2. KLINIKAI JELENTŐSÉG

Átírás

1 PLATELIA CMV IgG 1 lemez CITOMEGALOVÍRUS ELLENI IgG ANTITESTEK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA HUMÁN SZÉRUMBÓL VAGY PLAZMÁBÓL ENZIM-IMMUNOASSAY TECHNIKÁVAL /11 1. FELHASZNÁLÁS A Platelia CMV IgG egy indirekt ELISA immunoassay Kit a citomegalovírus elleni IgG antitestek mennyiségi meghatározására humán szérumból vagy plazmából. 2. KLINIKAI JELENTŐSÉG A humán citomegalovírusok (CMV) igen elterjedtek az emberi népességben. A CMV a herpeszvírus-család tagja, és közvetlen kontaktussal terjed (vizelet, nyál, anyatej, vér, könnyek, sperma és hüvelyváladék). A fertőződést követően a CMV több évig is lappanghat a fertőzött beteg szervezetében, majd reaktiválódva újra és újra megjelenő fertőzéseket okoz, melyek során fennáll a lehetősége a másokra való továbbterjedésnek is. A gazdaszervezet többféle módon és különböző életszakaszokban fertőződhet meg (congenitalis, post-natalis fertőzések). Egy bizonyos lappangási fázist követően másodlagos fertőzés alakulhat ki exogén vírus okozta reinfekció, vagy a lappangó vírus reaktiválódása útján is. A lakosság 50-85%-a a felnőttkor előtt fertőződik meg, de a fertőzések többsége tünetmentes marad; mindössze a betegek 2%-ánál jelentkeznek atípusos tünetek, például láz, gyengeség, izom- vagy ízületi fájdalom. A CMV-fertőzés azonban súlyos kimenetelű is lehet, ha terhes nőket, újszülötteket vagy legyengült immunrendszerű egyéneket érint. Terhesség alatt a nők 1-3%-a fertőződik CMV-vel, és a betegek 40-50%-ánál figyelhető meg magzati fertőződés a placentán keresztül. A magzati fertőzések 95%-a tünetmentes, de 5% esetén a szövődmények rendkívül súlyosak: hepatosplenomegalia, microcephalia, hydrocephalia, koraszülés, pszichomotoros retardáció és magzatelhalás. A tünetmentes fertőzések 10%-ában az újszülötteknél késleltetve jelennek meg a szövődmények, mint például a részleges vagy teljes süketség vagy vakság. Immunszuppresszált egyéneknél (AIDS-es betegekben, transzplantáción átesett egyéneknél, limphoproliferatív vagy rákos betegségben szenvedőknél) a súlyos szövődmények a disszeminált és/vagy viscerális fertőzéssel vannak összefüggésben: splenomegalia, chorioretinitis, hepatitis, pneumonia, myocarditis, encephalitis. Ilyen betegeknél a fertőzés akár fatális kimenetelű is lehet. A CMV-fertőzés után néhány héttel az immunválasz következtében megjelennek a specifikus IgM antitestek, majd néhány nappal később a specifikus IgG antitestek. A CMV szerológiai diagnózisa szerokonverzióval vagy az IgG titer jelentős növekedésével igazolható. A specifikus anti-cmv IgG antitestek kimutatása alkalmas a primer fertőzés diagnosztizálására, valamint a betegek immunológiai státuszának meghatározására. 3. ALAPELV A Platelia CMV IgG a citomegalovírus elleni IgG antitestek humán szérumból vagy plazmából történő kimutatására és titerének meghatározására alkalmas, indirekt ELISA enzim immunoassay Kit. A mikrolemez inaktivált CMV-antigénnel van bevonva. Konjugátumként a humán -láncra (anti-igg) specifikus, peroxidázzal jelzett poliklonális antitest szolgál. A teszt menete: 1. lépés A betegmintákat és a kalibrátor oldatokat 1:21 arányban kell hígítani, majd bemérni a mikrolemez mélyedéseibe. Az egy órán keresztül tartó, 37 C-os inkubálás alatt a mintában jelen lévő CMV elleni IgG antitestek kötődnek a mikrolemez mélyedéseiben megkötött CMV-antigénhez. Inkubálás után a nem kötött, aspecifikus antitesteket és egyéb szérumfehérjéket mosással el kell távolítani. 