Sejtbiológia gyakorlati szempontból. Alapfogalmak, tematika

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Sejtbiológia gyakorlati szempontból. Alapfogalmak, tematika"

Donát Somogyi
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 Sejtbiológia gyakorlati szempontból Alapfogalmak, tematika

2 A sejttenyésztés jelentősége Kutatás: az állati és humán sejtekre jellemző biokémiai utak, különböző sejtszintű szabályozások vizsgálata Rekombináns fehérjék előállítása Monoklonális ellenanyag termeltetése (hibridóma sejtekkel) Állati vírusok szaporítására vakcinagyártás céljából Sérült szövetek rekonstrukciója, nem funkcionáló szövetek helyettesítése a saját szövetek tenyésztésével (pl. bőrszövet, porcszövet) Állatkísérletek kiegészítése, részleges helyettesítése, gyógyszerfejlesztés

Állati vírusok szaporítására vakcinagyártás céljából Sérült szövetek rekonstrukciója, nem funkcionáló szövetek

3 Sejttípusok Primer sejtek Eredeti szervből vagy szövetből származnak Normál, nem transzformált és nem immortalizált sejtek Genetikailag és funkcionálisan is jobban hasonlítanak az in vivo sejtekre, mint az immortalizált sejtvonalak Véges élettartamúak, nem tenyészthetők korlátlan ideig A fenntarthatóság korlátja: a kromoszómavégek (telomerek) minden osztódási ciklusban bekövetkező megrövidülése aktiválódnak a sejtciklust ellenőrző (és azt leállító) mechanizmusok

Véges élettartamúak, nem tenyészthetők korlátlan ideig A fenntarthatóság korlátja: a kromoszómavégek (telomerek)

4 Primer sejtek beszerzési forrásai Saját izolálás Viszonylag olcsó A megfelelő donor beszerzése problémás lehet Etikai aspektusok Az izoláló protokol kidolgozása hosszadalmas lehet A minőség reprodukálhatósága nehézkes lehet Kereskedelemben kapható sejtek beszerzése Megbízható minőség, minőségi bizonylattal Részletes donorinformáció Kidolgozott sejttenyésztési protokol Az adott sejttípushoz kifejleszett optimális médium

nehézkes lehet Kereskedelemben kapható sejtek beszerzése Megbízható minőség, minőségi bizonylattal

5 A Lonza cég primer sejt kínálata A legnagyobb primer sejt választékkal rendelkező cég Több, mint 200 féle sejttípus rendelhető Biztonságos folyékony nitrogénben történő szállítás Garancia

rendelhető Biztonságos folyékony nitrogénben történő

7 Sejttípusok Sejtvonal Genetikailag viszonylag homogén Korlátlan ideig fenntartható sejtkultúra Normál sejtek in vitro transzformációjával, vagy tumor sejtek felhasználásával nyerik Előnye: könnyen és viszonylag olcsón fenntartható Hátránya: biológiailag nem feltétlen releváns eredményeket kapunk HeLa sejtek

tumor sejtek felhasználásával nyerik Előnye: könnyen és viszonylag olcsón

8 Sejtvonalak beszerzési forrásai A laborban van évek óta Genetikailag már módosulhatott a sok passzálás során Mycoplasma kontamináció? Más labortól kaptuk Az eredete nem biztos, hogy ismert Mycoplasma kontamináció? Biztonságos beszerzési források, sejtbankok: European Human Cell Bank (Salisbury, UK) European Collection of Animal Cell Cultures (Salisbury, UK) American Type Culture Collection (USA) ATCC Tumor Bank, Deutsche Krebs Forschungszentrum, (Heidelberg, Germany) Collection of Cancer Cell Lines (Japan)

Biztonságos beszerzési források, sejtbankok: European Human Cell Bank (Salisbury, UK) European Collection of Animal Cell

10 Kondicionálisan immortalizált sejtek A primer sejtek és a sejtvonalak előnyei egy sejttípusban Kondicionális immortalizáció: az onkogének expressziójának kikapcsolása bizonyos körülmények között Lonza: az SV40 Large T antigen tsa58 hőmérséklet szenzitív variánsának (tssv40t) és a humán telomeráz katalitikus alegységének együttes alkalmazása: 33 C-on: immortalizált fenotípus 37 C-on: primer sejt fenotípus

Lonza: az SV40 Large T antigen tsa58 hőmérséklet szenzitív variánsának (tssv40t) és a humán telomeráz

