CANDIDA ALBICANS ANTIGÉNEK CANDIDA ALBICANS POZITÍV KONTROLL SZÉRUM CANDIDIASIS SZERODIAGNOSZTIZÁLÁSA IMMUNPRECIPITÁCIÓS MÓDSZERREL

Átírás

1 CANDIDA ALBICANS ANTIGÉNEK CANDIDA ALBICANS POZITÍV KONTROLL SZÉRUM CANDIDIASIS SZERODIAGNOSZTIZÁLÁSA IMMUNPRECIPITÁCIÓS MÓDSZERREL

2 1- KLINIKAI JELENTŐSÉG A Bio-Rad többféle Candida albicans antigént gyárt a candidiasis immunprecipitációs szerodiagnosztikai kimutatására. Rendszerint könnyebb a candidiasist úgy diagnosztizálni, hogy kimutatjuk a gombára specifikus antitesteket a beteg szérumában, mivel a negatív hemokultúra eredmény candidiasis esetén igen gyakori. Pozitív hemokultúránál az immunológiai diagnosztizálással verifikálhatjuk, hogy az izolált Candida nem szennyeződés eredménye. 2- ALAPELV A Bio-Rad antigéneket különféle immunprecipitációs reakciókra használhatjuk. Különösen hasznos az alábbi két technika: IMMUNELEKTROFORÉZIS (IEP) ELEKTROSZINERÉZIS (ES) 3- CSOMAGOLÁS Candida albicans antigének, kódszám üvegcse liofilizált antigén, amelyet 1 ml steril desztillált vízben kell feloldani (kb. 10 reakcióra elegendő). - Candida albicans metabolikus antigén - Candida albicans szomatikus antigén Candida albicans pozitív kontroll szérumok, kódszám üvegcse liofilizált Candida albicans-ellenes nyúlszérum, amelyet 1 ml steril desztillált vízben kell feloldani. 4- ÖSSZETÉTEL Antigének (két típus): Metabolikus antigén, 10 napig tartó, 30 C-on történő inkubálás után a tenyészet szűrésével nyert antigén. Szomatikus vagy sejtes antigén, fiatal tenyészetből (3 nap, spóra nélküli) nyert antigén, amelyet 30 C-on roncsoltunk és homogenizáltunk. 5- TÁROLÁS Liofilizált formában a 2-8 C-on és száraz helyen tárolt reagensek a termék dobozán feltüntetett szavatossági időpontig stabilak. Feloldás után az antigéneket több hónapig is lehet tárolni -20 C-on. Ne fagyasszuk le és engedjük fel többször az antigént. 6- MINTÁK 1. A vizsgálatot csak natív szérummintából szabad elvégezni. 2. A szérumminták kezelésének, feldolgozásának és tárolásának tekintetében az alábbi ajánlásokat kövessük: - A szérummintákat a rutinelőírások szerint vegyük. - Centrifugálás előtt hagyjuk teljesen megalvadni a mintákat.

