Szedimentáció, Biofizika szeminárium 2. szemeszter

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Szedimentáció, Biofizika szeminárium 2. szemeszter"

Virág Lukácsné
6 évvel ezelőtt
Látták:

1 Szedimentáció, Elektroforézis Biofizika szeminárium 2. szemeszter

2 Makromolekulák analízise és elválasztása

3 Szedimentáció

4 Szedimentáció Miért van szükség centrifugálásra? A nehézségi erőtérben való ülepítés a 2-50 µm tartományban alkalmazható, az ennél kisebb részecskék ülepítéséhez a gravitációs erőtér nem elegendő, ezért centrifugális erőteret kell alkalmazni. Theodor Svedberg 1920-as években megalkotta az első ultracentrifugát. (N>10000 min -1 ) Ultracentrifuga Preparatív Analitikai Különböző méretű ill. moláris tömegű komponensek elkülönítése méret vagy a moláris tömeg meghatározása

5 Szedimentáció Koncentráció eloszlás viszonyok az UC cellájában Milyen erők hatnak a centrifugában lévő részecskére?

6 Szedimentáció Centrifugális erő: ma m, ρ 0 f v Súrlódási erő: m Felhajtó erő: ρ Vg = ρ rω = mr ω ρ Meddig gyorsul a részecske? 2 F s =F c -F f A centrifugális erő és a felhajtóerő különbsége addig mozgatja a részecskéket gyorsuló mozgással a tengelytől kifelé, amíg (a sebesség növekedésével) az ellenkező irányú súrlódási erővel egyensúlyba nem kerül.

NEM A centrifugális erő értéke függ a sugártól(a rω 2 c = ), a tengelytől l távolodva növekszik.

7 Szedimentációs sebességi módszer Erőegyensúly esetén: F c + Ff + Fs = 0 F s = F c F = 2 m 2 = 2 ρ ρ ω ω 0 fv mrω 0r mr 1 ρ ρ f Ezután a sebesség állandó lesz? NEM A centrifugális erő értéke függ a sugártól(a rω 2 c = ), a tengelytől l távolodva növekszik. Ülepedés esetén a részecske sebessége tehát a tengelytől távolodva növekszik (helyfüggő). S = v r ω 2 = ρ m 0 1 ρ f Szedimentációs állandó: S 1 Svedberg=10-13 s

8 Mire jó? Meghatározhatom a részecske/molekula tömegét Ha meghatározzuk a sebességet (v) és a centrifugális gyorsulást (rω 2 ), akkor a részecske tömege számolható: Ehhez tudnom kell az f alakfaktort, de D diffúziós állandó k - Boltzmann állandó R - egyetemes gázállandó N - Avogadro-szám 6*10 23 A tömeg meghatározásához a szedimentációs sebességi módszert kombinálni kell diffúziós mérésekkel. Meghatározhatom a részecske/molekula alakját

9 Szedimentációs egyensúlyi módszer Ha a részecskék elérik a cső falát, egyensúly áll be, a nettó sebesség nulla lesz; Ha csak a centrifugális erő hatnak, a molekulák a legkisebb energiájú helyen (az edény alján) helyezkednének el. DE! A mikroszkópikus mozgások folytatódnak A cső falának közelében kialakul a részecskéknek egy eloszlása. A tengelytől mért két különböző r1, illetve r2 távolságban az n1 és n2 molekulakoncentráció arányát a Bolztmann-eloszlásból kapjuk meg: E-helyzeti energia

10 Az energiák különbsége felírható Adott kísérletben az r1 és r2 pozíciók energiájának a különbségét a rotor szögsebessége határozza meg. A molekulák annál szűkebb r intervallumban helyezkednek el,,minél nagyobb a rotor szögsebessége. Szedimentációs egyensúly létrejön Vesszük a ln-t számolható mérhető

11 A kapott egyenletből a tömeg kiszámolható! A módszer előnye a szedimentációs sebességi módszerhez képest: Az eredmények nem függenek az alaki faktortól Egy probléma lehet: sűrűség meghatározása Sűrűség grádiens ultracentrifugálás

12 Sőrőség grádiens ultracentrifugálás Nagy sűrűségű, de kis molekulatömegű anyagok centrifugálásánál az egyensúly beálltakor sűrűséggradiens keletkezik. Pl.: CsCl Egy dalton molekulatömeg különbség már kimutatható a módszerrel (Pl.:Meselson-Stahl kísérlet) Pl.:Meselson-Stahl kísérlet Az E.coli baktériumokat 15 N táptalajon tenyésztették,majd átették őket 14 N táptalajra. Egy generációsidő elteltével az összes DNS a hibrid sűrűséget mutatta centrifugálás során A második generációban a 14 N DNS sűrűségének megfelelő sáv is megjelenik a hibrid sáv mellett. Ez a DNS szemikonzervatív replikációjának bizonyítéka.

