2- KLINIKAI JELENTŐSÉG

Átírás

1 PLATELIA TOXO IgA TMB 1 lemez REAGENSKÉSZLET IgA TÍPUSÚ ANTI-TOXOPLASMA GONDII ELLENANYAGOK KVANTITATÍV KIMUTATÁSÁRA HUMÁN SZÉRUMBÓL, VAGY PLAZMÁBÓL ENZIM IMMUNASSAY MÓDSZERREL /06 1- FELHASZNÁLÁS A Platelia TM TOXO IgA TMB in vitro diagnosztikai reagenskészlet alkalmas anti-toxoplasma gondii (T. gondii) IgA kvalitatív kimutatására a humán szérumban vagy plazmában. 2- KLINIKAI JELENTŐSÉG A T. gondii egy protozoon, amely sok emlős és madárfajt megfertőz. Az állatokban és az emberekben egyaránt gyakori toxoplazmózis általában látens. A populáció fertőzöttsége a szerológiai vizsgálatok alapján országtól és korcsoporttól függően változik. A terhesség alatti toxoplazmózis szerepet játszik súlyos veleszületett rendellenességek kialakulásában (különösen a csökkent agyfunkcióéban), s olykor a halvaszületésben is. Amennyiben a fogamzás előtt Toxo IgG ellenanyag mutatható ki az asszonyok szervezetében, akkor nyugodtak lehetünk afelől, hogy a magzat védett a terhesség alatt esetleg bekövetkező toxoplazmózistól. A súlyos toxoplazmózisos fertőzésre való hajlam meglehetősen általános a szerzett immunhiányos tünetegyüttesben (AIDS) szenvedők körében, vagy a más okból immunhiányos betegek között. Ezek a fertőzések zömében a szervezetben található T.gondii ciszták HIV-fertőzés előtti reaktiválódásának tulajdoníthatók. A T. gondii fertőzés specifikus kimutatása nehéz lehet, és a parazita ritkán izolálható. A T. gondii antitest jelenlétének szerológiai igazolása arra utal, hogy a betegben jelen van a parazita. Ez a vizsgálati módszer az immunstátusz és a fertőzésre való fogékonyság meghatározásának széles körben elfogadott eszköze. Az ellenanyagok többféle izotípusára történő szűrés egyrészt lehetővé teszi a T. gondii fertőzés időpontjának megállapítását, és a közelmúltban bekövetkezett fertőzés esetében megkezdhető a megfelelő terápia. A fertőzés megelőzésére a terhes asszonyokat étkezési higiéniai tanácsokkal kell ellátni, az immunhiányos betegeknél kemoprofilaxis alkalmazható. 3- ALAPELV A Platelia TM TOXO IgA TMB teszt szilárd fázisú IgA antitest-befogásos kettős szendvics enzim-immunoassay módszeren alapul. Az IgA antitestek az anti-humán α-lánc ellenanyaggal bevont tesztlyukak falához kötődnek. A T. gondii-ra specifikus, peroxidázzal jelölt monoklonális antitest egy felületi antigén fehérjéje, a PM 30,000 ellen irányul, amely a humorális immunválasz egyik fő célpontja. Első lépés Az 1/101 (újszülött és gyermek szérum esetében 1/20) arányban hígított mintákat bemérjük a mikrolemez tesztlyukaiba. Az 1 órás, 37 C-os inkubálás során a mintában jelenlevő IgA ellenanyagokat befogja a szilárd fázis. Inkubálás után az IgG-t és más szérumfehérjéket többszöri mosással távolítjuk el. Második lépés T. gondii antigént (T. gondii Ag, RH törzs) és torma peroxidázzal jelölt anti-t. gondii monoklonális ellenanyagokat (ACM-POD) tartalmazó oldatot mérünk be a tesztlyukakba. Az 1 órán át tartó, 37 C-os inkubálás során a szilárd fázis által a mintából befogott T. gondii IgA ellenanyagok megkötik a T. gondii antigén konjugát komplexet. A fölöslegben maradt T. gondii antigént és konjugátot többszöri mosással távolítjuk el. Harmadik lépés Az immunkomplex (anti-iga anti-t. gondii IgA T. gondii antigén anti-t. gondii Ag konjugát) jelenlétét úgy mutatjuk ki, hogy a peroxidáz szubsztrátját, valamint színreakciót létrehozó kromogént tartalmazó oldatot adunk hozzá 1

