(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: C07K 16/24 (06.01) A61K 47/48 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0826 PCT/GB 04/ () Elsõbbségi adatok: PCT/GB03/ WO P US 76 P US (72) Feltaláló: BASRAN, Amrik, Domantis Ltd., Cambridge CB4 0WG (GB) (73) Jogosult: Domantis Limited, Brentford, Middlesex TW8 9GS (GB) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Peg-ezett, egydoménes antitestek (dab) (7) Kivonat A találmány tárgyát egy vagy több antitestdomént tartalmazó, természetesen elõforduló vagy szintetikus, polimerkapcsolt polipeptidek képezik. HU T2 A leírás terjedelme 80 oldal (ezen belül 11 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A hagyományos antitestek legalább négy polipeptidláncot tartalmazó, több alegységes, nagyméretû fehérjemolekulák. Például, az emberi IgG-nek két nehézlánca és két könnyûlánca van, amelyek diszulfidhíddal összekapcsolódva alkotják a mûködõ antitestet. A hagyományos IgG mérete körülbelül kd. Viszonylag nagy méretük miatt, a teljes antitestek (például, IgG, IgA, IgM stb.) terápiás alkalmazása bizonyos problémák, például, a szövetbe történõ behatolás miatt, korlátozott. Jelentõs törekvések irányultak antigénkötõ funkciójukat és oldékonyságukat megtartó kisebb antitestfragmentumok azonosítására és elõállítására. Az antitestek nehéz és könnyû polipeptidláncai tartalmaznak antigénekkel való kölcsönhatásban részt vevõ variábilis (V) régiókat, és szerkezeti támaszt biztosító konstans (C) régiókat, amelyek immuneffektorokkal történõ nem antigénspecifikus kölcsönhatásokban mûködnek. Egy adott hagyományos antitest antigénkötõ doménja két elkülönült doménbõl áll: nehézlánc-eredetû variábilis doménbõl (V H ) és könnyûlánceredetû variábilis doménbõl (V L : amely lehet V vagy V ). Önmagában az antigénkötõ helyet hat polipeptidhurok alkotja: három hurok a V H doménbõl (H1, H2 és H3), és három pedig a V L doménbõl (L1, L2 és L3). In vivo, av H és V L doméneket kódoló V gének diverz primer repertoárja a génszegmentumok kombinatoriális átrendezésével készül. C régiók közé tartoznak C L régióknak nevezett, könnyûlánc-eredetû C régiók és CH1, CH2 és CH3 régióknak nevezett, nehézlánc-eredetû C régiók. A természetes körülmények között elõforduló antitesteknek számos kisebb antigénkötõ fragmentumát azonosították proteázzal végzett emésztést követõen. Ezek közé tartozik, például, a Fab-fragmentum (V L C L C H 1 V H ), Fab -fragmentum (a nehézlánc csuklórégióját tartalmazó Fab) és F(ab ) 2 -fragmentum (nehézlánc-eredetû csuklórégióval összekapcsolt Fab - fragmentumok dimerje). Rekombináns eljárásokat alkalmaztak még az ezeknél kisebb, szintetikus peptidlinkerrel összekapcsolt V L és V H doménekbõl álló egyláncú Fv -nek (variábilis fragmentum) vagy scfv -nek nevezett antigénkötõ fragmentumok elõállítására. Bár a természetes körülmények között (például emberekben és a legtöbb más emlõsben) elõforduló antitest antigénkötõ-egységrõl általában ismert, hogy egy pár V régióból (V L /V H ) áll, a tevefélék (Camelidae) közé tartozó fajok nagyrészt olyan, teljes mértékben funkcionális, nagyon specifikus antitesteket expresszálnak, amelyben nincsenek könnyûlánc-eredetû szekvenciák. A tevefélékbõl származó nehézlánc-eredetû antitestek konstans régióikon át dimerizált, egyegy külön nehézláncból létrejött homodimerek. E tevefélék nehézlánc-eredetû variábilis doménjeit V H Hdoméneknek nevezik, és a V H lánc fragmentumaiként való izolálás esetén megtartják nagy specificitású antigénkötõ képességüket [Hamers Casterman és munkatársai, Nature 363, (1993); Gahroudi és munkatársai, FEBS Lett. 414, (1997)]. Antigént kötõ V H egydoméneket, például immunizált egerek lépébõl származó genomi DNS-bõl amplifikált és E coliban expresszált egéreredetû V H gének könyvtárából is azonosítottak [Ward és munkatársai, Nature 341, (1989)]. Az izolált V H egydoméneket Ward és munkatársai doménantitesteknek ( dab¹k ) nevezték el. A leírás szerinti értelemben, a dab kifejezés antigént specifikusan kötõ, antitesteredetû egyvariábilisdoménes (V H vagy V L ) polipeptidet jelent. Egy adott dab más V doménektõl függetlenül köt antigént, azonban, a leírás szerinti értelemben, egy adott dab más V H vagy V L doménekkel együtt homo- vagy heteromultimerként lehet jelen, ahol a többi domén nem szükséges ahhoz, hogy a dab antigént kössön, azaz, ahol a dab a további V H vagy V L doménektõl függetlenül köt antigént. Az antitesteredetû, variábilis egydomének, például V H H, a legkisebb ismert antigénkötõ antitestek. Terápiás alkalmazásra, elõnyösek az emberi antitestek, elsõsorban azért, mert nem annyira valószínû, hogy betegeknek való beadás esetén immunválaszt váltanak ki. Ahogyan a fentiekben megjegyeztük, a nem tevefélékbõl származó, izolált V H domének hajlamosak viszonylag rosszul oldódni és gyakran expresszálódnak gyengén. A tevefélékbõl származó V HH és az emberi antitesteredetû V H domének összehasonlítása számos kulcsfontosságú különbségre világított rá a tevefélék, emberi V H domének V H /V L interfészének megfelelõ V HH doménjének vázrégióiban. Elvégezték az emberi V H 3 ezen aminosavainak a V HH -szekvenciára jobban emlékeztetõ mutációját (különösen Gly 44 Glu, Leu 4 Arg és Trp 47 Gly csere), amellyel olyan tevésített emberi V H doméneket akartak elõállítani, amelyek antigénkötõ aktivitásuk megtartása mellett [Davies és Riechmann, FEBS Lett. 339, (1994)] jól expresszálhatók és oldhatók. (A variábilis domén aminosavainak leírásban alkalmazott számozása összhangban van a Kabat-féle számozási konvencióval [Kabat és munkatársai, Sequences of Immunological Interest,. kiad., kiad.: U. S. Dept. Health & Human Services, Washington, D. C. (1991)]. A WO 03/03694 számú nemzetközi közzétételi irat (Muyldermans) ismertette, hogy a Trp 3 Arg mutáció javította a nem tevefélékbõl származó V H domének oldhatóságát. Davies és Riechmann [Davies és Riechmann, Biotechnology N. Y. 13, (199)] is ismertette tevésített, emberi V H domének fágbemutatásos repertoárjának elõállítását és az olyan klónok szelektálását, amelyek a haptént 0 0 nm tartományba esõ affinitással kötötték, azonban a fehérjeantigén kötésére szelektált klónok affinitásai gyengébbek voltak. A WO 00/29004 számú nemzetközi közzétételi irat (Plaskin és munkatársai) és Reiter és munkatársai [Reiter és munkatársai, J. Mol. Biol. 290, (1999)] ismertet olyan, egéreredetû antitestbõl származó és E. coliban expresszált, izolált V H doméneket, amelyek igen stabilak voltak és a nanomoláris tartományba esõ affinitással kötöttek fehérjeantigéneket. A WO 90/0144 számú nemzetközi közzétételi iratban (Winter és munkatársai) a kipróbálás célját szolgáló lizozimet 19 nm disszociációs konstanssal kötõ, egéreredetû VH doménbõl származó antitestfragmentumot írtak le. 2

