Vg = fv. = 2r2 ( ρ ρ 0 )g. v sed. 3 r3 πg = 6πη 0. V = 4 3 r3 π

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Vg = fv. = 2r2 ( ρ ρ 0 )g. v sed. 3 r3 πg = 6πη 0. V = 4 3 r3 π"

Dániel Király
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 Szedimentáció, elektroforézis BÓDIS Emőke, TALIÁN Csaba Gábor Biofizika előadás 2011 Február 28.

2 Szedimentáció Általában a cél a részecskék méretének vagy tömegének a meghatározása. A gravitáción alapuló módszerek csak a 2-50 µm részecskemérettartományban hatékonyak Kisebb molekulák esetén az ülepedés a centrifugálásos módszeren alapszik

3 Ülepedés gravitációs erőtérben F felhajtó = ρ 0 Vg ρ 0 F fr = fv A gravitációs és a felhajtó erők különbsége gyorsítja a részecskét, amíg egyensúlyba kerülnek a súrlódási erővel m, ρ Ezután az ülepedési sebesség állandó (v = konst.) F F = g felhajtó F súrl F g = mg ρvg ρ 0 Vg = fv ρ 0 : a közeg sűrűsége, m: tömeg, ρ: sűrűség, v: a mozgó gömbszerű részecske sebessége

4 ρvg ρ 0 Vg = fv V = 4 3 r3 π F súrl = 6πη 0 rv Gömbszerű részecskékre A súrlódás Stokes-törvénye (η 0 : a közeg viszkozitása, v: sebesség, r: a részecske sugara) ( ρ ρ ) r3 πg = 6πη 0 rv mérhető v sed = 2r2 ( ρ ρ 0 )g 9η 0 számolható

5 Ülepedés centrifugális erőtérben: 1. Szedimentációs sebességi módszer Célja: molekulatömeg meghatározása (r nm) Hogyan számoljuk az erőket? v sebesség ω F súrl = fv m, ρ 0 2 F centrifug = mrω F felhajtó = ρ = F centrifug m ρ 2 0Vg ρ0 rω Archimedes : a kiszorított oldószer súlya F felh F f Centrifugális erő: gyorsuló koordináta rendszer

6 Meddig gyorsul a részecske? Addig gyorsul, amíg : F súrl = F centrifug F felhajtó m fv = mrω 2 ρ 0 ρ rω 2 = mrω 2 1 ρ 0 ρ Azután v=konst.? A centrifugális erő értéke függ a sugártól (a c = rω 2 ), a tengelytől távolodva növekszik. Ülepedés esetén a részecske sebessége tehát a tengelytől távolodva növekszik (helyfüggő) Nem

A Svedberg S = v rω 2 = m 1 ρ 0 ρ f S = ülepedés iállandó mérhető számolható Egység: 1 Sv = 10-13 s Ülepedési sebesség egységnyi térerőre Theodore Svedberg Svéd vegyész (1884-1971) Nobel-díj 1926-ban

7 A Svedberg S = v rω 2 = m 1 ρ 0 ρ f S = ülepedés iállandó mérhető számolható Egység: 1 Sv = s Ülepedési sebesség egységnyi térerőre Theodore Svedberg Svéd vegyész ( ) Nobel-díj 1926-ban Alaki faktor! Összefüggés van az alaki faktor (f) és a diffúziós állandó (D) között: f = kt D = RT ND k a Boltzmann állandó, R az egyetemes gázállandó és N az Avogadro-szám. A tömeg meghatározásához az ülepedési módszert és a diffúziós méréseket kell kombinálni.

8 2. Ülepedési egyensúlyi módszer A részecskék várhatóan elérik a cső alját: itt az átlagos ülepedési sebesség 0. ω Egyensúly alakul ki az ülepedés és a termikus diffúzió között. r 1 A hőmozgás energiája a részecskék egy részét magasabb energiaállapotba hozza. r 2 A cső alja közelében a részecskék egy adott eloszlása jön létre.