2 Negyedik lépés Félórás, szobahőmérsékleten (18 30 C ) történő inkubálást követően az enzimreakciót 1 N kénsav hozzáadásával állítjuk le. A 450/620 nm-en leolvasott optikai denzitás arányos a mintában található T. gondii IgA ellenanyag mennyiségével. A T. gondii IgA antitestek jelenlétét egy adott mintában úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk a minta optikai denzitását a cutoff kontroll szérum optikai denzitásával. 4- CSOMAGOLÁS Minden reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célokra használható. R1 R2 R3 R4a R4b R6a Címke Reagens Mennyiség Microplate Concentrated Washing Solution (10x) Negative Control Cut-off control Positive Control Antigen Mikrolemez (felhasználásra kész): 12 db, egyenként 8, letörhető tesztlyukas csík, anti-α lánc ellenanyaggal érzékenyítve. Koncentrált mosóoldat (10x): TRIS-NaCl puffer (ph: 7.4), 1% Tween 20. Tartósítószer: 0.01% Thimerosal. Negatív kontroll: T.gondii IgA ellenanyagra, HBs Agra, HIV1 és HIV2, valamint HVC ellenanyagokra negatív humán szérum. Tartósítószer: 0.01% Thimerosal. Cut-off kontroll: T.gondii IgA ellenanyagra pozitív, HBs Ag-ra, HIV1 és HIV2, valamint HVC ellenanyagokra negatív humán szérum. Tartósítószer: 0.01% Thimerosal. Pozitív kontroll: T.gondii IgA ellenanyagra pozitív, HBs Ag-ra, HIV1 és HIV2, valamint HVC ellenanyagokra negatív humán szérum. Tartósítószer: 0.01% Thimerosal. 1 lemez 1 üveg 100 ml 1 fiola 1 ml 1 fiola 1 ml 1 fiola 1 ml T. gondii antigén: liofilizált (RH törzs) 4 fiola 3 ml R6b Conjugate (80x) Konjugát: torma peroxidázzal konjugált, T. gondii (P30) elleni egér monoklonális antitest, koncentrált (80x). Tartósítószer: 0.01% Thimerosal. 1 fiola 0.4 ml R7 Diluent Minta- és konjugát hígító (felhasználásra kész): TRIS-NaCl puffer (ph: 7.7 ± 0.15), borjú szérumalbumin, 1% Tween 20 és fenolvörös. Tartósítószer: < 0.01% Thimerosal. 2 üveg 80 ml R8 TMB Substrate Buffer TMB szubsztrát puffer: 0.015% hidrogénperoxidot és 4% dimetilszulfoxidot (DMSO) tartalmazó, ph 4.0 citromsav és nátrium-acetát oldat. 1 üveg 60 ml R9 TMB Chromogen Kromogén: 0.25%-os tetrametil-benzidint (TMB) oldat. 1 üveg 5 ml R10 Stopping Solution Leállító oldat (felhasználásra kész): 1 N kénsav oldat 1 üveg 28 ml 5- KEZELÉSI ELŐÍRÁSOK Az eredmények minősége azon múlik, hogy betartjuk-e a GLP ajánlásokat. Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. Azonos vizsgálaton belül ne használjuk különböző gyártási számú kitek reagenseit. Megjegyzés: az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is alkalmazhatók, de egy vizsgálaton belül azonos sorozatba tartozó terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 10x, kék színű), szubsztrát puffer (R8, címke: TMB buf., kék színű), kromogén (R9, címke felirata: TMB oldat, zöld színű) leállító oldat (R10. címke felirata: 1 N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más termékünkhöz is használhatók. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. 2