3 A WO 02/01870 számú nemzetközi közzétételi irat (Entwistle és munkatársai) kipróbálás célját szolgáló antigéneket kötõ, emberi V H -eredetû egydoménes antitestfragmentumokat, így Brucella antigénre specifikus scfv¹t 117 nm affinitással kötõ V H domént és FALG elleni IgG¹t kötõ V H domént ismertet. Tanha és munkatársai [Tanha és munkatársai, J. Biol. Chem. 276, (01)] kipróbálás célját szolgáló antigénként alkalmazott két monoklonális antitestet kötõ, mikromoláris tartományba esõ disszociációs konstansú, tevésített emberi V H domén szelekcióját írják le. Az US számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (Safeld és munkatársai) az emberi TNF¹et 8 M vagy annál alacsonyabb affinitással kötõ, az emberi TNF¹re 3 see 1 vagy annál alacsonyabb disszociációs sebességû [off-rate (K off )] és standard L929-sejtekkel végzett vizsgálatban emberi TNF¹et semlegesítõ emberi antitesteket ír le. Bár sok antitest és azok származéka alkalmas diagnosztikára és terápiára, az antitestek ideális farmakokinetikáját konkrét alkalmazás során gyakran nem sikerül elérni. Az antitestmolekulák farmakokinetikájának javítása céljából, a találmány tárgyát variábilis egydoménes régiójú, fokozott stabilitást és féléletidõt biztosító polimerekhez kapcsolt polipeptidek képezik. A polimermolekulák (például, polietilénglikol, PEG) fehérjékhez való kapcsolása jól ismert, és ezekrõl kimutatták, hogy modulálják a módosított fehérjék farmakokinetikai tulajdonságait. Például, fehérjék PEG-gel való módosításáról kimutatták, hogy megváltoztatja az in vivo keringési féléletidõt, antigenicitást, oldhatóságot, és a fehérje proteolízissel szembeni ellenállását [Abuchowski és munkatársai, J. Biol. Chem., 22, 378 (1977); Nucci és munkatársai, Adv. Drug Delivery Reviews, 6, 133 (1991); Francis és munkatársai, Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3, szerk: Borchardt; és Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization, , kiad.: Plenum, NY (1991)]. Fehérjemolekulák irányított és random PEG-ezése a technikában ismert [lásd például: Zalipsky és Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, , kiad.: Plenum, NY (1992); Goodson és Katre, Bio/Technology, 8, 343 (1990); Hershfield és munkatársai, PNAS 88: 718 (1991)]. Konkrétabban, antitestmolekulák random PEG-ezését már leírták lizin aminosavak és tiolált származékok esetében [Ling és Mattiasson, Immunol. Methods 9, 327 (1983); Wilkinson és munkatársai, Immunol. Letters, 1, 17 (1987); Kitamura és munkatársai, Cancer Res. 1: 43 (1991); Delgado és munkatársai, Br. J. Cancer, 73, 17 (1996); Pedley és munkatársai, Br. J. Cancer, 70, 1126 (1994)] A találmány összefoglalása A találmány azon a felismerésen alapul, hogy polimercsoportok, például PEG, kötése antitesteredetû, variábilis egydoménes polipeptidekhez (domén antitestek, dab) hosszabb in vivo féléletidõt és proteolízissel szembeni fokozott ellenállást biztosít a dab aktivitásának vagy a célhoz való kötési affinitásának elvesztése nélkül. A találmány tárgyát képezik olyan, különbözõ formátumú dab molekulák, így dimerek, trimerek és tetramerek, amelyek egy vagy több polimermolekulához, például PEG-hez, vannak kapcsolva. A találmányt a mellékelt szabadalmi igénypontok 1. igénypontja szerinti legtágabb értelemben kell értelmezni. A találmány egyik megvalósítási módja szerint, a találmány tárgya az 1. igénypontban meghatározott, PEG-gel kapcsolt polipeptid, ahol a polipeptid féléletideje 1,3 és 70 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel nem kapcsolt polipeptidhez képest az ugyanolyan, de PEG-gel kapcsolt polipeptid aktivitásának legalább 90%¹át megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt polipeptid egy adott ligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis domén univerzális vázat tartalmaz. A találmány egy további megvalósítási módjában, az univerzális váz a DP47¹et, DP4¹öt és DP38¹at tartalmazó csoportból választott V H vázat tartalmaz; és/vagy a V L váz DPK9. A találmány tárgya továbbá az 1. igénypontban meghatározott, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amely TNF¹re specifikus antigénkötõ helyet tartalmaz, a polipeptid tartalmaz egy vagy két, antitesteredetû variábilis domént, amely variábilis domén(ek) mindegyikének van TNF¹et kötõ helye. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint a polipeptid 0 nm pm disszociációs konstanssal és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a polipeptid 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et. A találmány egy további megvalósítási módjában, a PEG-gel kapcsolt polipeptid univerzális vázat tartalmaz, ahol az univerzális váz a DP47¹et, DP4¹öt és DP38¹at tartalmazó csoportból választott V H vázat tartalmaz; és/vagy a V L váz DPK9. Továbbá, a találmány tárgya az 1. igénypontban meghatározott, PEG-gel kapcsolt polipeptid, amelynek féléletideje legalább 1,3 óra, és ahol a PEG közvetlenül vagy közvetetten az antitesteredetû, variábilis egydoménhez az antitesteredetû, variábilis egydomén cisztein vagy lizin aminosavához van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén egy elõre meghatározott helyén található. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydoménhez a PEG a variábilisrégió-eredetû vázban, az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ régióban lévõ cisztein vagy lizin aminosavnál van kapcsolva. 3

4 A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydoménhez a PEG a C¹ és/vagy N¹terminálistól legalább két aminosavtávolságra elhelyezkedõ cisztein vagy lizin aminosavhoz van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG a Gln13, Pro41, vagy Leu11 csoportból választott pozíciónál szubsztituált cisztein vagy lizin aminosavat tartalmazó, nehézlánc-eredetû variábilis doménhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminális csuklórégiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû egydomén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén nehézlánc-eredetû variábilis domén. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén könnyûlánc-eredetû variábilis domén (V L ). A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid féléletideje 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén X 1/2 ideje 0,2 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2, ideje 2 és óra közé esik. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely legalább 1,3 óra féléletidejû, antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt multimere és ahol a PEG a multimerhez a multimer cisztein vagy lizin aminosaván át kapcsolódik, és ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõhelye, és minden variábilis dolmén, mint a polipeptidben lévõ antitesteredetû, variábilis egydomén, köt antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta dimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta trimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta tetramer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav a multimer részét képezõ, antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének legalább egyikének egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk A találmány egyik megvalósítási módjában, a mutációval megváltoztatott aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén vázrégiójában van, az antitesteredetû, variábilis egydomének C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ helyen. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid nehézlánc-eredetû variábilis domén, és a mutációval megváltoztatott aminosav a Gln 13, Pro41 vagy Leu11 alkotta csoportból választott. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az antitesteredetû, variábilis egydoménekhez a C¹ és/vagy N¹terminálistól legalább két aminosavval távolabb elhelyezkedõ cisztein vagy lizin aminosavhoz van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2 ideje 0,2 és,8 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2 ideje 2 és óra közé esik. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének PEGgel kapcsolt multimer formájában lévõ polipeptid, amely két vagy több, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén, antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A multimer hidrodinamikai mérete legalább 0 kda. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimernek 3, 4,, 6, 7, vagy 8 antitesteredetû, variábilis egydoménje van. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt multimer féléletideje legalább 1,3 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2, ideje 0, és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2, ideje 2 és óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az antitesteredetû, variábilis egydomén alkotta trimerhez vagy tetramerhez, a multimer egyik variábilis doménjének vázrégiója által biztosított, elõre meghatározott cisztein vagy lizin aminosavnál kapcsolódik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav a multimer egyik, antitesteredetû, variábilis egydoménjének C¹terminálisán vagy N¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû egydomén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a mutációval megváltoztatott aminosav az antitesteredetû, va- 4