2. lépés Ezután a konjugátumot (humán -láncra specifikus, peroxidázzal jelzett poliklonális antitest) kell hozzá adagolni a mintákhoz. Az újboli egyórás, 37 C-os inkubálás alatt a jelzett antitest kötődik a CMV-antigén által rögzített szérum IgGhez. A feleslegben maradó konjugátumot az inkubálás végén mosással kell eltávolítani. 1

2 3. lépés Az immunkomplexek (CMV-antigén, CMV elleni IgG antitestek és anti-igg konjugátum) jelenlétét enzimes előhívó oldat adagolásával mutatjuk ki. 4. lépés Szobahőmérsékleten ( C) történő inkubálás után az enzimreakciót 1 N kénsavoldat hozzáadásával állítjuk le. A spektrofotométerrel, 450/620 nm hullámhosszon mért optikai denzitás arányos a mintában jelen lévő CMV elleni IgG antitestek mennyiségével. 4. TERMÉKINFORMÁCIÓK A készletben található reagensek mennyisége 96 teszt elvégzéséhez elegendő. A reagensek kizárólag in vitro diagnosztikai célokra használhatóak. Címke A reagens leírása Kiszerelés R1 Mikrolemez Mikrolemez (használatra kész) 12 sor, amelyek 8-8 leválasztható mélyedésből állnak, inaktivált CMV-antigénnel bevonva R2 Koncentrált mosóoldat (20x) Koncentrált mosóoldat (20x) TRIS-NaCl puffer (ph 7,4), 2% Tween 20 Tartósítószer: 0,04% ProClin 300 R3 Kalibrátor 0 Kalibrátor 0 A CMV elleni IgG antitestekre, valamint HBs-antigénre, anti- HIV1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R4a Kalibrátor 0,4 Kalibrátor 0,4 AE/ml A CMV elleni IgG antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R4b Kalibrátor 1 Kalibrátor 1 AE/ml A CMV elleni IgG antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R4c Kalibrátor 4 Kalibrátor 4 AE/ml A CMV elleni IgG antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R4d Kalibrátor 10 Kalibrátor 10 AE/ml A CMV elleni IgG antitestekkel reagáló, de HBs-antigénre, anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre negatív humán szérum R6 Konjugátum (51x) Konjugátum (51x) Torma-peroxidázzal jelölt, humán -lánccal szemben termelődött kecske poliklonális antitest Tartósítószer: 0,16% ProClin 300 R7 Hígítószer Minta- és konjugátumhígító (használatra kész) Tris-NaCl (ph 7,7), bovin albumin, glicerin, 0,1% Tween 20, fenolvörös R9 Kromogén TMB Kromogén (használatra kész) 3,3,5,5 -tetrametil-benzidin (< 0,1%), H 2 O 2 (< 1%) R10 Leállító oldat Leállító oldat (használatra kész) 1N kénsavoldat 1 mikrolemez 70 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,75 ml 0,7 ml 80 ml 28 ml 28 ml A tárolási feltételeket és a lejárati időt lásd a dobozon. 2

3 5. FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK Az eredmények megbízhatósága az alábbi helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) irányelveinek megfelelő betartásától függ: Lejárt reagensek használata tilos! A különböző tételekből származó reagenseket nem szabad összekeverni, illetve egymással kombinálni. MEGJEGYZÉS: A mosóoldat (R2, megjelölés: 20x zöld színű), a kromogén (R9, megjelölés: TMB, türkiz) és a leállító oldat (R10, megjelölés: 1N, piros színű) esetében