13 Differenciál centrifugálás

15 Számolási példa Mekkora fordulatszámot kell beállítani a 10 cm-es rotorral rendelkező centrifugán, ha g-t kell alkalmaznunk két fehérje elválasztásához? RCF = a cp RCF= 15000g a= 15000x10= a cp = ω r = 4π n r g 2 N 2 a cp = 4 π r = 0,011N r 60 N = 2 a cp 0,011r n- másodpercenkénti fordulatszám N- percenkénti fordulatszám r-sugár (m)

16 Elektroforézis Elektromosan töltött molekula mozgása elektromos térben.

17 Elektroforézis Mi történik egy töltött molekulával, ha elektromos térbe kerül? v + fv +Ze E ZeE - 1. Coulomb erő 2. Surlódási erő F C =ZeE E=elektromos térerő e=elemi töltés z=töltések száma F surlódási = f v v=sebesség f=alaki faktor (súrlódási állandó) A részecskéknek, molekuláknak elektromos erőtér hatására bekövetkező transzlációs mozgását elektroforézisnek nevezik.

18 Erőegyensúly esetén állandó vándorlási sebesség: ZeE = fv Elektroforetikus mozgékonyság (egységnyi elektromos mozgási térre vonatkoztatott sebesség): U E = d l v = t l t idő alatt megtett út t idő U feszültségkülönbség d elektródok közötti távolság u el = ld Ut

19 Elektroforézis fajtái I. Szabad elektroforézis II. Kapilláris elektroforézis III. Gélelektroforézis 1. Agaróz gélelektroforézis 2. Poliakrilamid gélelektroforézis 3. Grádiens gélelektroforézis 4. Izoelektromos fókuszálás 5. Kétdimenziós elektroforézis IV. Blotting technikák 1. Southern Blot 2. NorthernBlot 3. Western Blot

II. Kapilláris elektroforézis Elektromos térben az oldott anyagok különböző sebességgel vándorolnak, töltésüknek és tömegüknek megfelelően: kis méret, nagy töltés nagy mozgékonyság/gyors nagy méret,

20 II. Kapilláris elektroforézis Elektromos térben az oldott anyagok különböző sebességgel vándorolnak, töltésüknek és tömegüknek megfelelően: kis méret, nagy töltés nagy mozgékonyság/gyors nagy méret, kis töltés kis mozgékonyság/ lassú kapilláris detektor Az elektroforézis egy vékony µm belső átmérőjű, pufferoldattal töltött kapillárisban történik. Detektálás: OD, λ = 200 nm puffer minta puffer elektród nagyfeszültségű tápegység elektród Dr. Gáspár Attila: Kapilláris elektroforézis

21 A módszer alapja Elektroozmotikus áramlás (EOF) a b c Kapilláris falán kialakuló kettősréteg Az elektroozmotikus áramlás kialakulása negatív töltésű kvarc kapilláris belső felülete (Si-O-) hidratált kationok gyűlnek össze a felület közelében tömegáramlás alakul ki az elektromos tér létrehozása miatt

22 Vándorlás: 1. Kationok 2. Töltés nélküli részecskék 3. Anionok Az EOF egy másik fontos előnye, hogy gyakorlatilag az összes részecskét, függetlenül azok töltésétől, azonos irányú mozgásban tartja. Kapilláris Elektroforézis előnyei: Csekély hőfejlődés Rövid mérési idő Nagy elválasztási hatékonyság Minimális mintatérfogat (1-10 nl) Könnyen automatizálható

23 Gyakorlati alkalmazás albumin α-1 α-2 béta gamma Két komponensből álló albumin frakció, ami az igen ritkán megfigyelhető bisalbuminaemiának felel meg. Jelentősen emelkedett α-1 és α-2 frakciók, amely aktív gyulladásos folyamatot jelez. Poliklonális gammopathia jelentősen emelkedett gamma frakciót eredményez, mely autoimmun kórképre utal.