3 Használatbavétel előtt várjunk 30 percet, hogy a reagensek fölvegyék a szobahőmérsékletet. Figyelmesen oldjuk fel vagy hígítsuk a reagenseket, hogy azok ne szennyeződjenek. Ne végezzük a vizsgálatot agresszív gőzök (savas, lúgos, aldehid) vagy por jelenlétében, mert megváltoztathatja a konjugát enzimaktivitását. Alaposan elmosott és ionmentes vízzel öblített üvegárut, vagy egyszerhasználatos eszközöket használjunk. Ne hagyjuk beszáradni a mikrolemezt a mosás után, a reagensek adagolása előtt. Az enzimreakció nagyon érzékeny a fémionokra. Ezért vigyázzunk, hogy fémes eszköz ne érintkezhessen a konjugát és szubsztrát oldatokkal. Az előhívó oldatnak (szubsztrát puffer + kromogén) színtelennek kell lennie. Ha a hígítás utáni percekben kék szín jelenik meg, akkor a reagens nem használható, azt ki kell cserélni. Az előhívó oldat elkészítéséhez tiszta egyszerhasználatos műanyag edényt, vagy olyan üvegedényt használjunk, amelyet előzőleg 1 N sósavval mostunk át és desztillált vízzel alaposan kiöblítettünk, majd megszárítottunk. A kész oldatot fénytől védve kell tárolni. Minden újabb mintához új pipettahegyet használjunk. A műveletsorozat igen fontos része a tesztlyukak mosása. Nagyon figyeljünk a kellő számú mosás kivitelezésére, és gondoskodjunk minden tesztlyuk teljes feltöléséről, illetve teljes kiürítéséről. Az elégtelen mosás pontatlan eredményekhez vezethet. Sohase használjuk ugyanazt a tartályt a konjugát és az előhívó oldat adagolásához. Ellenőrizzük a pipetták és egyéb berendezések pontosságát és megfelelő működését. Ne változtassunk az előírt műveleteken. MUNKAVÉDELMI ELŐÍRÁSOK Minden reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célra használható. A reagensek és a minták kezelésekor viseljünk egyszerhasználatos védőkesztyűt. Ne pipettázzunk szájjal. A reagensek gyártásához használt humán eredetű anyagokat bevizsgálták, és negatívnak találták a hepatitis B vírus felületi antigénjére (HbsAg), a hepatitis C vírus elleni (anti-hcv) antitestekre és a humán immunhiányos tünetegyüttest okozó vírus elleni antitestekre (anti- HIV1 és anti-hiv2). Mivel azonban egyetlen módszer sem garantálja tökéletesen, hogy nincsenek fertőző ágensek a reagensekben, továbbá minden betegmintát is potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni, ezért mindent a szokásos elővigyázattal kell kezelni. A mintákkal és a humán eredetű reagensekkel közvetlen érintkezésbe került eszközöket, valamint mosófolyadékot fertőzőnek kell tekinteni. Ügyeljünk arra, hogy a minták, vagy a mintákat tartalmazó oldatok ne ömöljenek ki. Az elszennyeződött felületeket 10%-os hypoval kell megtisztítani. Ha a szennyező folyadék savas kémhatású, akkor először nátrium-bikarbonáttal semlegesítsük a felületet, majd hypoval tisztítsuk meg, és szűrőpapírral szárítsuk fel. A tisztításhoz felhasznált eszközöket speciális, szennyeshulladék-gyűjtő tartályba kell dobni. Fertőtlenítés