lehetséges más készletekben lévő reagensek felhasználása is, feltéve, hogy ezek a reagensek szigorúan egyenértékűek, és az adott tesztben használt reagensekkel azonos gyártási tételből származnak. MEGJEGYZÉS: Emellett a mosóoldat (R2, megjelölés: 20x zöld színű) megfelelő feloldás után összekeverhető a különböző Bio-Rad reagens készletekben található 2 másik mosóoldattal (R2, megjelölés: 10x, kék színű vagy 10x, narancsszínű), feltéve, hogy egy adott teszt során csak egyféle keveréket használnak fel. A felhasználás előtt várjon 30 percet, hogy a reagensek szobahőmérsékletre ( C) melegedjenek. Gondosan oldja fel vagy hígítsa a reagenseket, elkerülve a szennyeződést. Ne végezze a tesztet reaktív gőzök (sav-, lúg-, aldehidgőzök) vagy por jelenlétében, mivel ezek módosíthatják a konjugátum enzimaktivitását. Használjon alaposan elmosott és ioncserélt vízzel kiöblített üvegeszközöket. Az egyszerhasználatos eszközök használata javasolt! A mikrolemez átmosása az eljárás kritikus lépése: végezze el a javasolt számú mosási ciklust, és ügyeljen arra, hogy a mélyedések teljesen fel legyenek töltve, majd teljesen ki legyenek ürítve. A nem megfelelő mosás pontatlan eredményekhez vezethet. Ne hagyja, hogy a mikrolemez kiszáradjon az egyes mosási ciklusok vége és a reagens bemérése között. Soha ne használja ugyanazt az eszközt a konjugátum és az előhívó oldat beméréséhez. A enzimreakció nagyon érzékeny a fémekre vagy fémionokra. Éppen ezért ne engedje, hogy bármilyen fémes elem érintkezzen a konjugátumot vagy a kromogént tartalmazó különböző oldatokkal. A kromogén oldatnak (R9) színtelennek kell lennie. A kék elszíneződés azt jelzi, hogy a reagens a továbbiakban már nem használható! Minden mintához külön pipettahegyet kell használni. Ellenőrizze a pipetták és egyéb eszközök pontosságát és megfelelő működését! Egészségügyi és biztonsági utasítások A reagensek elkészítéséhez használt humán eredetű anyagokat hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag), hepatitis C vírus elleni (anti-hcv) és HIV elleni antitestekre (anti-hiv1 és anti-hiv2) vizsgálták, és negatívnak találták. Mivel nem létezik olyan módszer, amellyel teljes biztonsággal kizárható a fertőző ágensek jelenléte, a humán eredetű reagenseket és betegmintákat potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. Bármely anyagot, beleértve a mosóoldatot is, amely közvetlen érintkezésbe kerül a mintákkal és a humán eredetű anyagokat tartalmazó reagensekkel, potenciális fertőzési forrásként kell kezelni. A mintákkal és reagensekkel való munka során viseljen egyszerhasználatos védőkesztyűt. Szájjal pipettázni tilos! Ügyeljen arra, hogy a minták, illetve a mintákat tartalmazó oldatok ne follyanak ki. A kiömlött anyagokat 10%-os nátrium-hipoklorit oldattal kell lemosni. Ha sav ömlik ki, akkor azt először nátrium-bikarbonáttal semlegesíteni kell, majd 10%-os nátrium-hipoklorit oldattal kell lemosni, és a területet száraz papírtörlővel feltörölni. A tisztításhoz használt anyagokat a szennyezett maradékok tárolására szolgáló edénybe kell beledobni. A betegmintákat, humán eredetű anyagokat tartalmazó reagenseket, valamint a szennyezett anyagokat és termékeket kizárólag fertőtlenítés után lehet hulladékba helyezni: - áztatás 5%-os végkoncentrációjú nátrium-hipoklorit oldatban 30 percig, - vagy autoklávozás 121 C-on minimum 2 órán át. VIGYÁZAT! Ne tegyen nátrium-hipokloritot tartalmazó oldatokat az autoklávba! Ügyeljen arra, hogy a reagensek még a veszélytelennek tekinthető reagensek se kerüljenek a bőrre vagy nyálkahártyára. A kémiai és biológiai maradványokat a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) előírásainak megfelelően kell kezelni és megsemmisíteni. A készletben lévő valamennyi reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célra használható. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: 3

4 6. MINTÁK 1. Javasolt mintatípusok: szérum és plazma (EDTA, heparin vagy citrát). 2. A vérminták kezelése, feldolgozása és tárolása során tartsa be az alábbi ajánlásokat: Mindig a vénaszúrással kapcsolatos rutin óvintézkedések betartásával vegye le a vérmintákat. Szérum esetén centrifugálás előtt hagyja, hogy a minták teljesen megalvadjanak. A csöveket mindig tartsa lezárva. Centrifugálás után öntse le a szérumot vagy plazmát az alvadékról vagy a vörösvérsejtekről egy tárolócsőbe, amelyet azután szorosan lezár. A minták +2-8 C-on tárolhatók, ha a vizsgálat 7 napon belül megtörténik. Amennyiben a vizsgálatot nem végzik el 7 napon belül, illetve amennyiben a mintákat szállításra kerülnek, fagyassza le azokat 20 C-ra vagy annál alacsonyabb hőmérsékletre. Ne használjon olyan mintákat, amelyeket több mint öt alkalommal felolvasztottak. A lefagyasztott, majd felolvasztott mintákat a vizsgálat előtt alaposan össze kell keverni (Vortex). 3. A 90 g/l albumint vagy 100 mg/l konjugálatlan bilirubint, illetve 36 g/l triolein (triglicerid) ekvivalens lipémiás, vagy max. 10 g/l hemoglobintartalmú hemolizált minták az eredményeket nem befolyásolják. 4. A mintákat nem szabad melegíteni. 7. A VIZSGÁLAT MENETE 7.1 A méréshez szükséges, de a készletben nem szereplő anyagok Vortex keverő. 450 nm-es és 620 nm-es szűrőkkel felszerelt mikrolemez-leolvasó (*). Stabilan 37±1 C-ra beállított mikrolemez-inkubátor (*). Automata, félautomata vagy kézi mikrolemezmosó (*). Steril desztillált vagy ioncserélt víz. Egyszerhasználatos védőkesztyű. Védőszemüveg. Papírtörlő. Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták vagy többcsatornás pipetták a µl, 1 ml, 2 ml és 10 ml kiméréséhez. 25 ml-es, 50 ml-es, 100 ml-es és 1000 ml-es mérőhengerek. Nátrium-hipoklorit (fertőtlenítő) és nátrium-bikarbonát. Biológiai hulladéktároló. Eldobható kémcsövek. (*) A javasolt felszerelésekkel kapcsolatos részletese információkért forduljon technikai osztályunkhoz. 7.2 A reagensek feloldása R1: A csomagolás felbontása előtt hagyja állni 30 percig szobahőmérsékleten ( C). Vegye ki a tartótálcát, a nem szükséges sorokat rögtön tegye vissza a csomagolásba, és ellenőrizze, hogy benne van-e a nedvességmegkötő anyag. Gondosan zárja vissza a csomagolást, és tegye +2-8 C-os helyre. R2: Az R2 mosóoldatot hígítsa desztillált vízzel 1:20 arányban. Például: 50 ml R2 oldat és 950 ml desztillált víz a használatra kész mosóoldat elkészítéséhez. Manuális mosáshoz készítsen 350 ml hígított mosóoldatot egy 12 sorból álló lemezhez. R3, R4a, R4b, R4c, R4d: Hígítsa 1:21 arányban hígítószerrel (R7) (például: 300 µl R µl kalibrátor oldat). R6 + R7: A konjugátum (R6) 51-szeres töménységű, és használat előtt homogenizálni kell. Hígítsa 1:51 arányban hígítószerrel (R7). Egy lemezhez hígítson 0,5 ml konjugátumot (R6) 25 ml hígítószerrel (R7). Az egy sorhoz szükséges mennyiség kiszámításához ossza el a fenti térfogatokat tízzel. 