Biofizika szeminárium

Átírás

1 Szedimentáció, elektroforézis Biofizika szeminárium

2 Makromolekulák analízise és elválasztása

3 Miért van szükség centrifugára? 50kg / mol / mol = 3 8,33 10 kg Helyzeti energia változása = = = 3 4 Epot m g h 8, ,81 0, 01 8, J 1 cm ülepedés Mozgási energia függőleges komponense: 1 k-boltzmannállandó Ek,z = k T 1, (4) 10 3 J/K 3 J 1 0,5 1, K =,0 10 J K 1,0 10 J 4 8,17 10 J 50

4 Sűrűséggrádiens módszer F centrifug = mrω m Ffelhajtó = ρk rωω ρ Ha ρ= ρ k akkor F f = mrω = F f és v = 0! Nagy molekulatömeg, kis méret: CsCl, CsBr, glicerin, szukróz (szacharóz), fikoll

5 Meselson-Stahl kísérlet (1958) Matthew Meselson amerikai biológus (1930-) Franklin Stahl amerikai biológus (199-)

6 14 N Nem konzervatív! Nem diszperzív!

7 Számolási példa Mekkora fordulatszámot kell beállítani a 5 cm sugarú rotorral rendelkező centrifugán, g-t kell alkalmaznunk két fehérje elválasztásához? RCF= 80000g RCF = a cp g a=80000x10= a cp = ω r = 4π n r n-másodpercenkénti a cp N = 4 π r = 0,011 N 60 r fordulatszám N-percenkénti fordulatszám r-sugár(m) N = a cp 0,011r N= rpm

8 Érdekességek LDL (rossz) és HDL (ún. "jó" koleszterin. Alacsony szintje esetén nő az érelmeszesedés, a szívinfarktus és az agyvérzés kockázata.)koleszterin elkülönítése. Vizelet Üledékben vörösvértestek, fehérvérsejtek, hámsejtek, fehérjecilinderek, oxalát-, húgysav-, kálcium- foszfátkristályok és baktériumok is jelen lehetnek. Vér- laborvizsgálat lazarsoftware.com/edu/elvalasztastechnika.pdf

9 Elektroforézis A részecskéknek, molekuláknak elektromos erőtér hatására bekövetkező A részecskéknek, molekuláknak elektromos erőtér hatására bekövetkező mozgását elektroforézisnek nevezik.

10 Elektroforézisfajtáifajtái I. Szabad elektroforézis II. Gélelektroforézis 1. Agarózgélelektroforézis. Poliakrilamid gélelektroforézis 3. Grádiens gélelektroforézis 4. Izoelektromos fókuszálás 5. Kétdimenziós elektroforézis III. Blotting technikák 1. Southern Blot IV. Kapilláris elektroforézis. NorthernBlot 3. Western Blot

11 SDS poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) nátrium-dodecil-szulfát (sodium-dodecyl-sulphate) TEMED (tetrametil-etilén-diamin) ammónium-perszulfát

12 DiszkontinuusPAGE ph = 8,3 ph = 6,8 5% akrilamid ph = 8,9 8-1% akrilamid ph = 8,3

13 stacking gél, ph = 6,8 Semleges forma túlsúlya, kis elektroforetikus mobilitás szeparáló gél, ph = 8,9 Negatív forma túlsúlya, nagy elektroforetikus mobilitás Stacking(felső) gélben: Feszültség grádiens alakul ki. Cl - mobilitása sokkal nagyobb 1. alsó zónában gyorsabban, egyedül halad. a zóna elektromos ellenállása (R) kisebb Sorba kapcsolt zónákban az áramerősség (I) azonos A feszültség: V = I R tehát nagyobb lesz a glicinzónában V Ha egy glicinmolekula előrediffundál, a kisebb feszültség miatt lelassul Ha egy Cl - lemarad, a nagyobb feszültség miatt felgyorsul Így az ionfázisok szétválása és a feszültséggrádiens fokozatosan egymást erősítik

14 A stacking gélben a fehérjék mobilitása a Cl - és a glicin között van ezért közöttük haladnak, egy keskeny sávba tömörülve A szeparáló gélben a nagyobb ph mellett a glicin töltése negatív, nagyobb lesz a mobilitása is Mobilitási sorrend: Cl -, glicin, fehérjék az ionfront a fehérjék előtt halad a nagyobb ph növeli a fehérjék mobilitását a kisebb pórusméret (nagyobb akrilamid %) csökkenti Szétválás elsősorban a méret, kisebb részt az alak és a töltés szerint

