Növényélettani Gyakorlatok A légzés vizsgálata

Átírás

1 Növényélettani Gyakorlatok A légzés vizsgálata /Bevezető/

2 Fotoszintézis Fény-szakasz: O 2, NADPH, ATP Sötétszakasz: Cellulóz keményítő C 5 2 C 3 (-COOH) 2 C 3 (-CHO) CO 2 Nukleotid/nukleinsav anyagcsere NADPH C 5 Pentóz-P út Aminosav/fehérje anyagcsere Tejsavas erjedés Etanolos erjedés 2 CO 2 2 NADH Anaerob anyagcsere Szaharóz P i C3 +C3 Glikolízis 2 piruvát ATP 2 ATP 2 NADH A redukált koenzimek oxidációja 2 CO 2 2 AcKoA 2 NADH Zsírsav szintézis /bontás Citrát-ciklus Mitokondriális Extramitokondriális C 4 Citokróm típusú végoxidáz: Cit-aa3 komplex Cianid-rezisztens, vagy alternatív végoxidáz Direkt végoxidázok -Glikolsavoxidáz -Polifenol-oxidáz -Aszkorbinsav-oxidáz 2 ATP 6 NADH 2 FADH 2 2-oxoglutársav 4 CO 2 Aminosav/fehérje anyagcsere 28 ATP O 2

3 Légzésintenzitás mérése O 2 -elektróddal (27. gyakorlat) 1. O 2 -elektród kalibrálása 2. Búzagyökerek inkubálása 15 percig 50 ml-ben: -CaSO 4 oldat - légzésgátlók (fluoroecetsav, monojódecetsav, Na-azid) -e - -transzportlánc-szétkapcsoló (2,4-dinitrofenol:DNP) 3. Mérőküvettába helyezés: 1/2-1 percenként leolvassuk az O 2 -tartalom változását 4. Légzésintenzitás ábrázolása: mg (O 2 ) / g (friss tömeg) óra [ mg / g h ]

4 Légzésintenzitás mérése Winkler-módszerrel (28. gyakorlat) Winkler-módszerrel az oldat O 2 -tartalma határozható meg: az eredeti és az inkubált oldat O 2 -tartalmának különbsége. 1. Búzagyökerek inkubálása (1-3 g) 1 óráig Winkler-csövekben: -CaSO 4 oldat - légzésgátlók (fluoroecetsav, monojódecetsav, Na-azid) -e - -transzportlánc-szétkapcsoló (2,4-dinitrofenol:DNP) - különböző hőmérsékleten Csövek buborékmentes lezárása! 2. Ismert térfogatú folyadéküveg megtöltése az oldattal. 3. Jodometriás reakciók elvégzése. Elveszett térfogatokkal korrigálni! 4. Titrálás: Na 2 S 2 O 3 -tal keményítő-indikátor mellett. 5. Légzésintenzitás megadása: μg (O 2 ) / g (friss tömeg)*óra [ μg / g h ] -O 2 diffúzió - Levegőbuborék -Gyökerek eredete, felülete -..?

5 Légzésgátlók Monojódecetsav: citoplazma -- glikolízis SH-csoport tartalmú enzimei (pl. glicerinaldehid-3p-dehidrogenáz) Fluoroecetsav: mitokondrium -- citrát-ciklus akonitáz enzime (citrát-izocitrát átmenet, fluorocitráttá alakulás) Na-azid, CO és cianid: mitokondrium terminális oxidáció citokróm típusú végoxidáza (Cit aa 3 ) - Gátlás erősségének sorrendje? - Mekkora a légzési szubsztrátok bejutásának lehetősége a légzési láncba a gátlás utáni szakaszon?