7.3 A felbontott és/vagy feloldott reagensek tárolása és eltarthatósága A készletet +2-8 C-on kell tárolni. Ha a készletet +2-8 C-on tartják felbontás előtt, akkor minden alkotórész a készlet külső címkéjén feltüntetett lejárati ideig használható. R1: Felbontás után a sor max. 8 hétig használható, ha +2-8 C-on tárolják az eredeti, gondosan visszazárt csomagolásban (ellenőrizze a nedvességmegkötő anyag meglétét). R2: Hígítás után a mosóoldat C-on 2 hétig tárolható. Felbontást követően a tömény mosoóldat C-on, a szennyeződés kizárásával tárolt körülmények között a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg a minőségét. R3, R4a, R4b, R4c, R4d, R6, R7: A reagensek felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva max. 8 hétig őrzik meg minőségüket. R6 + R7: Hígítás után a konjugátum-munkaoldat szobahőmérsékleten ( C) 8 órán át, 2-8 C-on pedig 24 órán át stabil. R9: A reagens felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva max. 8 hétig őrzi meg minőségét. R10: A reagens felbontás után, +2-8 C-on tárolva, a szennyeződésektől megóvva a címkén jelzett lejárati ideig őrzi meg minőségét. 4

5 7.4 Eljárás Szigorúan kövesse a mérési eljárást és a helyes laboratóriumi gyakorlat (GLP) előírásait. A felhasználás előtt hagyja, hogy a reagensek szobahőmérsékletre ( C) melegedjenek. A letörhető mélyedések használata különleges odafigyelést igényel. Használjon kalibrátor oldatokat minden egyes méréshez, a mérési eredmények validálásához. 1. Gondosan tervezze meg a kalibrátor oldatok és a betegminták elhelyezését és beazonosítását a lemezen. 2. Készítse el a hígított mosóoldatot (R2) (lásd a 7.2. részt). 3. Vegye ki a tartótálcát és a sorokat (R1) a védőcsomagolásból (lásd a 7.2. részt). 4. Hígítsa 1:21 arányban az R3, R4a, R4b, R4c és R4d kalibrátor oldatokat és az S1, S2 stb. betegmintákat a hígítószerrel (R7) a megfelelő azonosítóval ellátott csövekben: 300 µl hígítószer (R7) és 15 µl minta (lásd a 7.2. részt). Homogenizálja a mintákat Vortex keverővel. 5. Szigorúan betartva az alábbi sorrendet, mérjen be µl-t a kalibrátor oldatokból és a betegmintákból az egyes mélyedésekbe: A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Fedje le a mikrolemezt tapadófóliával, erősen rányomkodva azt a lemezre, ezzel biztosítva a megfelelő zárást. Azonnal kezdje meg a mikrolemez inkubálását 37 C 1 C-os termosztáttal szabályozott vízfürdőben vagy száraz inkubátorban, és inkubálja 1 órán át ( 5 perc). 7. Az első inkubálás vége előtt készítse el a konjugátum-munkaoldatot (R6 + R7) (lásd a 7.2. részt). 8. Az első inkubációs idő letelte után vegye le a tapadófóliát a lemezről. Szívja fel a mélyedések tartalmát, és helyezze (nátrium-hipokloritot tartalmazó) biológiai hulladéktartályba. Mossa le a mikrolemezt 4 alkalommal 350 µl mosóoldattal (R2). Fordítsa le a lemezt, és óvatosan ütögesse rá a papírtörlőre, ezzel eltávolítva a maradék folyadékot. 