után az alábbi módszerekkel ártalmatlanítsuk a mintákat, a humán eredetű reagenseket és az előzőekkel érintkezésbe került eszközöket és anyagokat: - áztassuk 30 percre fertőtlenítő oldatba úgy, hogy a végső koncentráció 5%-os legyen a nátrium-hipokloritra nézve, - vagy autoklávban sterilezzük 121 C-on legalább 2 óráig. A legalább 1 óráig tartó, 121 C-os autoklávozás a legjobb módszer a HIV vírusok és a HB vírusok inaktiválására. FIGYELEM: NÁTRIUM-HIPOKLORITOT TARTALMAZÓ OLDATOT NE TEGYÜNK AUTOKLÁVBA. A vegyszereket a Helyes Laboratóriumi Gyakorlatnak (GLP) megfelelően kell kezelni és ártalmatlanítani. Vigyázzunk, hogy a szubsztrát puffer, a kromogén, vagy a leállító oldat ne kerüljön bőrre, vagy nyálkahártyára, mert mérgezést, irritációt, ill. égési sérülést okozhatnak. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: 6- FELDOLGOZHATÓ MINTÁK 1. A feldogozásra alkalmas minták : szérum, vagy plazma (EDTA, citrát, vagy heparin-ban levett) 2. A vérminták kezelése, feldolgozása, és tárolása során tartsuk be az alábbi előírásokat : A vénás vérminták vételénél szokásos elővigyázatossági rendszabályok szerint járjunk el. Szérum minták készítéséhez centrifugálás előtt hagyjuk a vérmintákat teljesen megalvadni. A mintavételi csöveket tartsuk mindig lezárva. Centrifugálás után válasszuk el a szérumot vagy a plazmát az alvadéktól, vagy vörösvérsejtektől, és tároljuk szorosan lezárt kémcsőben. Ha a vizsgálatot 7 napon belül elvégezzük, akkor a minták +2-8 C között tárolhatók. Ha a vizsgálatot nem tudjuk 7 napon belül elvégezni, vagy a mintákat szállítani kell, fagyasszuk le -20 C-on, vagy alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat legfeljebb háromszor olvasszuk fel. 3

4 A korábban lefagyasztott mintákat a felolvasztás után, a vizsgálat előtt alaposan keverjük fel. A vizsgálatot a savók 1/101 hígításával végezzük. Mivel az újszülöttek és csecsemők IgA ellenanyagszintje alcsonyabb, ezeknél a mintáknál csak 1/20 hígítást alkalmazzunk g/l albumint, 100 mg/l bilirubint, 36 g/l trioleinnek (triglicerid) megfelelő lipidet tartalmazó lipémiás, és max. 10 g/l hemoglobint tartalmazó hemolizált minták nem befolyásolják az eredményt. 4. Ne melegítsük a mintákat. 7- A VIZSGÁLAT KIVITELEZÉSE 7.1. Szükséges, de nem szállított eszközök Vortex keverő. Mikrolemez leolvasó 450 és 620 nm-es szűrővel (*). Mikrolemez-inkubátor (*) vagy termosztált vízfürdő, 37±1 C-os (*). Automata, félautomata vagy kézi mikrolemez mosó (*). Biológiailag veszélyes hulladék gyűjtő tartály. Nátrium-hipoklorit (hypo) és nátrium-bikarbonát. Desztillált, vagy ionmentes víz. 25, és 1000 ml-es osztott mérőhenger. Egyszerhasználatos gumikesztyű Védőszemüveg. Szűrőpapír. Automata vagy félautomata, állítható vagy fix pipetták vagy többcsatornás pipetták µl, és 1, 2 és 10 ml kiméréséhez és adagolásához. Egyszerhasználatos kémcsövek. (*) A műszaki osztályunk által javasolt készülékek tárgyában forduljon hozzánk a részletes felvilágosításért A reagensek elkészítése és tárolása R1: Vágjuk fel a csomagolást cm-rel a vonal fölött. A fel nem használt tesztcsíkokat azonnal