24 III./1. Agaróz gélelektroforézis Alapelv: a nukleinsavak megfelelő puffer oldatban negatív töltésűek, ezért egyenáram hatására a pozitív pólus felé vándorolnak Agaróz: -térhálós szerkezetű poliszacharidláncokat tartalmaz -a kisebb méretűek gyorsabban vándorolnak ( futnak ) Gélfestés: a minta láthatóvá tételét szolgálja a futtatás során Etídium-bromid: kovalensen kötődik a nukleinsavakhoz Bekötődve fluoreszkál UV hatására UV alatt a nukleinsavak láthatóak

III/2. SDS- Poliakrilamid gélelektroforézis gél pórusnagysága a monomerek koncentrációjától függ; leghatékonyabb, rutinszerűen alkalmazott fehérje elválasztási módszer.

25 III/2. SDS- Poliakrilamid gélelektroforézis gél pórusnagysága a monomerek koncentrációjától függ; leghatékonyabb, rutinszerűen alkalmazott fehérje elválasztási módszer. Akrilamid + biszakrilamid + perszulfát poliakrilamid Összetevők: APS- elindítja a polimerizációt Temed- szabadgyök, katalizálja a polimerizációt Bisz-akrilamid-crosslinker SDS- anionos detergens A fehérje apoláros részéhez kapcsolódik Lefedi a pozitív régiókat Minden fehérjét anionossá tesz

: fehérjék Magas ph negatív Alacsony ph pozitív nettó töltés De

26 III/4. Izoelektromos fókuszálás Bizonyos makromolekulák, melyekben savas és bázikus csoportok is találhatóak, ha változik a közeg ph-ja össztöltésüket megváltoztatják. Pl.: fehérjék Magas ph negatív Alacsony ph pozitív nettó töltés De egy bizonyos ph-n az össztöltés nulla izoelektromos pont Az elektroforézis ph gradiensben végezzük A fehérjék az izoelektromos pontjuknak megfelelő ph-ig vándorolnak

27 III./5. Kétdimenziós elektroforézis Csökkenő méret Csökkenő ph

28 IV. A Southern, Northern és Western technikák Elektroforézissel a DNS, RNS vagy fehérje molekulák méret szerint elválaszthatók. A gélben elválasztott molekulák filterre blottolhatók. A filteren hibridizációval azonosíthatók a próbával homológ fragmentek, ellenanyag festéssel pedig a kérdéses fehérje. Southern-nel a gén DNS-e, Northern-nel a gén RNS-szinten történő kifejeződése, Western-nel a fehérje kifejeződése vizsgálható.

Gélelektroforézis során a méret szerinti elválasztás nem lesz

DNS fragmentumot kapunk az emésztés során 3.

29 IV./1. Southern Blot 1. A vizsgálandó DNS-t restrikciós enzimekkel emésztjük. 2. Gélelektroforézis során a méret szerinti elválasztás nem lesz tökéletes, mivel sok hasonló méretű, de eltérő szekvenciájú DNS fragmentumot kapunk az emésztés során 3. DNS fragmentumok denaturálása 4. Átvitel nitrocellulóz membránra 5. Jelölés (hibridizálás) komplementer DNS próbával festett gél autoradiogram 6. Az azonos hosszúságú, de eltérő szerkezetű fragmentumokat a jelölés után autoradiográfiával tesszük láthatóvá.

30 IV./3. Western Blot 1. SDS-gél 2. Átblottolás nitrocellulóz membránra 3. Jelölés elsődleges monoklonális antitesttel ez specifikusan köt 4. Másodlagos antitest, ehhez színváltozással járó reakciót katalizáló enzim kapcsolódik. 5. Enzimszubsztrát hozzáadása 6. Jel detektálása

31 Köszönöm a figyelmet!

Hasonló dokumentumok

Szedimentáció, Elektroforézis. Kollár Veronika

Szedimentáció, Elektroforézis. Kollár Veronika Szedimentáció, Elektroforézis Kollár Veronika 2010. 11. 25. Makromolekulák analízise és elválasztása Szedimentáció Miért van szükség centrifugálásra? A nehézségi erıtérben való ülepítés a 2-50 µm tartományban