5 riábilis egydomén vázrégiójában van, az antitesteredetû, variábilis egydomének C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ helyen. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis domén nehézlánc-eredetû variábilis domén, és a mutációval megváltoztatott aminosav a Gln 13, Pro41 vagy Leu11 alkotta csoportból van kiválasztva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az antitesteredetû, variábilis egydoménekhez a C¹ vagy N¹terminálistól legalább két aminosav távolságra elhelyezkedõ cisztein vagy lizin aminosavnál van kapcsolva. Továbbá, a találmány tárgyát az 1. igénypontban meghatározott, TNF¹re specifikus kötõhelyet tartalmazó polipeptid képezi, amely polipeptid egy vagy több, antitesteredetû, variábilis domént tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden variábilis domén a polipeptidben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A polipeptid és kda közötti méretû PEG-polimerhez van kapcsolva. A polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 0 kda. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid t 1/2 féléletideje 0,2 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid t 1/2 féléletideje 2 és óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid variábilis domént tartalmaz, amely a variábilis domén cisztein vagy lizin aminosavánál lévõ PEG-csoporthoz van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, a variábilis domén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a mutációval megváltoztatott aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén vázrégiójában van, az antitesteredetû, variábilis egydomének C¹terminálisától vagy N¹terminálisától eltérõ helyen. A találmány egyik megvalósítási módjában, a variábilis domén nehézlánc-eredetû variábilis domén, és a mutációval megváltoztatott aminosav a Gln 13, Pro41 vagy Leu11 alkotta csoportból van kiválasztva. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta homomultimer formájában lévõ polipeptid, amely homomultimer hidrodinamikai mérete legalább 0 kda és féléletideje legalább 1,3 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden variábilis domén a homomultimerben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A homomultimer legalább egy PEG-polimerhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer t 1/2, féléletideje 0,2 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid t 1/2 féléletideje 1 és óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje vagy nehézlánc-eredetû variábilis domént vagy pedig V L ¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy az az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán további cisztein aminosavat tartalmazzon. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer antitesteredetû, variábilis egydoménjei peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a homodimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánceredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer specificitást mutat TNF¹re. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a homomultimer 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és 1 7 s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a homomultimer 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer antitesteredetû, variábilis egydoménje TNF¹et köt. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off -sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a homomultimer antitesteredetû, variábilis egydoménje 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének

6 alkotta heteromultimer formájában lévõ polipeptid, amely heteromultimer hidrodinamikai mérete legalább 0 kda és féléletideje legalább 1,3 óra, és minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden antitesteredetû, variábilis egydomén a heteromultimerben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A heteromultimer legalább egy PEG-polimerhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer féléletideje 1,3 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer t 1/2 féléletideje 0,2 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid t 1/2 féléletideje 2 és óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje vagy nehézlánc-eredetû variábilis domént vagy pedig V L ¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy az az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán további cisztein aminosavat tartalmazzon. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer antitesteredetû, variábilis egydoménjei peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a heterodimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a heterodimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánceredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer specificitást mutat TNF¹re. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározva, a heteromultimer 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a heteromultimer 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje specificitást mutat a TNF¹re. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározva, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, egy adott célligandumra specifikus antitesteredetû, variábilis egydomén formájában lévõ polipeptid, amely a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEGgel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménhez viszonyítva aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû egyetlen variábilis doménnek a célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén, a PEG-gel nem kapcsolt ugyanazon antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitásának legalább 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén TNF-hez való kötõdésének felszíni plazmonrezonanciával végzett mérésével határozzuk meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük standard sejtes vizsgálatban. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC 0 ¹ vagy ND 0 -értéke a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén IC 0 ¹ vagy ND 0 -értékét maximum %-kal haladja meg. A találmány tárgyát PEG-gel kapcsolt, egy adott célantigénre specifikus, antitesteredetû, variábilis egydomén is képezi, amely domén a célantigént 80 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köti. A találmány tárgyát PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén is képezi, amely a célantigént 3 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köti. A találmány tárgyát PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén is képezi, amely a célantigént 0 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köti. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval köt emberi TNF¹et. 6