helyezzük vissza a zacskóba. Ügyeljünk a nedvszívó behelyezésére is. Gondosan zárjuk vissza a zacskót és tároljuk +2-8 C-on. R2: 1:10 arányban hígítsuk az oldatot desztillált vízzel. Kézi mosáshoz egy 12-csíkból álló lemezhez készítsünk 350 ml-t. R3, R4a, R4b: Hígítsuk 1/101 arányban R7 reagenssel (pl.: 10 µl R ml R7) R6a: Oldjuk fel a liofilizált antigént 3 ml R7 hígító oldattal. A feloldott antigén oldatnak teljesen víztisztának kell lennie. Egy ampulla 3 tesztcsíkhoz elegendő. Megjegyzés: ha a reagens feloldás után zavaros marad, nem használható fel. Ez esetben ki kell cserélni. A maradék antigén oldatot azonnal le kell fagyasztani -20 C-on, így még három hónapig tárolható. A lefagyasztott antigén egynél többször nem olvasztható fel! R6b: a peroxidázzal jelzett monoklonális ellenanyag 80-szoros koncentrációjú oldat. Egy teljes mikrolemezhez oldjunk ml R6b konjugátumot 12 ml R7 hígító oldatban. Alaposan keverjük össze. A higított konjugátumot azonnal fel kell használni. Konjugát oldat: higított R6a + higított R6b: egy teljes mikrolemezhez keverjünk össze 12 ml R6b higított konjugátumot és 12 ml R6a feloldott antigén oldatot (4 ampulla) R9: hígítsuk 1:11 arányban R8 szubsztrát pufferrel (például 1 ml R ml R8) A felnyitott és elkészített reagensek tárolása R1: a csomagolás felbontása után a fel nem használt tesztcsíkok C -on, gondosan visszazárt csomagolásban 1 hónapig eltarthatók R2: a kihígított oldat C -on tárolva 2 hétig eltartható. A koncentrált oldat mikrobiológiai szennyezéstől mentesen, C -on a cimkén feltüntetett lejárati ideig tárolható. R6: a kihígított oldat szobahőmérsékleten ( C ) 4 órán át stabil R9: a kihígított oldat szobahőmérsékleten ( C ), sötétben 6 órán át stabil R3, R4a, R4b, R7, R10: a reagensek szennyeződéstől mentesen, C -on tárolva felbontás után is eltarthatók a cimkén jelzett lejárati ideig A vizsgálat kivitelezése Szigorúan tartsuk magunkat a javasolt tesztprotokollhoz. Az eredmények validálásához minden futtatásnál használjuk a kalibráló szérumokat. Felhasználás előtt minden reagenst hagyjunk szobahőmérsékletűre melegedni ( C ). 1) Készítsük el a minták pipettázási listáját. 2) Készítsük el az R2 hígított mosófolyadékot (l. 7.2 fejezet). 3) Vegyük ki a keretet és a csíkokat (R1) a védőcsomagolásból. 4) Mossuk át egyszer a csíkokat a hígított mosófolyadékkal (R2). Fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt, és finoman kocogtassuk, hogy az összes mosófolyadékot eltávolítsuk. 4

5 5) Hígítsuk a vizsgálandó szérumokat 1/101 arányban: adjunk 10 µl mintát 1 ml R7 hígítóhoz. A kontrollokból ugyanígy készítsünk 1:101 hígítást. Vortex keverővel alaposan keverjük meg a mintákat. 6) Mérjünk be 200 µl 1/101 hígítású kontrollt (R3, R4a, R4b) és betegmintát a lyukakba az alábbiak szerint: - A1: 200 µl negatív kontroll (R3). - B1: 200 µl cut-off kontroll (R4a). - C1: 200 µl cut-off kontroll (R4a). - D1: 200 µl pozitív kontroll (R4b). - E1,F1,G1 stb.: 200 µl minta. 