Western blot technika

Átírás

1 Western blot technika

2 Immunoblot vagy Western blot - fehérjék vizsgálatára fejlesztették ki - módszer során az elektroforetikusan szétválasztott komponenseket szilárd hordozóra viszik - érzékenység vetekszik a radioimmunoassay-vel és nem igényli a vizsgál fehérje radioaktív jelölését

3 fehérjék membránra történő átvitele immunológiai azonosítása Előny: Fehérje membránra történő átvitelekor részben visszanyeri natív állapotát alkalmas fehérje ligand vagy fehérje-fehérje kölcsönhatás kimutatására Fehérjék a membránon koncentrálódnak, kimutatási lehetőségüket növeli Fehérjék a membránon gyorsan és reverzibilien festhetők Hátrány: A fehérjék méretüktől és bázicitásuktól függően eltérő hatékonysággal vihetők át membránra az antitestet a fehérje natív alakja ellen termeltették viszont a denaturált és redukált körülmények között az antitest nem mindig képes megkötődni a vizsgálandó fehérje (antigén) megfelelő epitópjához

4 Gél elektroforézis - Az első lépés a gél elektroforézis. - A minta fehérjéit a gélen moláris tömegük alapján választják el, általában SDS-PAGE-et, azaz nátrium-dodeciszulfát-poliakrilamid-gél-elektroforézist használnak. - Az elektroforézis denaturáló körülmények között zajlik, így kiküszöbölődik az összecsapzódás jelensége, a nem megfelelő oldékonyság - A gélen több sáv van, így a minták párhuzamosan vizsgálhatók. - 2-D-s elektroforézist is kifejlesztettek, melyen a minták komponensei két irányban is képesek elválni egymástól, ezzel nagyobb felbontóképességet eredményezve, melyben az egyik irányban az izoelektromos pont alapján, a másik irányban pedig a moláris tömeg alapján szeparálódnak.

5 Jó tudni... - Az akrilamid vizes oldatban, megfelelő katalizátor (ammónium peroxidilszulfát, APS) és iniciátor (tetrametilén etilendiamin, TEMED) jelenlétében polimerizációra képes poliakrilamid keletkezik. - Az APS spontán bomlása szabad gyök keletkezéséhez vezet, de e szabad gyök nem képes az akrilamid kettős kötését felhasítva elindítani a polimerizációt, arra viszont képes, hogy gerjessze a TEMED molekulát és az így keletkező szabadgyök már képes beindítani a polimerizációt. APS - mindig frissen!!!! TEMED - jellegzetes szagú!!!

6 Transzfer - Elektroforézis gél vékony és törékeny, ezért nehéz lenne véghezvinni a fehérjék kimutatásához szükséges minden lépést rajta. - A fehérjéket elektroferetikusan nitrcellulóz membránra vagy PVDF-re visszük át - Ez maga a blottolás folyamata, amikor a fehérjék a szondákat tartalmazó membránra kerülnek át. - A membránnak fehérje kötő részei vannak, melyek nem specifikusak, minden fehérjét azonos valószínűséggel kötnek. - A kötés pedig hidrofób kölcsönhatás alapján megy végbe, illetve elektromos hatások is fellépnek a membrán és a fehérje között.

7 A gélen a lyukak világos körök, a lyukak közti területek sötétek? A membránon fordítva a lyukak közti területek a világosak, hiszen ott kevésbé volt hatásos a transzfer.

8 BLOKKOLÁS - a nitrocellulóz membránon a szabad helyek telítése a vizsgálat szempontjából közömbös fehérjével, mivel a membránon levő szabad kötőhely a specifikus antitestet megkötné - BSA; kazein, nem zsíros, száraz tejpor és detergensek (pl. Tween 20, vagy a kolloidális szén) oldata - a blokkoló ágens kötődjön jól a membránhoz, ne zavarja az antitest-antigén kölcsönhatást - a detektálási reakciókat és kellő mértékben oldódjon TRIS vagy foszfát alapú pufferekben.

9 Jelölés Az első antitest ellen termelt második antitest jelölést hordoz (pl. radioizotóp, enzim (tormagyökérperoxidáz, alkalikus foszfatáz).

10 Detektálás 1. Radioaktív izotóp esetén: röntgenfilm előhívás érzékenység (pikogramm) 2. Enzimes (gyökértormaperoxidáz, alkalikus foszfatáz) jelölés esetén: Kromogén szubsztráttal amelyet az enzim színes csapadékká alakít érzékenység: (nanogramm) Kemilumineszcenciával (ECL; Enhanced-ChemiLuminescence) luminol peroxidáz katalizálta oxidációja közben fényt bocsát ki, amelyet fényérzékeny lemezen rögzítjük érzékenység: pikogramm

11 Problémák...I. Gyenge jel: Nincs jel:

12 Problémák...I. Gyenge jel: Blokkolás a puffer reagál a fehérjével másikat kell próbálni, vagy időt csökkenteni Inkubálási idő növelni Antitest koncentráció fertőzés, fagyasztás ciklusok száma növelni vagy újat Transzfer optimalizálás Csapvíz!! kromogén reagens inaktív minőségi víz Azid gátolja a HRP-t kerüljük Antigén koncentráció alacsony emelni kell a gélre felvitt mennyiséget Nincs jel: Túl alacsony antitest koncentráció növelni kell HRP gátlás azid kerülése!!! Antitest csak natív fehérjével reagál nem-denaturáló gélen kell futtatni vagy másik antitest kell :(

