elleni IgM antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum Tartósítószer: 0,15% ProClin 300 R5 Pozitív kontroll Pozitív kontroll A CMV elleni IgM antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum Tartósítószer: 0,15% ProClin 300 R6a Antigén CMV-antigén Liofilizált CMV-antigén R6b Konjugátum (101x) Tartósítószer: 0,1% ProClin 300 Konjugátum (101x) Peroxidázzal jelzett anti-cmv monoklonális rágcsálóantitest Tartósítószer: 0,16% ProClin 300 R7 Hígítószer Minta- és konjugátumhígító (használatra kész) Tris-NaCl puffer, foetális borjúszérum, kecskeszérum, egér IgG, fenolvörös indikátor Tartósítószer: 0,15% ProClin 300 R9 Kromogén TMB Kromogén (használatra kész) 3,3,5,5 -tetrametil-benzidin (< 0,1%), H 2 O 2 (< 1%) R10 Leállító oldat Leállító oldat (használatra kész) 1N kénsavoldat 1 mikrolemez 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 6 x qs 4,5 ml 1 x 0,4 ml 1 x 80 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml A tárolási feltételeket és a lejárati időt lásd a dobozon. 5. FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK Az eredmények megbízhatósága az alábbi helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) irányelveinek megfelelő betartásától függ: Lejárt reagensek használata tilos! A különböző tételekből származó reagenseket nem szabad összekeverni, illetve egymással kombinálni. MEGJEGYZÉS: A mosóoldat (R2, megjelölés: 20x zöld színű), a kromogén (R9, megjelölés: TMB, türkiz) és a leállító oldat (R10, megjelölés: 1N, piros színű) esetében lehetséges más készletekben lévő reagensek felhasználása is, feltéve hogy ezek a reagensek szigorúan egyenértékűek, és az adott tesztben használt reagensekkel azonos gyártási tételből származnak. MEGJEGYZÉS: Emellett a mosóoldat (R2, megjelölés: 20x zöld színű) megfelelő feloldás után összekeverhető a különböző Bio-Rad reagenskészletekben található 2 másik mosóoldattal (R2, megjelölés: 10x, kék színű vagy 10x, narancsszínű), feltéve, hogy egy adott teszt során csak egyféle keveréket használnak fel.

3 A felhasználás előtt várjon 30 percet, hogy a reagensek szobahőmérsékletre ( C) melegedjenek. Gondosan oldja fel vagy hígítsa a reagenseket, elkerülve a szennyeződést. Ne végezze a tesztet reaktív gőzök (sav-, lúg-, aldehidgőzök) vagy por jelenlétében, mivel ezek módosíthatják a konjugátum enzimaktivitását. Használjon alaposan elmosott és ioncserélt vízzel kiöblített üvegeszközöket, Egyszerhasználatos eszközök használata javasolt! A mikrolemez átmosása az eljárás kritikus lépése: végezze el a javasolt számú mosási ciklust, és ügyeljen arra, hogy a mélyedések teljesen fel legyenek töltve, majd teljesen ki legyenek ürítve. A nem megfelelő mosás pontatlan eredményekhez vezethet. Ne hagyja, hogy a mikrolemez kiszáradjon az egyes mosási ciklusok vége és a reagens bemérése között. Soha ne használja ugyanazt az eszközt a konjugátum és az előhívó oldatbeméréséhez. A enzimreakció nagyon érzékeny a fémekre vagy fémionokra. Éppen ezért ne engedje, hogy bármilyen fémes elem érintkezzen a konjugátumot vagy a kromogént tartalmazó különböző oldatokkal. A kromogén oldatnak (R9) színtelennek kell lennie. A kék elszíneződés azt jelzi, hogy a reagens a továbbiakban már nem használató! Minden mintához külön pipettahegyet kell használni. Ellenőrizze a pipetták és egyéb eszközök pontosságát és megfelelő működését! Egészségügyi és biztonsági utasítások