3 - Mindig tartsuk zárva a kémcsöveket. - Centrifugálás után válasszuk el a szérumot és tároljuk szorosan lezárt mintatartó csőben. - A minták 2-8 C között tárolhatók, amennyiben a szűrést 24 órán belül elvégezzük. - Ha a mérés nem végezhető el 24 órán belül, vagy a mintákat szállítani kell, akkor fagyasszuk le 20 C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten. - Lehetőleg csak egyszer engedjük fel a mintákat fagyott állapotból. A korábban lefagyasztott mintákat felengedés után alaposan keverjük össze a vizsgálat előtt. 3. A magas albumin- vagy bilirubinszintnek tulajdonítható esetleges kölcsönhatásokat nem vizsgáltuk. Ne dolgozzunk lipémiás vagy hemolizált mintákkal. 4. Ne melegítsük a mintákat. 7- HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A) A MÉRÉSHEZ SZÜKSÉGES, DE A FORGALMAZÓ ÁLTAL NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK Nátrium-barbiturát 1 N sósav Desztillált víz Barbitursav Glicin Tris puffer, 0,05 M, 7-es ph-jú Agaróz B) IMMUNELEKTROFORÉZIS (1. felvétel) Az immunelektroforézist (Grabar) a mikroszkopizáláshoz használt üveg tárgylemezeken lehet végezni. Tisztított agarból vagy agarózból 1%-os koncentrációban, 8,2-es ph-jú barbitál pufferoldattal készítsünk gélt (adjunk hozzá 1/ koncentrációban mertiolátot). Vágjunk a gélbe egy 60 mm hosszú és 2 mm széles vályút, és 2 db, 2-2 mm átmérőjű lyukat a vályú két oldalán, attól 4-4 mm távolságra (l. ábra). Mérjünk be 20 µl hígítatlan antigént a két oldalsó lyukba. Másfél órára kapcsoljunk 5 V/cm feszültséget a lemez két végére. Mérjük be a szérumot a középső vályúba, s hagyjuk, hogy párás levegőn, szobahőmérsékleten (18-30 C) 48 órán keresztül bediffundálhasson a gélbe. A harmadik napon 24 órára merítsük mosóoldatba a lemezeket. A negyedik napon olvassuk le a lemezeket. A csapadékképződés különlegesen finom megnyilvánulásainak leolvasásához szükségünk lehet Coomassie-kék festésre. C) ELEKTROSZINERÉZIS (1. ábra) Az elektroszinerézis (Bussard), avagy reverz elektroforézis agaróz géllel vagy cellulózacetáttal végezhető. Egyszerű technika, nagyon érzékeny és gyors, ami nagy számú szérum szűrésekor igen hasznos. Ha agaróz gélt és mikroszkóp tárgylemezeket használunk, akkor az ábra szerint lyukakat vághatunk a gélbe : az antigének a katódos oldalra kerülnek (-), a szérumok pedig az anódos oldalra (). A 2 mm átmérőjű lyukak között 6 mm távolságnak kell lennie. Az antigéneknek szánt lyukakba ½- és és ¼-es hígítású tiszta oldatokat töltsünk. A szérumnak fenntartott lyukakba 20 mikroliter kerüljön. 1,5 óráig helyezzük 5 V/cm feszültség alá a lemezt. A reakciót rendszerint már a vándorlás befejeződése után leolvassuk.

4 Ha Coomassie-kékkel is festenünk kell, akkor előtte kétszer mossuk a lemezt : először fiziológiás szérummal (1 éjszakán át), majd desztillált vízzel (24 órán át). Ezután szárítsuk meg. Ajánlatos pozitív kontrollokkal párhuzamos mérést végezni ugyanazokkal a lépésekkel, mint amelyeket az antigéneknél alkalmaztunk. D) A REAGENSEK ELKÉSZÍTÉSE 1) Pufferek - VERONAL, ph 8,2 Nátrium.barbiturát...15,85 g HCl 1N...23 ml H 2 O q.s.p ml - BARBITÁL NÁTRIUM-BARBITURÁT TRIS GLICIN (BBNa TG) ph 8,8 A....Nátrium-barbiturát 65 g Barbitursav...10,35 g H 2 O q.s.p ml B....Glicin 281 g Tris g H 2 O q.s.p ml Ha az A és B oldatból azonos mennyiséget összekeverünk egymással, akkor 8,8-as ph-jú, 0,08-as ozmolaritású puffert kapunk. 2) 1%-os agaróz (súly/térfogat) Agaróz...10 g H 2 O ml Forraljuk fel, majd hűtsük le (kb. 60 C-ra). Adjunk hozzá : Barbitál puffert (ph 8,2) ml vagy BBNa TG puffert (ph 8,8) ml (desztillált vízzel 50%-kal hígítva).