7) Fedjük le öntapadó fóliával a mikrolemezt, óvatosan rányomva a fóliát az egész felületre, hogy szorosan zárjon. Inkubáljuk a vízfürdőn vagy mikrolemez inkubátorban 1 óra ± 5 percig 37±1 C-on. 8) Az inkubáció alatt készítsük el a szükséges mennyiségű R6a + R6b konjugát antigen oldatot (l. 7.2 fejezet). 9) Az első inkubáció végeztével vegyük le az öntapadó fóliát, szívassuk ki a tesztlyukakból azok tartalmát és ürítsük ki egy (nátrium-hipokloritot tartalmazó) szennyesgyűjtő tartályba, majd mossuk 3-szor a hígított mosófolyadékkal (R2d). Fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt, és finoman kocogtassuk, hogy az összes mosófolyadékot eltávolítsuk a tesztlyukakból. 10) Mérjünk be 200 µl konjugátum (R6a+R6b) oldatot minden tesztlyukba. Az oldatot felhasználás előtt finoman rázzuk fel. 11) Fedjük le öntapadó fóliával a mikrolemezt, óvatosan rányomva a fóliát az egész felületre, hogy szorosan zárjon. Inkubáljuk a vízfürdőn vagy mikrolemez inkubátorban 1 óra ± 5 percig 37±1 C-on. 12) Vegyük le az öntapadó fóliát, szívassuk ki a tesztlyukakból azok tartalmát, majd mossuk 4-szer a fentiek szerint. Fordítsuk le szűrőpapírra a lemezt, és finoman kocogtassuk, hogy az összes mosófolyadékot eltávolítsuk. 13) Készítsük el az enzim előhívó oldatot (R8 + R9) a 6.2 fejezetben leírtak szerint és mérjünk 200 µl-t minden tesztlyukba. Hagyjuk sötétben és szobahőmérsékleten ( C) 30 percig, hogy lejátszódjék a reakció. Ennél a műveletnél ne rakjunk rá öntapadó fóliát. 14) Mérjünk be 100 µl leállító oldatot (R10) minden tesztlyukba. Ugyanabban a sorrendben és adagolási sebességgel dolgozzunk, mint az előhívó oldatnál. 15) Óvatosan töröljük le a lemez alját. 450/620 nm-en olvassuk le az optikai denzitást egy lemezleolvasó fotométerrel a reakció leállításától számított 30 percen belül (a leolvasásig óvjuk a tesztcsíkokat a fénytől). 16) Az eredmények kiszámítása előtt ellenőrizzük, hogy a leolvasás eredménye egyezik-e a pipettázási listával. 8- AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE 8.1. A vizsgálat érvényessége Minden vizsgálathoz használjunk minden kalibráló oldatot. Az érvényesség megállapításához az alábbi kritériumoknak kell teljesülniük: Optikai denzitás: - R4b OD > Arány: - OD R4a / OD R3 > OD R4b / OD R4a > Ha az eredmények a feltételeket nem elégítik ki, akkor a vizsgálatot meg kell ismételni A cut-off érték számítása (CO) CO = R4a cut-off kontrollok OD értékeinek átlaga 8.3. A minta arány számítása minta arány = minta OD / CO (R4a OD értékek átlaga) Az eredmények fixációs index formájában is kifejezhetők: a minta fixációs indexe = (minta OD OD MR4a)/(ODR4b OD MR4a) x 10 (ahol OD M R4a = CO, azaz a cut-off kontrollok OD értékeinek átlaga) 5

6 8.4. Az eredmények kiértékelése Minta arány Eredmény Értékelés/javaslatok 1 1> Minta arány 0.8 Pozitív Kétes A mintát meg kell vizsgálni specifikus IgM jelenlétére és anti-t. gondii IgG mennyiségi meghatározás szükséges. Az eredményt nappal később konfirmálni kell. A kétes eredményeket nappal később konfirmálni kell. A mintát meg kell vizsgálni specifikus IgM jelenlétére és anti-t. gondii IgG mennyiségi meghatározás szükséges. < 0.8 Negatív Ha specifikus IgM nem mutatható ki, valószínűleg nem áll fenn a parazita okozta