9 A tengelytől mért r 1 és r 2 távolságokra az c 1 és c 2 koncentrációk aránya kiszámolható a Boltzmann-eloszlásból: energia E 2 E 1 c 2 E 1 c 1 kte c 1 c 2 = e 2 Az E 1 és E 2 helyzeti energiák különbsége: E 1 E 2 = m 2 ω 2 1 ρ 0 r 2 2 ρ 2 r 1 ( )

10 c c 1 2 = e E E 1 kt Helyettesítsük be (E 1 -E 2 )-t és vegyük a logaritmusát: 2 ln c c 2 1 = 2 mω 1 2kT ρ0 ρ ( 2 2 ) r r 2 1 mérhető számolható Az alaki faktorra és a kiegészítő diffúziós mérésekre nincs szükség.

11 A molekulák sűrűsége (ρ) mérhető a sűrűségi grádiens centrifugálás módszerével. Emlékeztető: F up = (ρ 0 / ρ) m r ω 2 és F c = m r ω 2 ha ρ 0 = ρ, akkor F c = F f és v = 0! Sűrűségi grádiens ω Megkapható, ha nagy sűrűségű kis részecskéket centrifugálunk (e.g. CsCl, CsBr) Ha ilyen közegben centrifugáljuk a mintát, a részecskék a megfelelő sűrűségnél állnak meg.

Példa: fertőzött vörösvértestek grádiens centrifugálása A bal oldalon fertőzött sejtek láthatók, amelyeket növekvő koncentrációjú percoll

12 Példa: fertőzött vörösvértestek grádiens centrifugálása A bal oldalon fertőzött sejtek láthatók, amelyeket növekvő koncentrációjú percoll folytonos grádiensében választottak szét. A parazita eritrocitán belüli életciklusának különböző stádiumai elválnak a grádiens egyes részeiben.

Centrifuga Centrifuga < 10.000 rpm Szupercentrifuga 10.000 20.

000 rpm Ultracentrifuga Preparatív UC: molekulák elválasztása

13 Centrifuga Centrifuga < rpm Szupercentrifuga rpm Ultracentrifuga > rpm Ultracentrifuga Preparatív UC: molekulák elválasztása méretük és molekulatömegük alapján Analitikai UC: molekulák méretének és moláris tömegének meghatározása

14 Elektroforézis Az elektroforézis olyan technika, amellyel elektromosan töltött molekulák választhatók szét fizikai tulajdonságaik (mint töltés, tömeg) alapján, amint egy mátrixon kényszerítjük keresztül őket elektromos áram segítségével.

15 Elektromosan töltött molekula mozgása elektromos térben Mik az erők? F súrl + F v + F Coulomb E

16 v F s F c F c = QE = ZeE + F E Meddig gyorsul a részecske? Amíg : F c = F f ZeE = fv Coulomb-erő: Súrlódási erő: F f = fv E= elektromos térerősség e= elemi töltés Z= töltésszám v = sebesség f = alaki faktor

17 Az elektroforetikus mobilitás u el = v E = Ze f Az egységnyi elektromos térerősség hatására elért sebességgel egyenlő. Gömbszerű molekulát feltételezve: ZeE = 6πηrv u el = Ze 6πηr (Stokes-törvény) A molekula sugara számolható

18 Alkalmazás Az elválasztási technikák alapja az, hogy a különböző sajátságú molekulák eltérően viselkednek. Típusok szabad áramlású (határ-) elektroforézis gélelektroforézis kapilláris elektroforézis Az elektroforézishez szükséges: nagyfeszültség, elektródás, puffer és közeg, amely a puffert tartalmazza A közeg lehet pl. szűrőpapír cellulóz-acetát szalag különféle gélek kapilláris

19 Szabad áramlású elektroforézis: A pozitív töltésű molekulák határa emelkedik a bal ágban + + a mozgó határvonal pozíciója optikai mérésekkel meghatározható (abszorpció) magasság-koncentráció függvény rajzolható számolható sebesség

Az elektroforetikus mobilitás meghatározása mérhető u el = v E = Ze f = Ze 6πηr számolható Az elektromos térerősség számolása Ohm törvényéből: Egy folyadékoszlop

20 Az elektroforetikus mobilitás meghatározása mérhető u el = v E = Ze f = Ze 6πηr számolható Az elektromos térerősség számolása Ohm törvényéből: Egy folyadékoszlop ellenállása, ahol x a magasság, A a keresztmetszet, ρ=1/σ a specifikus ellenállás, σ a specifikus vezetőképesség így: R = ρ x A = x σa E = U x = I R x = I x xσa = I σa A x

óriásfehérjék, DNS, RNS - a futási paraméterek a

21 Gélelektroforézis Az elválasztási komponensek egy gélben vannak: poliakrilamid, agaróz fehérjék óriásfehérjék, DNS, RNS - a futási paraméterek a mintához igazodnak; - a sebesség a fehérjék méretétől függ.