7 A találmány egyik megvalósítási módjában, a kötést a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük standard sejtes vizsgálatban. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén standard sejtes vizsgálatban 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, egy adott célligandumra specifikus antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer formájában lévõ polipeptid, amely a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimerrel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménhez viszonyítva aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménes homomultimernek a célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt ugyanazon antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer aktivitásának 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimer TNF-hez való kötõdésével mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimernek az TNF¹re válaszként adott sejtcitotoxicitásra gyakorolt gátló képességének meghatározásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC 0 - értéke a PEG-gel nem kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer IC 0 -értékét maximum %-kal haladja meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden tagja vagy nehézlánc-eredetû variábilis domént vagy pedig V L ¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer olyan, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, amelyet úgy változtattunk meg, hogy az további cisztein aminosavat tartalmazzon az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer tagjai peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodimer elsõ tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és a homodimer második tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes heteromultimer formájában lévõ polipeptid, amely a PEG-gel nem kapcsolt ugyanazon antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimerhez képest aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt ugyanazon antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer aktivitásának 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes heteromultimer TNF-hez való kötõdésével mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer aktivitását a heteromultimernek az TNF¹re válaszként adott sejtcitotoxicitásra gyakorolt gátló képességének meghatározásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC 0 - értéke a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer IC 0 -értékét maximum %-kal haladja meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden tagja vagy nehézlánc-eredetû variábilis domént vagy pedig V L ¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden antitesteredetû, variábilis egydomént úgy változtatunk meg, hogy az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán vagy N¹terminálisán további cisztein aminosavat tartalmazzon. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer tagjai peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer csak egy elsõ és egy második tagot tartalmaz, ahol a heteromultimer elsõ tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és a homodimer második tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a fenti homo- vagy heteromultimer dimer, trimer vagy tetramer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a fenti homo- vagy heteromultimer PEG-csoportja elágazó PEG. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének PEGgel kapcsolt homomultimerének formájában lévõ polipeptid, amely 80 nm és pm közötti K d -értékkel köt egy adott cél antigént. 7

8 A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt homomultimerek 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval kötnek emberi TNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a kötést a PEG-gel kapcsolt homomultimer TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük standard sejtes vizsgálatban. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt homomultimer standard sejtes vizsgálatban 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt homomultimerje 3 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt homomultimerje 0 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 80 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 3 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 0 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány tárgyát az 1. igénypontban meghatározott, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid képezi, amely antitesteredetû, variábilis egydomén egy elõre meghatározott helyén lévõ, oldószer által elérhetõ, PEG-molekulához kapcsolt lizin aminosavat tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG, PEG-gel kapcsolt aktív N¹hidroxil-szukcimid-észter formájában kapcsolódik az oldószer által elérhetõ lizinhez. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktív N¹hidroxil-szukcimid-észtert az alábbi csoportból választjuk: PEG O CH 2 CH 2 CH 2 CO 2 NHS; PEG O CH 2 NHS; PEG O CH 2 CH 2 CO 2 NHS; PEG S CH 2 CH 2 CO NHS; PEG O 2 CNH CH (R) CO 2 NHS; PEG NHCO CH 2 CH 2 CO NHS; és PEG O CH 2 CO 2 NHS; ahol R jelentése ((CH 2 ) 4 )NHCO 2 (mpeg). A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG elágazó PEG. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely antitesteredetû, variábilis egydomén multimere, a multimer minden tagja legalább egy, oldószer által elérhetõ, PEG-molekulához kapcsolt lizin aminosavat tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, az oldószer által elérhetõ lizin aminosav a Gln13, Pro41 vagy Leu11 csoportból választott egy vagy több aminosav mutációjának eredménye. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer homomultimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer heteromultimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer hetero- vagy homomultimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer hetero- vagy homotatramer. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomén homovagy heterotrimer vagy tetramer polipeptid, amely legalább egy, oldószer által elérhetõ, PEG-molekulához kapcsolt cisztein aminosavat tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az oldószer által elérhetõ ciszteinhez az alábbi csoportból választott, szulfhidrilre szelektív reagenssel van kapcsolva: maleimid, vinil-szulfon és tiol. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû variábilis domén nehézlánc-eredetû variábilis domén, és az oldószer által elérhetõ cisztein aminosav az alábbi csoportból választott egy vagy több aminosav mutációjának eredménye: Gln13, Pro41 vagy Leu11. A találmány tárgya továbbá az 1. igénypontban meghatározott polipeptid, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû egy variábilis régiójú polipeptid formájában, amelynek féléletideje legalább hétszer hosszabb, mint az ugyanolyan, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû egyetlen variábilis régiójú polipeptidé. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, egyetlen variábilis régió hidrodinamikai mérete 24 kda és 00 kda közé esik. A találmány tárgya az 1. igénypontban meghatározott, PEG-gel kapcsolt polipeptidet és valamilyen hordozót tartalmazó gyógyászati készítmény. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény az 1. igénypontban meghatározott, legalább 1,3 óra féléletidejû és legalább 0 kda hidrodinamikai méretû, PEG-gel kapcsolt polipeptidet és valamilyen hordozót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény az 1. igénypontban meghatározott, antitesteredetû, variábilis egydomén heterotrimer vagy homotrimer vagy heterotetramer formájú polipeptidet tartalmaz, ahol minden variábilis domének van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén egyetlen variábilis doménként köt antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény az 1. igénypontban meghatározott, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, PEG-gel kapcsolt polipeptidet tartalmaz, ahol a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a gyógyászati készítmény egy adott állat gyomrába történt beadása után %-nál alacsonyabb mértékben bomlik le. Elõnyös, ha a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén az alábbi csoportból választott proteázzal való in vitro érintkeztetés esetén %-nál ki- 8