friss fertőzés. A fixációs index segítségével ugyanazon betegtől származó két szérummintából félkvantitatív eredményt kaphatunk. A 0 és 2 közé eső index határesetet jelent Hibaforrások Az érvénytelen, vagy megismételhetetlen reakciókat gyakran az alábbiak okozzák: A mikrolemez mosása nem megfelelő. A negative minták magas antitest titerrel rendelkező szérummal vagy plazmával szennyeződtek. Az előhívó oldat oxidálószerekkel (hypo, fémionok ) szennyeződött. A leállító oldat elszennyeződött. 9- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI A közelmúltban bekövetkezett parazita okozta fertőzést csak a klinikai és a szerológiai adatok együttes figyelembevételével lehet megállapítani. Egyetlen szérummintával kapott eredmény nem elegendő bizonyíték a közelmúltbeli fertőzés diagnózisának felállításához. A friss fertőzés csak a klinikai és a szerológiai adatok együttes értékelésével állapítható meg. Ehhez szükséges, hogy szignifikáns növekedést tapasztaljunk két, legalább három hét időkülönbséggel levett szérumminta anti-t. gondii IgG antitest titere között, és ezzel egyidőben anti-t. gondii IgM legyen jelen megfelelő titerben. A terhesség folyamán feltétlenül szükséges az anti-t. gondii IgM kimutatása, mivel az IgG ellenanyagok csak az IgM ellenanyagok után jelennek meg (Platelia TM Toxo IgM TMB). 10- MEGBÍZHATÓSÁG A Platelia TM Toxo IgA TMB alábbiakban összefoglalt megbízhatósági jellemzőit 3 helyszínen vizsgálták újszülöttektől, csecsemőktől és terhes asszonyoktól vett mintákon. A specifitási és szenzitivitási adatokat Platelia TM Toxo IgA OPD (kód 72733) teszttel határozták meg, ismert IgG és IgM szerológiai státuszú, klinikailag dokumentált mintákon. A Platelia TM Toxo IgA OPD (kód 72733) és Platelia TM Toxo IgA TMB (kód 72237) tesztekkel összehasonító vizsgálatokat végeztek. Specifitási vizsgálatok A vizsgálatokat 405 páciens 430 mintáján végezték, melyek közül 23 minta 21 újszülöttől, és 73 minta 50 csecsemőtől származott, akiken a toxoplazmózis biológiai, vagy klinikai tünetei nem voltak észlelhetők, további 143 minta a krónikus fertőzés stádiumában levő betegtől, és 191 minta nem immunizálódott pácienstől származott. A vizsgált populáción mért specifitás 99.8% volt (429/430). Egy újszülött mintája IgA eredménye kétes, IgM eredménye negatív volt. Érzékenységi vizsgálatok A vizsgálatot 118 ismert klinikai státuszú páciens 287 mintáján végezték. 13 minta 8 foetustól származott, akiknél az anya a terhesség alatt toxoplazmózissal fertőződött 187 minta 23 újszülöttől származott, akiknél az anya a terhesség alatt toxoplazmózissal fertőződött (1.sz. vizsgálati helyszín) 87 minta az akut fertőzés stádiumában levő betegtől származott (45 minta az 1.sz. vizsgálati helyszínről, 42 a 2.sz. vizsgálati helyszínről) IgA ellenanyagot 8 foetusból 4 esetben sikerült kimutatni (az IgA jelenléte foetusban függ az anya fertőződésének idejétől és a foetalis vér levételének időpontjától is). Újszülötteknél 15 esetben születéskor, 2 esetben méhen belül és 6 esetben hetekkel a születés után volt IgA ellenanyag kimutatható. Az akut fertőzés stádiumában levő 87 betegnél 69 esetben volt IgA ellenanyag kimutatható. 6