A reagensek elkészítéséhez használt himán eredetű anyagokat hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag), hepatitis C vírus elleni (anti-hcv) és HIV elleni antitestekre (anti-hiv1 és anti-hiv2) vizsgálták, és negatívnak találták. Mivel nem létezik olyan módszer, amellyel teljes bizonyossággal kizárható a fertőző ágensek jelenléte, a humán eredetű reagenseket és betegmintákat potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. Bármely anyagot, beleértve a mosóoldatot is, amely közvetlen érintkezésbe kerül a mintákkal és az emberi eredetű anyagokat tartalmazó reagensekkel, potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. A mintákkal és reagensekkel való munka során viseljen egyszerhasználatos védőkesztyűt. Szájjal pipettázni tilos! Ügyeljen arra, hogy a minták, illetve a mintákat tartalmazó oldatok ne folyjanak ki. A kiömlött anyagokat 10%-os nátrium-hipoklorit oldattal kell lemosni. Ha sav ömlik ki, akkor azt először nátrium-bikarbonáttal semlegesíteni kell, majd 10%-os nátrium-hipoklorit oldattal kell lemosni, és a területet száraz papírtörlővel feltörölni. A tisztításhoz használt anyagokat a szennyezett maradékok tárolására szolgáló edénybe kell beledobni. A betegmintákat, humán eredetű anyagokat tartalmazó reagenseket, valamint a szennyezett anyagokat és termékeket kizárólag fertőtlenítés után lehet hulladékba helyezni: - áztatás 5%-os végkoncentrációjú nátrium-hipoklorit oldatban 30 percig, - vagy autoklávozás 121 C-on minimum 2 órán át. VIGYÁZAT! Ne tegyen nátrium-hipokloritot tartalmazó oldatokat az autoklávba! Ügyeljen arra, hogy a reagensek még a veszélytelennek tekinthető reagensek se kerüljenek a bőrre vagy nyálkahártyára. A kémiai és biológiai maradványokat a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) előírásainak megfelelően kell kezelni és megsemmisíteni. A készletben lévő valamennyi reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célra használható. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: 6. MINTÁK 1. Javasolt mintatípusok: szérum és plazma (EDTA, heparin vagy citrát). 2. A vérminták kezelése, feldolgozása és tárolása során tartsa be az alábbi ajánlásokat: Mindig a vénaszúrással kapcsolatos rutin óvintézkedések betartásával vegye le a vérmintákat. Szérum esetén centrifugálás előtt hagyja, hogy a minták teljesen megalvadjanak. A csöveket mindig tartsa lezárva. Centrifugálás után öntse le a szérumot vagy plazmát az alvadékról vagy a vörösvérsejtekről egy tárolócsőbe, amelyet azután szorosan lezár. A minták +2-8 C-on tárolhatók, ha a vizsgálat 7 napon belül megtörténik. Amennyiben a vizsgálatot nem végzik el 7 napon belül, vagy a mintákat elszállítják, akkor fagyassza le azokat 20 C-ra vagy annál alacsonyabb hőmérsékletre. Ne használjon olyan mintákat, amelyeket több mint öt alkalommal felolvasztottak. A lefagyasztott, majd felolvasztott mintákat a vizsgálat előtt alaposan össze kell keverni (Vortex).