9 sebb mértékben bomlik le: pepszin, tripszin, elasztáz, kimotripszin, és karboxipeptidáz, ahol, amennyiben a proteáz pepszin, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén %-nál alacsonyabb mértékben bomlik le pepszin jelenlétében, ph=2,0-nál percig végzett inkubálás során, és ahol, amennyiben a proteáz tripszin, elasztáz, kimotripszin, vagy karboxipeptidáz a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén %-nál alacsonyabb mértékben bomlik le tripszin, elasztáz, kimotripszin, vagy karboxipeptidáz jelenlétében, ph=8,0-nál percig végzett inkubálás során. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény alkalmas orális beadásra vagy alkalmas az alábbi csoportból választott módon történõ parenterális beadásra: intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális injekció, implantáció, rektális és transzdermális beadás. A találmány egyik megvalósítási módjában, a gyógyászati készítmény hosszan tartó felszabadulást biztosító parenterális vagy orális dozírozású készítmény. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû egydomén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén nehézlánc-eredetû variábilis domén (V H ). A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomén könnyûlánc-eredetû variábilis domén (V L ). A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,2 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polimerrel kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2, ideje 0,2 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polimerrel kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2 ideje 2 és óra közé esik. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti polipeptid, amely legalább 0,2 óra féléletidejû, antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt multimere, és ahol a PEG a multimerhez a multimer cisztein vagy lizin aminosaván át kapcsolódik, és ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõhelye, és minden variábilis domén, mint a multimerben lévõ antitesteredetû, variábilis egydomén, köt antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta dimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta trimer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta tetramer. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav a multimer részét képezõ, antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, egyetlen domének legalább egyikének egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,2 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2 ideje 0,2 és,8 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2 ideje 2 és óra közé esik. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének PEGgel kapcsolt mutlimere formájában lévõ polipeptid, amely két vagy több, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a variábilis doménnek van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén, antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A PEG-gel kapcsolt multimer hidrodinamikai mérete legalább 0 kda. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimernek 3, 4,, 6, 7, vagy 8 antitesteredetû, variábilis egydoménje van. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt multimer féléletideje legalább 0,2 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,2 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén ava ideje 0, és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén t 1/2 ideje 2 és óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEG az antitesteredetû, variábilis-egydoménes trimerhez vagy tetramerhez, a multimer variábilis doménje által biztosított, elõre meghatározott cisztein vagy lizin aminosavnál kapcsolódik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav a multimer részét képezõ, antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû egydomén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antigénkötõ helyet tartalmazó polipeptid, amely polipeptid egy vagy több antitesteredetû, variábilis domént tartalmaz, ahol a polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 0 kda és féléletidje legalább 0,2 óra, ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén a polipeptidben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid tartalmaz TNF¹re specifikus kötõhelyet, a poli- 9

10 peptid tartalmaz egy vagy több, antitesteredetû, variábilis egydomént, ahol polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 0 kda és féléletidje legalább 0,2 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden variábilis domén a polipeptidben lévõ antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A polipeptid és kda közötti méretû PEG-polimerhez van kapcsolva. A polipeptid hidrodinamikai mérete legalább 0 kda. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,2 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid t 1/2 féléletideje 0,2 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid t 1/2 féléletideje 2 és óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid variábilis domént tartalmaz, amely a variábilis domén cisztein vagy lizin aminosavánál lévõ PEG-csoporthoz van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a cisztein vagy lizin aminosav az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán található. A találmány egyik megvalósítási módjában, a variábilis domén egy vagy több elõre meghatározott aminosavát mutációval cisztein vagy lizin aminosavra változtatjuk, és a PEG¹et a mutációval megváltoztatott aminosavhoz kapcsoljuk. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta homomultimer formájában lévõ polipeptid, amely homomultimer hidrodinamikai mérete legalább 0 kda és féléletideje legalább 0,2 óra. A találmány egyik megvalósítási módjában, minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye, és minden variábilis domén a homomultimerben lévõ antitesteredetû, variábilis egydomén ként köt antigént. A homomultimer legalább egy PEG-polimerhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,2 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer t 1/2, féléletideje 0,2 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid t 1/2 féléletideje 2 és óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje vagy V H ¹t vagy pedig V L ¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy az az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán további cisztein aminosavat tartalmazzon. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer antitesteredetû, variábilis egydoménjei peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a homodimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánceredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer specificitást mutat TNF¹ra. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a homomultimer 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a homomultimer 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje TNF¹et köt. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének alkotta heteromultimer formájában lévõ polipeptid, ahol a heteromultimer hidrodinamikai mérete legalább 0 kda és féléletideje legalább 0,2 óra, és ahol minden variábilis doménnek van antigénkötõ helye és minden antitesteredetû, variábilis egydomén a heteromultimerben lévõ, antitesteredetû, variábilis egydoménként köt antigént. A heteromultimer legalább egy PEG-polimerhez van kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a féléletidõ 0,2 és 170 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer t 1/2 féléletideje 0,2 és 6 óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a polipeptid t 1/2, féléletideje 2 és óra közé esik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje vagy V H ¹t vagy pedig V L ¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy további cisztein aminosavat tartalmazzon az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer antitesteredetû, variábilis egydoménjei peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva.