7 Összehasonlító vizsgálatok A Platelia TM Toxo IgA OPD (kód 72733) és Platelia TM Toxo IgA TMB (kód 72237) tesztekkel összehasonító vizsgálatokat végeztek 252 negatív és pozitív mintán, melyek terhes anyáktól származtak. Az eredmények az alábbiak voltak: Platelia TM Toxo IgA TMB (72737) Platelia TM Toxo IgA (72733) Negatív Kétes Pozitív Összesen Negatív Kétes 1* Pozitív 0 1* Összesen 213 1* * Mindkét teszttel ellenőrizve mindkét minta azonos eredményt adott A két teszt között az egyezés 100% volt. PONTOSSÁG Teszten belüli ismételhetőség: 3 pozitív és 1 negatív mintát mértek le 30-szor ugyanazon vizsgálati sorozatban. Minta Negatív Pozitív 1 Pozitív 2 Pozitív 3 OD/CO arány Átlag SD CV% Tesztek közötti ismételhetőség: A négy minta (3 pozitív és 1 negatív) mindegyikét duplikálva, naponta két alkalommal mérték, 24 napon keresztül. Minta Negatív Pozitív 1 Pozitív 2 Pozitív 3 Átlag SD CV% KERESZTREAKCIÓK 136 ismerten CMV, EBV, HSV, VZV, Mumpsz, Kanyaró és Rubeola pozitív és 39 rheumatoid faktorra, autoantitestekre és heterofil ellenanyagokra pozitív, valamint myelomás beteg savóját Platelia TM Toxo IgA TMB teszttel vizsgálva minden minta negatívnak bizonyult (175/175). 11- HIVATKOZÁSOK 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immunodeficiency virus-infected patients ( ). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients.aids 1996; 10,

8 7. DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des méthodes simples, pour des questions précises. Le concours médical 1985; , DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti- 11. Toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1985; 62, SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F.: Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

9 AZ ELJÁRÁSI REND ÖSSZEFOGALALÓJA 1. Állítsa be a termosztáttal ellátott inkubátor hőmérsékletét 37 ± 1 C-ra. 2. Hígítsa 1/11 arányban a kromogén R9-et az R8 szubsztrátumban (solution de révélation : R8+R9) 3. Hígítsa az R2 mosófolyadékot 1/10 arányban (R2d) 4. Mossa ki mindegyik üreget 1-szer a hígított mosófolyadékkal (R2d) 5. Hígítsa az R7-tel a kontroll- és a mintát tartalmazó oldatot 1/101 arányban 6. Ossza szét az 1/101 arányban hígított kontrollokat és a mintákat az üregekbe az alábbiak szerint: A R3 S5 B R4a S6 C R4a S7 D R4b S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Inkubálja 1 órán keresztül 37 C-on. 8. Készítse el a reakcióhoz szükségs R6 konjugátum (R6a + R6b) munkaoldatot. 9. Szívja le, majd mossa 3-szor a hígított mosófolyadékkal (R2d) 10. Adagoljon 200 µl konjugátum oldatot (R6) minden üregbe. 11. Inkubálja 1 órán keresztül 37 C-on. 12. Szívja le, majd mossa 4-szer a hígított mosófolyadékkal (R2d) 13. Adagoljon 200 µl előhívó oldatot (R8+R9) minden üregbe. 14. Inkubálja 30 percig szobahőn ( C), fénytől védve. 15. Adagoljon 100 µl stop-oldatot (R10) minden üregbe. 16. Olvassa le spektrofotométerrel az abszorbancia-értékeket 450/620 nm-en. 9

10 10

11 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /06 Fax : +33 (0)