4 3. A 90 g/l albumint vagy 100 mg/l konjugálatlan bilirubint, illetve 36 g/l triolein (triglicerid) ekvivalens lipémiás, vagy max. 10 g/l hemoglobintartalmú hemolizált minták az eredményeket nem befolyásolják. 4. A mintákat nem szabad melegíteni. 7. A VIZSGÁLAT MENETE 7.1 A méréshez szükséges, de a készletben nem szereplő anyagok Vortex keverő. 450 nm-es és 620 nm-es szűrőkkel felszerelt mikrolemez-leolvasó (*). Stabilan 37±1 C-ra beállított mikrolemez-inkubátor (*). Automata, félautomata vagy kézi mikrolemezmosó (*). Steril desztillált vagy ioncserélt víz. Egyszerhasználatos védőkesztyű. Védőszemüveg. Papírtörlő. Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták vagy többcsatornás pipetták a µl, 1ml, 2 ml és 10 ml kiméréséhez. 25 ml-es, 50 ml-es, 100 ml-es és 1000 ml-es mérőhengerek. Nátrium-hipoklorit (fertőtlenítő) és nátrium-bikarbonát. Biológiai hulladéktároló. Eldobható kémcsövek. (*) A javasolt felszerelésekkel kapcsolatos részletese információkért forduljon technikai osztályunkhoz. 7.2 A reagensek feloldása R1: A csomagolás felbontása előtt hagyja állni 30 percig szobahőmérsékleten ( C). Vegye ki a tartótálcát, a nem szükséges sorokat rögtön tegye vissza a csomagolásba, és ellenőrizze, hogy benne van-e a nedvességmegkötő anyag. Gondosan zárja vissza a csomagolást, és tegye +2-8 C-os helyre. R2: Az R2 mosóoldatot hígítsa desztillált vízzel 1:20 arányban. Például: 50 ml R2 oldat és 950 ml desztillált víz a használatra kész mosóoldat elkészítéséhez. Manuális mosáshoz készítsen 350 ml hígított mosóoldatot egy 12 sorból álló lemezhez. R3, R4, R5: Hígítsa 1:21 arányban hígítószerrel (R7) (például: 300 µl R µl kalibrátor oldat vagy kontroll). R6a: A CMV-antigén liofilizált. 2 sor méréséhez oldjon fel egy ampulla liofilizált antigént 4,5 ml hígítószerben (R7). Alaposan keverje össze. Hígítás után az antigénoldatnak (R6a + R7) tökéletesen tisztának, áttetszőnek kell lennie. R6 (R6a + R6b) Konjugátum-munkaoldat: Mérjen hozzá 45 µl konjugátumot (R6b) minden egyes ampulla feloldott CMV-antigénhez (R6a + R7). Alaposan keverje össze. A konjugátum-munkaoldatot elkészítés után azonnal fel kell használni. 7.3 A felbontott és/vagy feloldott reagensek tárolása és eltarthatósága A készletet +2-8 C-on kell tárolni. Ha a készletet +2-8 C-on tartják felbontás előtt, akkor minden alkotórész a készlet külső címkéjén feltüntetett lejárati ideig használható. R1: Felbontás után a sor max. 8 hétig használható, ha +2-8 C-on tárolják az eredeti, gondosan visszazárt csomagolásban (ellenőrizze a nedvességmegkötő anyag meglétét). R2: Hígítás után a mosóoldat C-on 2 hétig tárolható. Felbontást követően a tömény mosóoldat C-on, a szennyeződés kizárásával tárolt körülmények között, a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg a minőségét. R3, R4, R5, R6b, R7: A reagensek felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva max. 8 hétig őrzik meg minőségüket. R6 (R6a + R6b): Elkészítés után a konjugátum-munkaoldatot azonnal fel kell használni. R9: A reagens felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva max. 8 hétig őrzi meg minőségét. R10: A reagens felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg minőségét. 7.4 Eljárás Szigorúan kövesse a mérési eljárást és a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) előírásait. A felhasználás előtt hagyja, hogy a reagensek szobahőmérsékletre ( C) melegedjenek. A letörhető lyukak használata különleges odafigyelést igényel. Használjon kalibrátor oldatokat és kontrollokat minden egyes méréshez, a mérési eredmények validálásához. 1. Gondosan tervezze meg a kalibrátor oldatok, a kontrollok és a betegminták elhelyezését illetve beazonosítását a lemezen. 2. Készítse el a hígított mosóoldatot (R2) (lásd a 7.2. részt). 3. Vegye ki a tartótálcát és a sorokat (R1) a védőcsomagolásból (lásd a 7.2. részt).