9. Rögtön mérjen bele minden mélyedésbe µl konjugátum-munkaoldatot (R6 + R7). Az oldatot használat előtt össze kell rázni. 10. Fedje le a mikrolemezt tapadófóliával erősen rányomkodva azt a lemezre, ezzel biztosítva a megfelelő zárást. Azonnal kezdje meg a mikrolemez inkubálását 37 C 1 C-os, termosztáttal szabályozott vízfürdőben vagy száraz inkubátorban, és inkubálja 1 órán át ( 5 perc). 11. A második inkubációs idő letelte után vegye le a tapadófóliát a lemezről. Szívja fel a mélyedések tartalmát, és helyezze (nátrium-hipokloritot tartalmazó) biológiai hulladéktartályba. Mossa le a mikrolemezt 4 alkalommal 350 µl mosóoldattal (R2). Fordítsa le a lemezt, és óvatosan ütögesse rá a papírtörlőre, ezzel eltávolítva a maradék folyadékot. 12. Gyorsan mérjen bele minden mélyedésbe µl kromogén oldatot (R9) fénytől védett körülmények között. Hagyja végbemenni a reakciót sötétben, szobahőmérsékleten ( C) 30 ± 5 percig. Ezen inkubálás alatt ne fedje le a lemezt a tapadófóliával. 13. Mérjen be µl leállító oldatot (R10) minden mélyedésbe, leállítva az enzimreakciót. Ezt ugyanolyan sorrendben és sebességgel végezze, mint az előhívó oldat esetében tette. 14. Gondosan törölje le a lemez alját. A reakció leállításától számított 30 percen belül egy lemezleolvasó segítségével mérje meg az optikai denzitást 450/620 nm-en. A sorokat leolvasás előtt folyamatosan fénytől védve kell tárolni. 15. Az eredmények továbbítása előtt ellenőrizze a mért értékeket, a lemez kiosztási tervét és a mintákat. 8 AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE 8.1 A standard görbe felvétele Az anti-cmv IgG antitestek méréséhez nem létezik nemzetközi standard készítmény. A Platelia CMV IgG próba a WHO által ajánlott nemzetközi standard készítmény (1995) felhasználásával lett standardizálva. A CMV elleni IgG antitestek jelenlétét és koncentrációját a mintában úgy határozzuk meg, hogy összevetjük a minta optikai denzitását (OD) a standard görbe kalibrátor oldatainak arbitrális egység/milliliterben (AE/ml) kifejezett koncentrációjával. A standard görbét (OD = függvény [AE/ml]) úgy kapjuk meg, hogy a függőleges tengelyen (Y) az R3, R4a, R4b, R4c és R4d kalibrátor oldatok optikai denzitását, a vízszintes tengelyen (X) pedig az egyes kalibrátor oldatok AE/ml-ben kifejezett koncentrációját ábrázoljuk. Minden vizsgált mintánál úgy határozhatjuk meg az anti-cmv IgG antitest titert, hogy a standard görbéről leolvassuk a minta mért optikai denzitásának megfelelő koncentrációt. 5

6 8.2 Minőségellenőrzés Minden egyes mérésnél, mikrolemezenként, használja az összes kalibrátor oldatot, és elemezze a kapott eredményeket. A mérés akkor megfelelő, ha kielégíti az alábbi kritériumokat: Optikai denzitás-értékek: OD R4a 0,150 OD R4b 0,300 OD R4d > OD R4c Optikai denzitás-arányok: OD R4a / OD R3 3,50 OD R4b / OD R4a 1,50 OD R4c / OD R4b 1,50 Amennyiben a mérés nem felel meg a felsorolt minőségellenőrzési feltételeknek, meg kell ismételni. 