11 A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a heteromultimer elsõ antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és ahol a heteromultimer második antitesteredetû, variábilis egydoménje antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer specificitást mutat TNF¹re. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a heteromultimer 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a heteromultimer 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje TNF¹re specificitást mutat. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatárva, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban, a heteromultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménje 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, egy adott célligandumra specifikus antitesteredetû, variábilis egydomén formájában lévõ polipeptid, amely a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEGgel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménhez viszonyítva aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû egyetlen variábilis doménnek a célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitásának legalább 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén TNF-hez való kötõdésének felszíni plazmonrezonanciával végzett mérésével határozzuk meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval disszociál le az emberi TNF-rõl. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást standard sejtes vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén standard sejtes vizsgálatban 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC 0 vagy ND 0 -értéke a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén IC 0 ¹ vagy ND 0 -értékét maximum %-kal haladja meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, egy adott célantigénre specifikus, antitesteredetû, variábilis egydomén a célantigént 80 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köti. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 3 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 0 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval köt emberi TNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a kötést standard sejtes vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességeként mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén standard sejtes vizsgálatban 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimer formájában lévõ polipeptid, amely a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydoménhez viszonyítva aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimernek egy adott célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer aktivitásának 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimer TNF-hez való kötõdésével mérjük. 11

12 A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes homomultimernek, az TNF¹re válaszként adott sejtcitotoxicitásra gyakorolt gátló képességének meghatározásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC 0 - értéke a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes homomultimer IC 0 -értékét maximum %-kal haladja meg. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden tagja vagy V H ¹t vagy pedig V L ¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer olyan, antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, amelyet úgy változtattunk meg, hogy az további cisztein aminosavat tartalmazzon antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer tagjai peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a homodimer elsõ tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánc-eredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és a homodimer második tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes heteromultimer formájában lévõ polipeptid, amely a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimerhez viszonyítva aktivitását megtartja, ahol az aktivitást a PEG-gel kapcsolt vagy PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimernek egy adott célligandummal szembeni affinitásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer aktivitásának 90%¹át megtartja. A találmány egyik megvalósítási módjában, az aktivitást a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilisegydoménes heteromultimer TNF-hez való kötõdésével mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer aktivitását a heteromultimernek az TNF¹re válaszként adott sejtcitotoxicitásra gyakorolt gátló képességének meghatározásával mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén IC 0 - értéke a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis-egydoménes heteromultimer IC 0 -értékét maximum %-kal haladja meg A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer minden tagja vagy V H ¹t vagy pedig V L ¹t tartalmaz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a homomultimer minden antitesteredetû, variábilis egydoménjét úgy változtatjuk meg, hogy további cisztein aminosavat tartalmazzon az antitesteredetû, variábilis egydomén C¹terminálisán. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heteromultimer tagjai peptidlinkerrel vannak egymáshoz kapcsolva. A találmány egyik megvalósítási módjában, a multimer csak egy elsõ és egy második antitesteredetû, variábilis egydomént tartalmaz, ahol a heteromultimer elsõ tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és nehézlánceredetû (CH1) konstans régiót tartalmaz, és a homodimer második tagja antitesteredetû, variábilis egydomént és könnyûlánc-eredetû (CL) konstans régiót tartalmaz. A találmány tárgyát képezi továbbá, az 1. igénypont szerinti, antitesteredetû, variábilis egydomének PEGgel kapcsolt homomultimerének formájában lévõ polipeptid, amely 80 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott cél antigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, felszíni plazmonrezonanciás méréssel meghatározottak szerint, a PEG-gel kapcsolt homomultimer 0 nm és pm közötti disszociációs konstanssal (K d ) és s 1 K off sebességi állandóval köt emberi TNF¹et. A találmány egyik megvalósítási módjában, a kötést standard sejtes vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt homomultimer TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort semlegesítõ képességként mérjük. A találmány egyik megvalósítási módjában, standard sejtes vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt homomultimer 00 nm és 0 pm közötti ND 0 -értékkel neutralizál emberi TNF¹et vagy 1¹es TNF-receptort. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt homomultimerje 3 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt homomultimerje 0 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 80 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 3 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. A találmány egyik megvalósítási módjában, az antitesteredetû, variábilis egydomének PEG-gel kapcsolt heteromultimerje 0 nm és pm közötti K d -értékkel specifikusan köt egy adott célantigént. Meghatározások A leírás szerinti értelemben, a domén kifejezés olyan feltekert fehérjeszerkezetet jelent, amely tercier 12