5 E) ÖSSZEFOGLALÓ TÁBLÁZAT Immunelektroforézis Elektroszinerézis Pufferek Barbitál puffer (ph 8,2) Barbitál puffer nátrium tris glicin veronál (ph 8,8) Barbitál puffer (ph 8,2) Barbitál puffer nátrium tris glicin veronál (ph 8,8) Feszülts Időtartam ég 5 V / cm 90 perc 25 V / cm 60 perc 5 V / cm 90 perc 10 V / cm 60 perc Festék Coomassiekék Coomassiekék 8- KIÉRTÉKELÉS Ha Candida albicans antigén kimutatására használjuk az immunprecipitációs technikát, akkor a specifikus csapadékívek jelenléte Candida fertőzésre utal. Mivel az elektroszinerézis gyorsabb az immunelektroforézisnél, ezért alkalmasabb a szűréshez. Mindazonáltal ha ezzel a technikával pozitívnak találunk egy szérumot, akkor azt még immunelektroforézissel konfirmálni kell. A precipitációs ívek már az első 24 óra elteltével láthatóvá válnak, de az egyértelmű leolvasáshoz a negyedik napig kell várnunk. A finom részletek kiemeléséhez Coomassie-kék festéket használunk. A leggyakrabban előforduló ívek enzimaktivitásra utalnak. Ez speciális reakciókkal tehető nyilvánvalóvá (Biguet et al.), de azok nem szükségesek a rutin diagnosztikához. Egyetlen precipitációs ív már elegendő a Candida albicans fertőzés megállapításához. Az ívek száma arányos azzal, hogy hogyan terjed tovább a betegség a különféle szervcsoportokra, hogyan jelenik meg septicaemia állandó, több mint 10 napon át tartó hőemelkedés után, az endocarditis és a krónikus mucodermalis granulomas candidiasis. 9- MINŐSÉG / A KONTROLL MINŐSÉGÉNEK ELLENŐRZÉSE a) Candida albicans antigének A Candida albicans antigének minőségét candidiasis-pozitív kontroll szérumokkal ellenőrizzük (anti- Candida albicans nyúlszérum: az állatot standardizált szomatikus és metabolikus antigénekkel immunizálják). Immunelektroforézis (ph = 8,2) Precipitációs ív megjelenése szomatikus Ag metabolikus Ag C. albicans Ag / anti-c. albicans pozitív kontroll szérum 3 6 ív 2 4 ív

6 C. albicans Ag / anti-aspergillus pozitív kontroll szérum - - b) Pozitív kontroll szérum Immunelektroforézis (ph = 8,2) Precipitációs ív megjelenése szomatikus Ag metabolikus Ag anti-c. albicans pozitív kontroll szérum / C.albicans Ag 3 6 ív 2 4 ív anti-c. albicans pozitív kontroll szérum / Aspergillus Ag A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az összes termékünk a saját minőségellenőrző rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál. 11- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI Az candidiasis diagnózist csak azután lehet fölállítani, hogy klinikai, radiológiai és biológiai (mikrobiológiai, szövettani, szerológiai) vizsgálatokat is végeztünk. A külön-külön kapott eredményeket elővigyázattal kell értelmezni. 12- HIVATKOZÁSOK 1. DROUHET E. et B. DUPONT : Infections mycosiques et parasitaires au cours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24, DROUHET E. : Antigènes des Candida-Application à l'étude de l'immunité humorale et du diagnostic immunologique. REV. FRANC. ALLERGOL. (1976) 16, n 5, (33 réf.). 3. DROUHET E. ; Systemic Candidosis and its immunology. MYKOSEN (1978) Suppl 1, (16 réf.). 4. FRISK A. : Serological aspects of candidosis. CURRENT THERAP. RESEARCH. (1977) 22, n 1, (12 réf.). 5. HARDING S.A.; SANDFORD G.R.; MERZ W.G.: Three serologic tests for candidiasis. AM.J.CLIN.PATHOL. (1976) 65, n 6, pp (24 réf.). 6. SEGRETAIN G.; DROUHET E.; MARIAT F.: Diagnostic de laboratoire en mycologie médicale. (1979-4e edition). MALOINE Edit. PARIS, 150 pages.

7 - CE jelzés (Európai direktíva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai célú orvosi eszközökről) - Csak in vitro diagnosztikai felhasználásra! - Katalógusszám - Gyártó - Meghatalmazott Képviselet - Gyártási szám - Szavatossági idő - Tárolási hőmérsékleti határok - Lásd a használati utasítást A tesztleírás az Európai Direktíva által előírt egyéb idegen nyelveken a Bio-Rad helyi képviseleteinél megtalálható.