15 Blot technikák Mit? Mivel? Southern specifikus DNS-szekvencia DNS-DNS hibridizáció Northern specifikus RNS-szekvencia RNS-DNS hibridizáció Western specifikus fehérje szekvencia fehérje-ellenanyag Eastern posztszintetikus fehérjemódosítás foszfát, szénhidrát, lipid Edwin Southern angol biokémikus (1938-)

16 Southern/ Northern blot

17 Western blot

18 Kapilláris elektroforézis Elektromos térben az oldott anyagok különböző sebességgel vándorolnak, töltésüknek és tömegüknek megfelelően: kis méret, nagy töltés nagy mozgékonyság/gyors nagy méret, kis töltés kis mozgékonyság/ lassú Az elektroforézis egy vékony, 5-75 µm belső átmérőjű, pufferoldattal töltött kapillárisban történik. Detektálás: OD, λ = 00 nm tamop41a.ttk.pte.hu

19 A módszer alapja: Elektroozmotikus áramlás (EOF) Az elektroozmotikus áramlás kialakulása negatív töltésű kvarc kapilláris belső felülete (Si-O-) hidratált kationok gyűlnek össze a felület közelében tömegáramlás alakul ki az elektromos tér létrehozása miatt

20 Vándorlás: 1. Kationok. Töltés nélküli részecskék 3. Anionok Az EOF egy másik fontos előnye, hogy az gyakorlatilag az összes részecskét, függetlenül azok töltésétől, azonos irányú mozgásban tartja.

21 Kapilláris elektroforézis előnyei: Összes részecske azonos irányban mozog Csekély hőfejlődés Rövid mérési idő Nagy szelektivitás Nagy elválasztási hatékonyság Minimális mintatérfogat (1-10 nl) Könnyen automatizálható Más eszközökhöz (MS) kapcsolható Kapilláris elektroforézis hátrányai: Preparatív léptékben nem működik Megfelelő koncentráció és oldhatóság Rossz reprodukálhatóság Kitapadó vegyületek

22 Ülepedés centrifugális erőtérben: 1. Szedimentációs sebességi módszer Célja: molekulatömeg meghatározása (r nm), a gravitáción alapuló módszerek nem hatékonyak Hogyan számoljuk az erıket? Centrifugális erő: m, ρ 0 Súrlódási erő: f v m ρ Vg = ρ r ω Felhajtó erő: 0 0 ma = mr ω ρ Forgó rendszer: a = rω Meddig gyorsul a részecske? F s =F c -F f = m = ρ ρ ω ω 0 fv mrω 0r mr 1 ρ ρ A centrifugális erő és a felhajtóerő különbsége addig mozgatja a részecskéket gyorsuló mozgással a tengelytől kifelé, amíg (a sebesség növekedésével) az ellenkező irányú súrlódási erővel egyensúlyba nem kerül.

23 S = v r ω = ρ m k 1 ρ f Szedimentációs állandó: 1 Svedberg=10-13 s mérhetı számolható alaki faktor! Összefüggés van az alaki faktor (f) és a diffúziós állandó (D) között: f = k T D = R T N D A k: Boltzmann állandó R: egyetemes gázállandó N : Avogadro-szám. A tömeg meghatározásához az ülepedési módszert és a diffúziós méréseket kell kombinálni.

24 . Szedimentációs egyensúlyi módszer Ha csak a centrifugális erő hatnak a molekulák a legkisebb energiájú helyen (az edény alján) helyezkednének el. DE! A mikroszkópikus mozgások folytatódnak A cső falának közelében kialakul a részecskéknek egy eloszlása. A tengelytől mért két különböző r1, illetve r távolságban az c 1 és c molekulakoncentráció arányát a Bolztmann-eloszlásból kapjuk meg: energia E E 1 c c 1 c c 1 = e E1 E E kt ln c c 1 = m ω k 1 ρ ρ kt ( ) r r 1 mérhető számolható

25 Surlódási erő Coulomb erő F surlódási = f v F C =ZeE v=sebesség f=alaki faktor (súrlódási állandó) E=elektromos térerő e=elemi töltés z=töltések száma Meddig gyorsul a részecske? amíg : F c = F f Elektroforetikus mobilitás: ZeE = fv Gömbszerű molekulára: ZeE = 6πηrv (Stokes-törvény) az egységnyi térerősség hatására létrejövő mozgási sebesség. u el = v E = Ze f Ze 6πηr = A molekula sugara számolható.