5 4. Hígítsa 1:21 arányban az R3, R4, és R5 kalibrátor oldatokat és kontrollokat, valamint az S1, S2 stb. betegmintákat a hígítószerrel (R7) a megfelelő azonosítóval ellátott csövekben: 300 µl hígítószer (R7) és 15 µl minta. Homogenizálja a mintákat Vortex keverővel. 5. Szigorúan betartva az alábbi sorrendet, mérjen be µl-t a kalibrátor oldatokból, kontrollokból és a betegmintákból az egyes lyukakba: A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Fedje le a mikrolemezt tapadófóliával, erősen rányomkodva azt a lemezre, ezzel biztosítva a megfelelő zárást. Azonnal kezdje meg a mikrolemez inkubálását 37 C 1 C-os, termosztáttal szabályozott vízfürdőben vagy száraz inkubátorban, és inkubálja 1 órán át ( 5 perc). 7. Készítse el a konjugátum-munkaoldatot R6 (R6a + R6b) (lásd a 7.2. részt). 8. Az első inkubációs idő letelte után vegye le a tapadófóliát a lemezről. Szívja fel a mélyedések tartalmát, és helyezze (nátrium-hipokloritot tartalmazó) biológiai hulladéktartályba. Mossa le a mikrolemezt 4 alkalommal 350 µl mosóoldattal (R2). Fordítsa le a lemezt, és óvatosan ütögesse rá a papírtörlőre, ezzel eltávolítva a maradék folyadékot. 9. Rögtön mérjen bele minden mélyedésbe µl konjugátum-munkaoldatot (R6). Az oldatot használat előtt össze kell rázni. 10. Fedje le a mikrolemezt tapadófóliával erősen rányomkodva azt a lemezre, ezzel biztosítva a megfelelő zárást. Azonnal kezdje meg a mikrolemez inkubálását 37 C 1 C-os, termosztáttal szabályozott vízfürdőben vagy száraz inkubátorban, és inkubálja 1 órán át ( 5 perc). 11. A második inkubációs idő letelte után vegye le a tapadófóliát a lemezről. Szívja fel a mélyedések tartalmát, és helyezze (nátrium-hipokloritot tartalmazó) biológiai hulladéktartályba. Mossa le a mikrolemezt 4 alkalommal 350 µl mosóoldattal (R2). Fordítsa le a lemezt, és óvatosan ütögesse rá a papírtörlőre, ezzel eltávolítva a maradék folyadékot. 12. Gyorsan mérjen bele minden mélyedésbe µl kromogén oldatot (R9) fénytől védett körülmények között. Hagyja végbemenni a reakciót sötétben, szobahőmérsékleten ( C) 30 ± 5 percig. Ezen inkubálás alatt ne fedje le a lemezt a tapadófóliával. 13. Mérjen be µl leállító oldatot (R10) minden mélyedésbe, leállítva az enzimreakciót. Ezt ugyanolyan sorrendben és sebességgel végezze, mint az előhívó oldat esetében. 14. Gondosan törölje le a lemez alját. A reakció leállításától számított 30 percen belül egy lemezleolvasó segítségével mérje meg az optikai denzitást 450/620 nm-en. A sorokat leolvasás előtt folyamatosan fénytől védve kell tárolni. 15. Az eredmények továbbítása előtt ellenőrizze a mért értékeket, a lemez kiosztási tervét és a mintákat. 8 AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE 8.1 A Cut-Off érték kiszámítása (CO, határérték) A Cut-Off érték (CO) a Cut-Off kontrollok párhuzamosan mért (R4) optikai denzitásainak (OD) átlagértéke: CO = átlagos OD R4 8.2 A mintaarány kiszámítása A mintaeredményt aránnyal fejezzük ki, az alábbi képlet segítségével: Mintaarány = minta-od/co 8.3 Minőségellenőrzés Minden egyes mérésnél, mikrolemezenként, használja az összes kalibrátor oldatot és kontrollt és elemezze a kapott eredményeket. A mérés akkor megfelelő, ha kielégíti az alábbi kritériumokat: Optikai denzitás-értékek: - CO > 0,200-0,80 x CO < OD R4 1. párh. < 1,20 x CO - 0,80 x CO < OD R4 2. párh. < 1,20 x CO (A Cut-Off kontroll [R4] egyes párhuzamosainak OD-értéke és a CO-érték közötti eltérés nem lehet nagyobb 20%-nál.)