11 33 C-on: immortalizált fenotípus 37 C-on: primer sejt fenotípus

12 A sejtkultúrák fenntartása Az in vitro sejttenyésztés módjai: Adherens módon, monolayer kultúra a sejtek a tenyésztő edény aljára kitapadnak (mátrix fehérjék, Ca 2+ ionok) Szuszpenzióban csak bizonyos sejtek képesek erre, pl. CHO, BHK, VeRo, HeLa

aljára kitapadnak (mátrix fehérjék, Ca 2+ ionok)

13 A sejtkultúrák fenntartása - passzálás A sejtek növekedése a telítési szakaszban leáll - passzálás Szuszpenzióban a sejtek friss médiummal való higítása Letapadó sejtek a konfluens kultúra elérésekor a sejteket először szuszpenzióba visszük (fizikai mód, proteázok, kelátképzők), majd ezután tesszük friss médiumba

higítása Letapadó sejtek a konfluens kultúra elérésekor a sejteket először

14 A sejtkultúrák fenntartása - tápfolyadékok A tápfolyadék (médium) feladata, hogy a sejtek számára biztosítsa a növekedéshez szükséges tápanyagokat, növekedési faktorokat, a megfelelő fizikai és kémiai környezetet Sóoldat: anorgainikus ionok (Na +, K +, Ca 2+, Mg 2+, Cl -, foszfát, hidrogénkarbonát) Glükóz: energiaforrás Esszenciális aminosavak: ezeket az aminosavakat a gerincesekből származó sejtek nem tudják előállítani Vitaminok: pl. kolin, folsav, nikotinamid, inozitol, pantoténsav, piridoxin, riboflavin, tiamin, biotin, B 12 Pufferrendszer: oldott CO 2 /bikarbonát, vagy 20 mm HEPES Fenolvörös: ph indikátor Szérum: 5-20% (pl. Fetal Bovine Serum, Human Serum) A sejtek proliferációjához elengedhetetlen komponenseket tartalmaz. Alternatíva: szérummentes médium Antibiotikumok: penicillin, streptomycin, gentamycin bakteriális fertőzések ellen véd

származó sejtek nem tudják előállítani Vitaminok: pl.

15 A sejtkultúrák fenntartása tenyésztő edények Letapadó sejtekhez: sejttenyésztéshez alkalmas felület (bevonattal vagy anélkül) Flaskák (normál, vagy szűrős kupakos) Petri csészék 6, 12, 24, 48, 96-lyukú platek Roller bottle

(bevonattal vagy anélkül) Flaskák (normál, vagy szűrős

16 A sejtkultúrák fenntartása tenyésztő edények Speciális tenyésztőedény UpCell Cells harvested by trypsinization 37 C C Cells harvested from UpCell Surface by temperature reduction

harvested by trypsinization 37 C 20-25 C

17 A sejtkultúrák fenntartása tenyésztő edények 3D szövetmodell UpCell segítségével C 37 C

18 A sejtkultúrák fenntartása tenyésztő edények. Szuszpenziós sejtekhez Kíméletes kevertetés Spinner flask (műanyag vagy üveg) Reaktorok

19 A sejtkultúrák fenntartása berendezések Steril fülke Szűrt levegőt áramoltatnak a munkafelület fölött 0,3 mm-nél nagyobb részecskéket szűr ki UV (germicid) lámpa segít fenntartani a sterilitást CO2 inkubátor Egyenletes 37 C hőmérséklet 5% CO2 koncentráció Megfelelő páratartalom biztostása Fontos a felületek jól tisztántarthatósága (élek, csavarok, stb. nélkül)

fenntartani a sterilitást CO2 inkubátor Egyenletes 37 C hőmérséklet 5% CO2 koncentráció

20 A sejtkultúrák fenntartása berendezések Centrifuga A sejtek kíméletes lecentrifugálásához Ha lehet, kilendülőfejes rotor 15, 50 ml-es Falcon cső rotor Mikroszkóp Inverz mikroszkóp Fluoreszcens mikroszkóp Konfokális mikroszkóp

kilendülőfejes rotor 15, 50 ml-es Falcon cső rotor

21 Miről lesz még szó? Primer sejtek kezelése, passzálása -film Sejtek transzfektálása módszertani áttekintés, truobleshooting Amaxa Nuclofector System Sejt viabilitás, citotoxicitás Luminométeres meghatározás Vialight, Toxilight kitekkel Mycoplasma és detektálása MycoAlert mérés (mintát lehet hozni)

Hasonló dokumentumok

Sejttenyésztési alapismeretek

Sejttenyésztési alapismeretek 1. Bevezetés A sejteknek ún. sejtkultúrákban történő tenyésztése (a sejteket az eredeti helyükről eltávolítva in vitro tartjuk fenn ill. szaporítjuk) és tanulmányozása több