8.3 Az eredmények értelmezése Anti-CMV antitest titer (arbitrális egység/ml) Eredmény Értelmezés Titer < 0,25 AE/ml Negatív 0,25 AE/ml titer < 0,5 AE/ml Kétes Titer 0,5 AE/ml Pozitív A negatív vagy kétes eredmény a szerzett immunitás hiányát jelzi, de nem zárja ki a nemrégiben kialakult fertőzést. Ha feltételezhető, hogy a betegnél nemrégiben alakult ki fertőzés, akkor két héttel később új mintával ismét el kell végezni a vizsgálatot. A pozitív eredmény rendszerint régebbi fertőzést jelez. Azonban nem zárható ki a közelmúltban kialakult fertőzés, különösen ha anti-cmv IgM antitestek vannak jelen. Nemrégiben kialakult fertőzés gyanúja esetén egyéb szerológiai vizsgálatok, például az IgG antitest aviditásának mérése segítségével megerősíthető a diagnózis. Nagyobb titer ingadozás figyelhető meg 4 AE/ml koncentráció felett. Azokat a mintákat, amelyek koncentrációja nagyobb a legtöményebb kalibrátor oldat koncentrációjánál, hígítani lehet az R7 hígítószerrel annak érdekében, hogy a standard görbén a kapott eredmény belekerüljön a vizsgálat lineáris tartományába. Ilyen esetben a végleges koncentrációt úgy kapjuk meg, hogy a mért értéket megszorozzuk a hígítási aránnyal. 8.4 Hibaelhárítási útmutató Az érvénytelen vagy nem reprodukálható reakciókat gyakran az alábbi tényezők okozzák: A mikrolemez nem megfelelő mosása. A negatív minták szennyeződése magas antitest titerű szérummal vagy plazmával. Az előhívó oldat szennyeződése kémiai oxidálószerekkel (pl. fertőtlenítővel, fémionokkal stb.). A leállító oldat szennyeződése. 9 TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK A Platelia CMV IgG Enzim Immunoassay KIT teljesítményjellemzőit 2 egymástól független helyszínen határoztuk meg, összesen 1096 terhes nőtől és véradótól levett minta alapján. 9.1 Prevalencia Az anti-cmv IgG antitestek Platelia CMV IgG teszttel mért prevalenciáját 300, Párizsban és környékén (Franciaország) élő terhes nőtől levett mintán határoztuk meg. 145 minta volt pozitív az anti-cmv IgG antitestre. A Platelia CMV IgG próbával mért prevalencia 48,3%-os volt (145/300). 9.2 Specificitás A relatív specificitást 490 db mintából elvégzett mérés alapján állapítottuk meg, melyeket két egymástól független helyszínről gyűjtöttünk össze. A minták az alábbiak szerint oszlottak meg: 61, véradóktól származó szérum 429, terhes nőktől származó szérum 6

7 Az eredményeket a referenciaként használt, kereskedelmi forgalomban lévő EIA próbával kapott eredményekkel vetettük össze. Vizsgált populáció /vizsgálóhely 1. vizsgálóhely 2. vizsgálóhely Szérumok száma Negatív Kétes Pozitív Specificitás Terhes nők Véradók Terhes nők Összesen [IC 95%] = 95%-os konfidencia-intervallum. 100,0% (81/81) [96,3 100,0%] 100,0% (61/61) [95,2 100,0%] 100,0% (348/348) [99,1 100,0%] 100,0% (490/490) [99,4 100,0%] 9.3 Érzékenység A relatív érzékenységet 606 db db mintából elvégzett mérés alapján állapítottuk meg, melyeket két egymástól független helyszínről gyűjtöttünk össze. A minták az alábbiak szerint oszlottak meg: 136 véradóktól származó szérum 470 terhes nőktől származó szérum Az eredményeket a referenciaként használt, kereskedelmi forgalomban lévő EIA próbával kapott eredményekkel vetettük össze. Vizsgált populáció /vizsgálóhely 1. vizsgálóhely 2. vizsgálóhely Szérumok száma Negatív Kétes* Pozitív Érzékenység Terhes nők Véradók Terhes nők Összesen * Az érzékenység számításánál a kétes eredményeket negatívnak tekintettük. [IC 95%] = 95%-os konfidencia-intervallum. 