6 Optikai denzitás-arányok: - Arány R3 (OD R3 / CO) < 0,50 - Arány R5 (OD R5 / CO) > 1,60 Amennyiben a mérés nem felel meg a felsorolt minőségellenőrzési feltételeknek, meg kell ismételni. 8.4 Az eredmények értelmezése Mintaarány Eredmény Értelmezés Arány < 0,90 Negatív A minta a CMV ellen termelődött IgM antitestek jelenléte tekintetében nem reaktív. 0,90 arány < 1,10 Kétes A minta kétes a CMV ellen termelődött IgM antitestek jelenléte tekintetében. Az eredményt meg kell erősíteni egy, az első vizsgálat után három héttel, új mintával elvégzett másik vizsgálattal. Arány 1,10 Pozitív A minta reaktív a CMV ellen termelődött IgM antitestek jelenléte tekintetében. Nemrégiben kialakult fertőzés gyanúja esetén egyéb szerológiai vizsgálatok, például az IgG antitest aviditásának mérése segítségével megerősíthető a diagnózis. 8.5 Hibaelhárítási útmutató Az érvénytelen vagy nem reprodukálható reakciókat gyakran az alábbi tényezők okozzák: A mikrolemez nem megfelelő mosása. A negatív minták szennyeződése magas antitest titerű szérummal vagy plazmával. Az előhívó oldat szennyeződése kémiai oxidálószerekkel (pl. fertőtlenítővel, fémionokkal stb.). A leállító oldat szennyeződése. 9 TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK A Platelia CMV IgM Enzim Immunoassay Kit teljesítményjellemzőit 2 egymástól független helyszínen határoztuk meg, összesen 824 terhes nőtől és véradótól levett minta alapján. 9.1 Prevalencia Az anti-cmv IgM antitestek Platelia CMV IgM teszttel mért prevalenciáját 300, Párizsban (Franciaország) élő terhes nőtől levett mintán határoztuk meg. 5 minta volt pozitív az anti-cmv IgM antitestre. A Platelia CMV IgM próbával mért prevalencia 1,7%-os volt (5/300). 9.2 Specificitás A relatív specificitást 740 db mintából elvégzett mérés alapján állapítottuk meg, melyeket két egymástól független helyszínről gyűjtöttünk össze. A minták az alábbiak szerint oszlottak meg: 252, véradóktól származó szérum 488, terhes nőktől származó szérum Az eredményeket két referenciaként használt, kereskedelmi forgalomban lévő EIA próbával kapott eredményekkel vetettük össze. Vizsgált populáció /vizsgáló helyszín 1. vizsgálóhely 2. vizsgálóhely Szérumok száma Negatív Kétes Pozitív Specificitás Terhes nők Véradók Terhes nők Összesen A specificitás kiszámításánál a kétes mintákat pozitívnak tekintettük. [IC 95%] = 95%-os konfidencia-intervallum. 99,0% [96,5 99,9] (203/205) 98,8% [96,6 99,7] (249/252) 99,7% [98,1 100,0] (282/283) 99,2% [98,2 99,7] (734/740)

7 9.3 Érzékenység A relatív érzékenységet 113 db mintából elvégzett mérés alapján állapítottuk meg, melyeket két egymástól független helyszínről gyűjtöttünk össze. A minták az alábbiak szerint oszlottak meg: 35 minta 16 olyan betegtől, akik elsődleges CMV-fertőzés kinetikáját mutatták (2. vizsgálóhely) 49 minta a 3 kereskedelmi forgalomban lévő szerokonverziós panelből (1. vizsgálóhely) 29, az anti-cmv IgM antitestre pozitív minta (1. vizsgálóhely) Az eredményeket két referenciaként használt, kereskedelmi forgalomban lévő EIA próbával kapott eredményekkel vetettük össze. A 35 elsődleges CMV-fertőzéses mintából 29-ben sikerült különböző módszerekkel IgM antitesteket kimutatni. Mind a 29 mintában alacsony aviditású anti-cmv IgG antitestek voltak. 2 olyan minta volt, amelyek a referenciateszttel pozitívak lettek az anti-cmv IgM antitestre, de a Platelia CMV IgM próbával nem. Ebben a két mintában az anti-cmv IgG antitestek aviditása közepes volt, a minták megfeleltek a kevéssel a fertőződés után levett mintáknak. A 3 szerokonverziós panel eredményei az alábbiak szerint alakultak: Az egyik panelnél a Platelia CMV IgM próba 10 nappal hamarabb kimutatta az anti-cmv IgM antitesteket, mint a referencia teszt. A másik panelnél az anti-cmv IgM antitestek kimutatása egy időben történt (a referencia teszttel kétséges, a Platelia CMV IgM próbával pozitív). A harmadik panelnél a Platelia CMV IgM próba 3 nappal később mutatta ki az anti-cmv IgM antitesteket, mint a referencia teszt (a referencia teszttel kétséges, a Platelia CMV IgM próbával negatív). Végül a 29 mintából 28 bizonyult pozitívnak a Platelia CMV IgM próbával, egyet pedig kétesnek találtunk. 