6 Fotoszintézis Fény-szakasz: O 2, NADPH, ATP Sötétszakasz: Cellulóz keményítő C 5 2 C 3 (-COOH) 2 C 3 (-CHO) CO 2 Nukleotid/nukleinsav anyagcsere NADPH C 5 Pentóz-P út Aminosav/fehérje anyagcsere Tejsavas erjedés Etanolos erjedés 2 CO 2 2 NADH Anaerob anyagcsere Szaharóz P i C3 +C3 Glikolízis 2 piruvát ATP 2 ATP 2 NADH A redukált koenzimek oxidációja 2 CO 2 2 AcKoA 2 NADH Zsírsav Szintézis /bontás Citrát-ciklus Mitokondriális Extramitokondriális C 4 Citokróm típusú végoxidáz: Cit-aa3 komplex Cianid-rezisztens vagy alternatív végoxidáz Direkt végoxidázok -Glikolsavoxidáz -Polifenol-oxidáz -Aszkorbinsav-oxidáz 2 ATP 6 NADH 2 FADH 2 2-oxoglutársav 4 CO 2 Aminosav/fehérje anyagcsere 28 ATP O 2

7 Szétkapcsoló 2,4-dinitrofenol (DNP): mitokondrium -- a terminális oxidáció e - -transzportláncát és az oxidatív foszforilációt kapcsolja szét (a membrán proton-áteresztő képessége megnő) - DNP nagy koncentrációban már gátolhat (membrándezintegráció). - Hogyan változik az elektrontranszportra kifejtett akceptorkontroll?

8 Glikolsavoxidáz aktivitás mérése (29. gyakorlat) Calvin - ciklus Fotorespiráció (Glikolát- ciklus) ribulóz-1,5-p 2 glikolsav CH 2 -OH CO 2 O 2 O 2 H 2 O 2 COOH Glikolsav-oxidáz glicerinsav-3-p 2 glioxálsav COH COOH

9 A glikolsavoxidáz: - Flavin (FMN) koenzim -H 2 O 2 képzés - Peroxiszóma, glioxiszóma - Szintézise fényindukált (fitokróm indukció) - Öregedéskor, fertőzéskor csökkenő aktivitás - Glioxálsav glikolsav (glioxálsav-reduktáz, NADH vagy NADPH) Glikolsav NADP NAD Glioxálsav reduktáz O 2 Glikolsav oxidáz NADPH NADH H 2 O 2 Glioxálsav

10 Gyakorlat: 1. Enzimkivonás foszfát pufferben. 2. Reakcióelegyek (kezelések) összemérése. 3. Reakció leállítása perc múlva triklórecetsavval. 4. Színreakció elvégzése: a glioxálsav mennyisége arányos a színes termék mennyiségével. 5. Glioxálsav mennyisége: standard kalibrációs görbe alapján, enzimaktivitás: nmol glioxálsav / g (friss tömeg)* 10 perc. Kezelések: - Fényen / sötétben nevelt (etiolált) levelek - Hozzáadott FMN-t tartalmazó / nem tartalmazó reakcióelegy Hol várható az aktivitás emelkedése?

11 Direkt végoxidázok indukált szintézisének vizsgálata öregített raktározó szövetben (30. gyakorlat) Károsodást követő sebzési légzés oka: egyes direkt végoxidázok indukált szintézise és aktivitásának emelkedése. Gyakorlat: polifenol-oxidáz vizsgálata. 1. Enzimkivonás különböző növények raktározószöveteiből foszfát pufferben. 2. L-DOPA adása. 3. Extinkció-változás követése spektrofotométerrel percenként. - Növényi rezisztencia. Barna polimer. (Barnulási reakció) - Lokális léziók, hiperszenzitív reakció. - Redukált koenzimek visszaoxidálása: NAD(P)H-kinon-oxidoreduktáz enzim.

12 Enzimreakció kinetikájának jellemzése E (480 nm) m 1 Minta1 m 2 ΔE = lεδc ΔE/t ΔC/t = V 0 (kezdeti reakció sebesség) Minta1 Idő (perc)