13 szerkezetét a fehérje többi részétõl függetlenül megtartja. Általában, domének felelõsek a fehérjék különálló funkcionális tulajdonságaiért, és sok esetben hozzáadhatók, eltávolíthatók vagy egy másik fehérjébe átvihetõk a fehérje maradéka és/vagy a domén mûködésének elvesztése nélkül. Az antitesteredetû, variábilis egydomén kifejezés olyan feltekert polipeptiddomént jelent, amely immunglobulin-eredetû variábilis doménekre jellemzõ szekvenciákat tartalmaz és amely specifikusan (azaz, a 1 mm vagy annál kevesebb disszociációs konstanssal) köt egy adott antigént, amely variábilis egydoménként, azaz bármilyen komplementer variábilis domén nélkül, köt antigént. Ennélfogva, az antitesteredetû, variábilis egydomén kifejezés magában foglal teljesen antitesteredetû variábilis doméneket és módosított variábilis doméneket például olyanokat, amelyekben egy vagy több hurok antitesteredetû variábilis doménekre nem jellemzõ szekvenciákra lett cserélve vagy csonkolt vagy N¹, illetve C¹terminális kiterjesztést tartalmazó, antitesteredetû variábilis doméneket, továbbá variábilis doménekbõl származó, olyan feltekert fragmentumokat, amelyek megtartják 00 nm vagy kevesebb (például, nm vagy kevesebb, 0 nm vagy kevesebb, nm vagy kevesebb, 0 nm vagy kevesebb, nm vagy kevesebb, 0 nm vagy kevesebb, nm vagy kevesebb, 0 nm vagy kevesebb) disszociációs konstansukat és a teljes hosszúságú domén, célantigénnel szembeni specificitását. Elõnyös, ha a találmány szerinti megoldásban alkalmazható antitesteredetû, variábilis egydomén az alábbi csoportból választott: V H és V L, így V és V. A találmány szerint, a megoldásban leírt, V H -doméneket hasznosító eljárások és készítmények képesek hasznosítani tevefélékbõl származó VHH-doméneket. Antitesteredetû, variábilis egydoméneket leírtak már a technika állása szerint, így azok ismertek [például Ward és munkatársai, Nature 341, 44 6 (1989), amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi]. Az antitesteredetû, variábilis egydomén kifejezésbe nem csak izolált, antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid, hanem egy adott antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidszekvencia egy vagy több monomerjét tartalmazó, nagyobb polipeptidek is tartoznak. A leírás szerinti értelemben, egy doménantitest vagy dab egyenértékû egy antitesteredetû, variábilis egydomén polipeptiddel. A leírás szerinti értelemben, az antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid emlõseredetû, elõnyösen emberi de magában foglalja a rágcsálókból származó (például, a WO 00/29004 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint, amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi) egyetlen immunglobulin-eredetû variábilis-doménes polipeptidet vagy a tevefélékbõl származó V HH dab-okat. A tevefélékbõl származó dab¹ok olyan antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek, amelyek a teve, láma, alpakka, dromedár és guanakó alkotta csoportból származó fajokból származnak és nehézlánc-eredetû, könnyûlánc nélküli antitesteket tartalmaznak: V HH.AV HH -molekulák az IgGmolekuláknál körülbelül tízszer kisebbek, és egyedülálló polipeptidekként rendkívül stabilak, extrém ph¹nak és hõmérsékleti körülményeknek is ellenállnak. Továbbá, a tevefélék antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidjei a proteázok hatásának ellenállnak. Tevefélékbõl származó antitestek vannak leírva, például, az US ; ; 8 26; ; ; és számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban, amely publikációk teljes egészében a kitanítás részét képezik. A találmány szerint alkalmas, tevefélékbõl származó, V HH antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek közé tartozik a tevefélékbõl származó antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek azon osztálya, amelyben az emberéhez hasonló szekvenciák vannak, ahol az osztályt az jellemzi, hogy a VHH-domén a Kabat-féle számozás szerinti 4. pozícióban a glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenil-alanin, tirozin, triptofán, metionin, szerin, treonin, aszparagin, és glutamin alkotta csoport bármelyik aminosavat, mint például L4, és a 3. pozícióban pedig triptofánt tartalmaz. Humanizált, tevékbõl származó V HH polipeptidek ismertek, például a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi iratból (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi). A szakember számára egyértelmû, hogy a természetes körülmények között elõforduló, tevefélékbõl származó antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidek a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi irat (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi) kitanításai szerint módosíthatók humanizált, tevékbõl származó VHH polipeptidek elõállítása céljából. A leírás szerinti értelemben, az antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid, antitesteredetû, variábilis egydomén, egyetlen, antitesteredetû variábilis domén és immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén kifejezéseket egymással egyenértékûnek tekintjük. A leírás szerinti értelemben, az immunglobulin-eredetû variábilis doménekre jellemzõ szekvencia kifejezés feletti vagy több, 2 vagy több, vagy több, 3 vagy több, vagy több, 4 vagy több, vagy akár 0 vagy több, egymással érintkezõ aminosavból álló, immunglobulin-eredetû variábilis domén szekvenciával homológ aminosavszekvenciát jelent. A leírás szerinti értelemben, a kapcsolt kifejezés a PEG-polimercsoportnak a találmány szerinti, antitesteredetû variábilis egydomén vagy variábilis-egydoménes polipeptid egyik aminosavához való kapcsolását jelenti. Egy adott PEG-polimer egy adott dab vagy polipeptid aminosavához való kapcsolását PEG-ezésnek nevezzük, és ez elérhetõ a PEG kapcsolására szolgáló különféle csoportok, így például minden korlátozás nélkül N¹hidroxil-szukcinimid (NHS) aktív észter, szukcinimidil-propionate (SPA), maleimid (MAL), vinilszulfon (VSZ), vagy tiol, révén. PEG-polimer egy elõre meghatározott pozíciónál kapcsolható egy dab-polipeptidhez vagy véletlenszerûen kapcsolható a dabmolekulához. Elõnyös, azonban, ha a PEG-polimert 13