98,4% (121/123) [94,2 99,8%] 97,1% (132/136) [92,6 99,2%] 98,8% (343/347) [97,1 99,7%] 98,4% (596/606) [97,0 99,2%] 9.4 Keresztreakciók 103 mintából (77 olyan mintából, amely pozitív volt toxoplazmózisra, rubeolára, EBV-re, HSV-re, VZV-re, mumpszra, bárányhimlőre és HIV-re, valamint 26 olyan mintából, amely pozitív volt reumatoid faktorra, auto-antitestre és heterofil antitestre) álló panellel végeztünk anti-cmv IgG antitestszűrést Platelia CMV IgG próbával és kereskedelmi forgalomban kapható EIA próbával. A minták közül 37 volt negatív, és az eredmény megfelelt az összehasonlításra használt EIA-készlet eredményeinek, amely igazolja a lehetséges keresztreakciók hiányát. 9.5 Pontosság Mérésen belüli pontosság (ismételhetőség): A mérésen belüli ismételhetőség meghatározásához egy negatív és három pozitív mintát teszteltünk 30 alkalommal egyazon mérésen belül. Minden egyes pozitív mintához meghatároztuk a koncentrációt (AE/ml). A negatív minta eredményeit arányszámmal fejeztük ki. A négy mintához tartozó átlagos koncentrációkat és arányt, szórást (SD) és variációs koefficienst (%CV) az alábbi táblázatban foglaltuk össze: 7

8 Mérésen belüli pontosság (ismételhetőség) N = 30 Negatív minta Gyengén pozitív minta Pozitív minta Erősen pozitív minta Arány (OD minta / OD R4a) Koncentráció (AE/ml) Átlag 0,11 1,87 3,53 4,78 SD 0,01 0,10 0,18 0,30 %CV 6,6% 5,1% 5,1% 6,3% Mérések közötti pontosság (reprodukálhatóság): A mérések közötti reprodukálhatóság meghatározásához négy mintát (egy negatív és három pozitív) teszteltünk két-két párhuzamos vizsgálattal, naponta 2-2 mérést elvégezve 20 napon át. Minden egyes pozitív mintához meghatároztuk a koncentrációt (AE/ml). A negatív minta eredményeit arányszámmal fejeztük ki. A négy mintához tartozó átlagos koncentrációkat és arányt, szórást (SD) és variációs koefficienst (%CV) az alábbi táblázatban foglaltuk össze: Mérések közötti pontosság (reprodukálhatóság) N=80 Negatív minta Gyengén pozitív minta Pozitív minta Erősen pozitív minta Arány (OD minta / OD R4a) Koncentráció (AE/ml) Átlag 0,10 1,44 3,10 4,22 SD 0,02 0,19 0,40 0,76 %CV 16,0% 13,4% 13,0% 18,0% 9.6 Linearitás A Platelia CMV IgG próba lineáris tartománya 0 és 4 AE/ml közé esik 5 pozitív mintával elvégzett hígítási vizsgálat alapján. 10 AZ ELJÁRÁS KORLÁTAI A CMV-fertőzés kizárólag a klinikai és a biológiai adatok együttes mérlegelése alapján diagnosztizálható. Egyetlen anti- CMV IgG antitest titer-mérés eredménye nem támasztja alá a citomegalovírus-fertőzés diagnózisát. 11 GYÁRTÓI MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az előállított reagensek minőségügyi rendszerünk előírásainak megfelelően készültek a nyersanyagok beszerzésétől kezdve a késztermék forgalomba kerüléséig. Minden egyes tétel minőségellenőrző vizsgálatokon esett át, és kizárólag a meghatározott jóváhagyási feltételeknek való megfelelés után kerül piacra. Az egyes tételek előállítása és ellenőrzése során készült jegyzőkönyveket a Bio-Rad őrzi. 12 IRODALOM 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S Demmler G.J Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36:

9 7. Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: Revello M.L., Gerna G Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306:

10 10

11 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)