13 Problémák...II. Nem egyenletes blot Foltos háttér Erős háttér

14 Problémák...II. Nem egyenletes blot Ujjlenyomatok, foltok hajtogatás, szabad kézzel érintés kerülése! Foltos háttér A blokkoló pufferben vagy a másodlagos antitest pufferben nem oldódott fel valamelyik összetevő szűrés

15 Problémák...II. Erős háttér Mosás mosási idő és mennyiség növelése, transzfer előtti szűrés Másodlagos antitest koncentrációja magas hígítás Fehérje-fehérje aspecifikus kapcsolatok detergens (Twwen 20) a mosó és detekciós pufferbe Immobilon membránon NaCl és SDS koncentrációjának növelése, mosási idő elnyújtása Rossz minőségű reagens reagensek és víz minőségének átnézése Keresztkapcsolatok a blokkoló puffer reagensei és az antitest között detergens a mosó oldatba és másik blokkoló puffer Expozíciós idő túl hosszú csökkenteni A membrán kiszáradt figyelni kell a mennyiségekre, ne itt spóroljunk! Rossz minőségű antitest Feleslegesen sok detekciós reagens csöpögtessük le mielőtt előhívnánk!

16 Problémák...III. Egybefüggő háttér Nem specifikus jelek inverz kép Kis fehérjék jelölése

17 Problémák...III. Egybefüggő háttér Nem specifikus kötődés megemelt sótartalmú mosó puzfferek! Nem specifikus jelek Túl magas primer antitest koncentráció hígítani kell Túl magas másodlagos antitest koncentráció hígítás Antigén koncentráció magas kevesebbet kell felvinni inverz kép Túl sok HRP-konjugált másodlagos antitest csökkenteni kell Kis fehérjék jelölése A BSA-val el lettek fedve kazein vagy más alacsony molekulatömegű fehérje használata A Tween 20 vagy Triton-x mennyiségét minimalizálni kell A túlzott inkubációs idők és mosások kerülése

18 ELISA Elisa immunreakción alapuló mérési eljárás, ahol az immunkomplex antitest tagja enzimatikusan jelölt. Az immunkomplex egyik tagját szilárd fázishoz rögzítjük (ez lehet az antigén és az antitest is), amelyhez adjuk az immunkomplex másik jelzett tagját Az immunkomplex mennyiségét konjugált enzimének reakciója segítségével határozzuk meg. A jelzéshez olyan enzimek alkalmasak, amelyeknek stabil szerkezetű, könnyen hozzáférhetõ szubsztrátjuk van és amelyet az enzim színes jól oldódó termékké alakít. Az enzim-szubsztrát reakció mértékét, azaz az átalakult szubsztrát mennyiségét általában fotometriásan mérjük. Az ELISA érzékenysége megközelíti a RIA érzékenységét (ng)

19 ELISA ELISA méréseket műanyag mikrotiter lemezen végezzük. Az antitest vagy az antigén rögzítése a szilárd fázishoz (mikrotiter lemez felszínéhez) történhet : felületi adszorpcióval (gyenge másodlagos, van der Waals kölcsönhatás-sal) ; ELISA reagens immobilizálása mikrotiter lemez felszínéhez a lemez felszínére már eleve kikötött molekulához nagy affinitású kötődéssel és közvetlen kovalens kötés kialakításával A szilárd fázishoz történõ kötés alapkövetelménye, hogy a reagensek a kötés után is megtartsák eredeti aktivitásukat. A reaktáns megkötése után a nem specifikus helyeket blokkolni kell közömbös molekulával (BSA, kazein)

20 ELISA fajtái Elisa osztályozása számos szempont szerint történhet, a módszer tartozhat kompetitív vagy nem kompetitív immunelemzések sorába. A jelölt reaktáns közvetlenül (direkt) vagy közvetten (indirekt) kapcsolódhat a meghatározandó antigénhez vagy antitesthez. Direkt Elisánál a jelzett antitest esetén a kötődés arányos a szilárd fázishoz kötött antigén mennyiségével egy bizonyos koncentráció tartományban Indirekt Elisánál az antigén-antitest komplexet az első ellenanyag elleni másodlagos ellenanyaggal mutatjuk ki.

21 Direkt Elisa 1. A meghatározandó antigént miktotiter lemezre kötjük nem specifikus kölcsönhatással 3. Inkubálás az enzimmel jelölt antitesttel 2. A lemezről lemossuk a nem kötődött antigént (általában fiziológiás sóoldattal, amelyhez detergenst is adagolnak pl. 0,2 % Triton X-100) 4. A lemezről lemossuk a nem kötődött jelölt antitestet 5. A szubsztrát-enzim reakció, a termék fotometriás detektálása

22 Nem kompetitív Nem kompetitív, szendvics ELISA kihasználja, hogy egy antigén molekula felületén többféle epitóp is található; amelyek felhasználhatók a molekula azonosítására és megkötésre. A módszer lényege, hogy a már megkötött makromolekulához olyan enzimmel jelölt antitestet adunk feleslegben, amely csak kizárólag az antitest-antigén komplexen, kialakítva a Antitest1-Antigén-Antitest2-Enzim hármas immunkomplexet. A nem kötődő Antitest2-Enzim lemosása és az enzim/szubsztrát reakció lezajlása után a detektált jel nagysága arányos a megkötött mérendő reaktáns koncentrációjával.

23 Előnyei: nagy érzékenység nagy számú minta, gyors vizsgálata automatizálás Természetes közegben, több antitest vagy antigén jelenlétében a kérdéses komponens mennyiségének meghatározása Hátránya aspecifikus reakciók okozta álpozitivitás (pozitív és negatív kontrollok tesztelése) Bizonytalan antigén vagy antitest tisztaság

24 /da0adc63990db fe00515ade/$file/pb1033en00_emd.pdf