22 PAGE (poliakrilamid gélelektroforézis, 1959) 3D hálózat pórusok Akrilamid Ammónium-perszulfát: megindítja a polimerizációt TEMED: szabad gyökök, amelyek katalizálják a polimerizációt Bis-akrilamid: keresztköti a szomszédos polimereket és merev gélt képez; koncentrációja meghatározza a pórusok méretét

23 A molekuláknak ugyanabban az irányban kell haladniuk SDS (sodium-dodecilsulfate) anionos detergens: anionos poláros vég és hosszú apoláros farokrész denaturáló ágens a fehérjék apoláros részeihez kapcsolódhat, elektromos kölcsönhatást létesít a pozitív régiókkal, a negatív régiók szabadon maradnak minden fehérje negatív lesz molekulák szétválasztása egy adott ph-n a méretük alapján (a kicsik gyorsabban, a nagyok lassabbak!) A futás színes markerekkel követhető (pl. brómfenolkék) kis molekulatömeg, elöl fut

viszonyítottan megtett távolság alapján. Ezüst festés : fémes kolloid ezüst lerakódása a gélben a fehérjecsíkok helyén.

24 SDS-poliakrilamid gél Festés (CoomassieBlue): az egyes fehérjék különálló csíkokban jelennek meg: fotometrálható (Amido-fekete, Fast green) Gyakran ismert molekulatömegű markereket futattunk egy külön sávban a gélen, és az ismeretlen fehérje mérete meghatározható a markerhez viszonyítottan megtett távolság alapján. Ezüst festés : fémes kolloid ezüst lerakódása a gélben a fehérjecsíkok helyén. A kereskedelmi ezüst kitek rendkívül robusztusak és könnyen használhatók. Egy tipikus gélben kevesebb mint 0,5 ng fehérje detektálható,de nagyon tiszta környezetet igényel.

25 Izoelektromos fókuszálás - a fehérjéket a töltésük szerint választja el, pontosabban a pi alapján; - a fehérjéknek negatívan és pozitívan töltött csoportjaik is vannak; - Ha a ph változik, a nettó töltésük is változik; magas ph-n: negatív; alacsony ph-n: pozitív. -Izoelektromos pont: az a ph érték, ahol a fehérje nettó töltése 0; -Az elektroforézist egy ph-grádiensben végzik: a makromolekulák addig a pontig vándorolnak, ahol a rájuk jellemző pi van, itt elvesztik a nettó töltésüket és megállnak. -Egyensúly alakul ki az elektroforézis és a diffúzió között -A különböző pi értékű komponensek elválaszthatók

26 Kétdimenziós elektroforézis Alapelv: kétféle elválasztási módszert alkalmaznak és a minta fehérjéit két különböző sajátság alapján választják el. Merőlegesen fut a két módszer: 1. elválasztás izoelektromos fókuszálással (pi); 2. SDS-PAGE gélelektroforézis (molekulaméret).

27 Nagyon jó felbontás!

28 Egy példa a kétdimenziós gélelektroforézisre

29 2D-PAGE Első lépés: izoelektromos fókuszálás ph 3 ph 10 biotech.szbk.u-szeged.hu/kk_jegyzet/.../5_downstream_1.ppt

30 biotech.szbk.u-szeged.hu/kk_jegyzet/.../5_downstream_1.ppt

Hasonló dokumentumok

Vg = fv. = 2r2 ( ρ ρ 0 )g. v sed. 3 r3 πg = 6πη 0. V = 4 3 r3 π

Vg = fv. = 2r2 ( ρ ρ 0 )g. v sed. 3 r3 πg = 6πη 0. V = 4 3 r3 π Szedimentáció, elektroforézis BÓDIS Emőke, TALIÁN Csaba Gábor Biofizika előadás 2011 Február 28. Szedimentáció Általában a cél a részecskék méretének vagy tömegének a meghatározása. A gravitáción alapuló