9.4 Keresztreakciók 156 mintából (115 olyan mintából, amely pozitív volt toxoplazmózisra, rubeolára, EBV-re, HSV-re, VZV-re, mumpszra, bárányhimlőre és HIV-re, valamint 41 olyan mintából, amely pozitív volt reumatoid faktorra, autoantitestre és heterofil antitestre, valamint myelomás betegektől származó mintából) álló panellel végeztünk anti-cmv IgM antitestszűrést Platelia CMV IgM próbával és kereskedelmi forgalomban kapható EIA próbával. A minták közül kettő lett pozitív a Platelia CMV IgM próbával: 1 szérum lett pozitív antirubeola IgG-re, amely a referencia teszt szerint negatív volt, valamint 1 reumatoid faktort tartalmazó szérum, amely a referencia teszt szerint is pozitív volt. 9.5 Pontosság Mérésen belüli pontosság (ismételhetőség): A mérésen belüli ismételhetőség meghatározásához egy negatív és három pozitív mintát teszteltünk 30 alkalommal egyazon mérésen belül. Minden mintánál meghatároztuk az arányt (minta-od/co). A négy mintához tartozó átlagos arányt, szórást (SD) és variációs koefficienst (%CV) az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Mérésen belüli pontosság (ismételhetőség) N = 30 Negatív minta Gyengén pozitív minta Pozitív minta Arány (minta-od/határérték) Erősen pozitív minta Átlag 0,11 1,13 1,90 3,75 SD 0,01 0,07 0,09 0,09 %CV 11,4% 6,2% 4,8% 2,3% Mérések közötti pontosság (reprodukálhatóság): A mérések közötti reprodukálhatóság meghatározásához négy mintát (egy negatív és három pozitív) teszteltünk két-két párhuzamos vizsgálattal, naponta 2-2 mérést elvégezve 20 napon át. Minden mintánál meghatároztuk az arányt (Minta- OD/CO). A négy mintához tartozó átlagos arányt, szórást (SD) és variációs koefficienst (%CV) az alábbi táblázatban foglaltuk össze:

8 Mérések közötti pontosság (reprodukálhatóság) N=80N = 80 Negatív minta Gyengén pozitív minta Pozitív minta Arány (Minta-OD/határérték) Erősen pozitív minta Átlag 0,18 1,06 1,76 3,28 SD 0,041 0,11 0,18 0,30 %CV 22,5% 9,9% 10,3% 9,1% 10 AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A CMV-fertőzés kizárólag a klinikai és a biológiai adatok együttes mérlegelése alapján diagnosztizálható. Egyetlen anti- CMV IgM antitesttiter mérés eredménye nem elegendő a nemrégiben kialakult citomegalovírus-fertőzés diagnózisának felállításához. A fertőzés korai szakaszában kizárólag a beteggel kapcsolatos összes információ, így a klinikai és biológiai adatok birtokában diagnosztizálható (az anti-cmv IgG antitestek mennyiségének jelentős növekedése 2 párhuzamosban vizsgált szérumból, 3 hét után új mintából megismételt vizsgálattal; jelentős mennyiségű anti-cmv IgM jelenléte; igazoltan alacsony IgG-aviditás). Az anti-cmv IgM antitestek jelenléte nem elegendő bizonyíték a nemrégiben kialakult fertőzés igazolására, mert az IgM a fertőzés után még több hónapig, sőt akár évekig is jelen lehet a vérben. Az IgM kimutatása után el kell végezni az anti-cmv IgG mennyiségi meghatározását, valamint az anti-cmv antitestképződés kontrollvizsgálatát legalább még egyszer, három hét elteltével egy új mintán. Amennyiben a nemrégiben kialakult elsődleges fertőzés során a mintát túl korán vizsgálják, elképzelhető, hogy még nem lesz jelen anti-cmv IgM antitest. Fertőzés gyanúja esetén három hét elteltével új mintát kell venni, és az IgMvizsgálatot újra el kell végezni. 11 GYÁRTÓI MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az előállított reagensek minőségügyi rendszerünk előírásainak megfelelően készültek a nyersanyagok bevételezésétől kezdve a végtermék forgalomba kerüléséig. Minden egyes tétel minőségellenőrző vizsgálatokon esett át, és kizárólag a meghatározott jóváhagyási feltételeknek való megfelelés után kerül piacra. Az egyes tételek előállítása és ellenőrzése során készült jegyzőkönyveket a Bio-Rad őrzi. 12 IRODALOM 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S Demmler G.J Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: Revello M.L., Gerna G Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306:

9

10

11 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)