14 elõre meghatározott pozíciónál kapcsoljuk egy dabhez vagy polipeptidhez. PEG-polimert kapcsolhatunk a dab-ban vagy polipeptidben lévõ bármelyik aminosavhoz, azonban elõnyös, ha a polimer kapcsolása a dabban vagy polipeptidben természetesen elõforduló lizinhez vagy ciszteinhez, vagy a dab¹ba vagy polipeptidbe génsebészeti úton, például, a dab-ban természetes körülmények között elõforduló aminosav vagy ciszteinre vagy pedig lizinre történõ mutagenezisével, beépített lizinhez vagy ciszteinhez történik. A leírás szerinti értelemben, a kapcsolt kifejezés két vagy több, antitesteredetû, variábilis-doménes polipeptidbõl származó monomer összekapcsolódását jelenti dimer, trimer, tetramer vagy más multimer formává. dab monomerek a technikában ismert több eljárással így, minden korlátozás nélkül, a dab monomerek fúziós fehérjeként történõ expressziója, két vagy több monomer összekapcsolása monomerek közötti peptidlinker révén, vagy a transzláció után, a monomerek közvetlenül vagy linker révén diszulfidkötésekkel egymáshoz való kémiai kapcsolásával, vagy di¹, tri- vagy multivalens csoportok (például, többágú PEG) kapcsolásával kapcsolhatók össze multimerré. A leírás szerinti értelemben, egy adott antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptidhez közvetlenül kapcsolt polimer vonatkozásában alkalmazott közvetlenül kapcsolt kifejezés olyan helyzetet jelent, amelyben a polimer egy adott (természetes eredetû, vagy génsebészettel megváltoztatott) a variábilis domén részét képzõ például, nem a konstans régióban, csuklórégióban vagy linkerpeptidben lévõ aminosavhoz van csatlakoztatva. Viszont, a leírás szerinti értelemben, egy adott antitesteredetû, variábilis egydoménhez való közvetetten kapcsolás kifejezés egy adott polimermolekula valamely antitesteredetû, variábilis egydoménhez való kapcsolását jelenti, ahol a polimermolekula nincs olyan aminosavhoz kapcsolva, amely a variábilis régió részét képezné (például, a csuklórégióhoz köthetõ). Egy adott polimer akkor van közvetetten kapcsolva, ha az likerpeptiden át van a variábilis egydoménhez kapcsolva, vagyis a polimer nincs olyan aminosavhoz csatlakoztatva, amely önmagában az antitesteredetû, variábilis egydomén részét képezi. Esetleg, egy adott polimer közvetetten kapcsolódik valamely antitesteredetû, variábilis egydoménhez, ha a polimer a variábilis egydomén C¹terminális csuklórégiójához, vagy az antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid részeként jelen levõ konstans régió bármelyik aminosavához van kapcsolva. A leírás szerinti értelemben, a homológia vagy hasonlóság vagy azonosság kifejezések arra utalnak, hogy két nukleotid- vagy aminosavszekvencia szerkezetileg milyen mértékben hasonlítanak egymásra. A találmány szerinti homológ szekvencia lehet az aminosavak addíciójával, deléciójával vagy szubsztitúciójával módosított polipeptid, ahol a módosítás lényegében nem változtatta meg a mûködési jellemzõket a nem módosított polipeptidével összehasonlítva. Ahol a találmány szerinti antitesteredetû, variábilisegydoménes polipeptid tevefélékbõl származó polipeptid, a találmány szerinti homológ szekvencia lehet más Camelidae fajban, például, tevében, dromedárban, lámában, alpakkában vagy guanakóban létezõ szekvencia. A leírás szerinti értelemben, a szekvencia hasonlóság kifejezés arra utal, hogy a rendezett szekvenciák esetén az aminosavszekvenciák milyen mértékben tartalmaznak hasonló aminosavakat a megfelelõ pozíciókban. Aminosavak akkor hasonlítanak egymásra, ha oldalláncaik hasonlóak. A hasonlóság elsõsorban olyan aminosavakra vonatkozik, amelyek egymásra való cseréje konzervatív szubsztitúciónak számít. Konzervatív szubtitúciónak számít minden olyan szubsztitíció, amely a blosum62 substitution mátrixban pozitív pontszámú [Hentikoff és Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, (1992)]. A leírás szerinti értelemben, az A szekvencia n%¹ban hasonlít a B szekvenciához kijelentés azt jelenti, hogy az A és B szekvenciák optimális globális egyeztetése esetén a pozíciók n%¹ában azonos aminosavak vagy konzervatív szubsztitúciók vannak. Optimális egyeztetés elvégezhetõ a Needleman Wunsch egyeztetési algoritmusban az alábbi paraméterek alkalmazásával: Polipeptidekre Szubsztitúciós mátrix: blosum62. Réspontozási funkció (Gap scoring function): A B*LG, ahol A=11 [a rés büntetõpontja (the gap penalty)], B=1 [a réshossz büntetõpontja (the gap length penalty) és LG a réshossz (the length of the gap)]. Nukleotidszekvenciákra Szubsztitúciós mátrix: az egyezésekre, 0 a nem egyezésekre. Réspontozási funkció (Gap scoring fiinction): A B*LG, ahol A=0 [a rés büntetõpontja (the gap penalty)], B=3 [a réshossz büntetõpontja (the gap length penalty)] és LG a réshossz (the length of the gap). Jellemzõ konzervatív szubsztitúciók a Met, Val, Leu és Ile; a Ser és Thr; az Asp, Glu és Asn; a Gln, Lys és Arg; vagy az aromás Phe és Tyr aminosavak közötti szubsztitúciók. A leírás szerinti értelemben, két szekvencia akkor homológ egymással vagy hasonlít egymáshoz, ha a Needleman-Wunsch algoritmus vagy a Tatusova és Madden által leírt BLAST 2 sequences algoritmus [Tatusova és Madden, FEMS Microbiol Lett. 174, 247 (1999)] alkalmazásával végzett egyeztetéskor a szekvenciák vonatkozásában legalább 8%- ban hasonlítanak egymásra. Aminosavszekvenciák BLAST 2 sequences algorithm alkalmazásával végzett egyeztetésekor a Blosum 62 mátrix az alapértelmezett mátrix. A leírás szerinti értelemben, az alacsony sztringenciájú, közepes sztringenciájú, magas sztringenciájú vagy nagyon magas sztringenciájú körülmények kifejezések nukleinsavhibridizációs és ¹mosási körülményeket írnak le. Hibridizációs reakciók elvégzésére szolgáló útmutatások a Current Protocols in 14

15 Molecular Biology [Current Protocols in Molecular Biology, kiad.: John Wiley & Sons, N. Y. (1989)] címû könyvben találhatók (amely publikáció teljes egészében a kitanítás részét képezi). A hivatkozott publikációban leírt vizes és nem vizes eljárások egyaránt alkalmazhatók. A leírásban megadott specifikus hibridizációs körülmények az alábbiak: (1) alacsony sztringenciájú körülmények: hibridizálás 6 nátrium-klorid/nátrium-citrát (SSC) oldatban körülbelül 4 C¹on, majd két mosás 0,2 SSC, 0,1% SDS-tartalmú oldatban legalább 0 C¹on (alacsony sztringenciájú körülmények esetén, a mosások hõmérséklete C¹ra növelhetõ); (2) közepes sztringenciájú körülmények: hibridizálás 6 SSC-ben körülbelül 4 C¹on, majd egy vagy több mosás 0,2 SSC, 0,1% SDS-tartalmú oldatban C¹on; (3) magas sztringenciájú körülmények: hibridizálás 6 SSC-ben körülbelül 4 C¹on, majd egy vagy több mosás 0,2 SSC, 0,1% SDS-tartalmú oldatban 6 C¹on; és elõnyösen (4) nagyon magas sztringenciájú körülmények: hibridizálás 0, M nátrium-foszfát/7% SDS-tartalmú oldatban 6 C¹on, majd egy vagy több mosás 0,2 SSC, 0,1% SDS-tartalmú oldatban 6 C¹on. A leírás szerinti értelemben, a specifikusan köti kifejezés egy antigénnek egy antigéneredetû, variábilis egydoménhez, 1 mm vagy annál alacsonyabb disszociációs konstanssal (K d ) való kötõdését jelenti, ahol a kötõdést felszíni plazmonrezonanciával mérjük, például, BiaCore felszíni plazmonrezonanciás rendszer és BiaCore kinetikai értékelõ szoftverrel (például, 2.1 verzió) alkalmazásával. Specifikus kölcsönhatás esetén az affinitás vagy K d elõnyösen körülbelül 00 nm vagy alacsonyabb, elõnyösen körülbelül 0 nm, elõnyösen körülbelül 0 nm vagy alacsonyabb, még elõnyösebben körülbelül 80 nm vagy alacsonyabb, és elõnyösen akár pm. A leírás szerinti értelemben, a magas affinitású kötõdés kifejezés olyan kötõdést jelent, amelynek K d ¹je 0 nm¹al egyenlõ vagy annál alacsonyabb. A leírás szerinti értelemben, a koncentrációnál kifejezés egy adott oldatban (elõnyösen vizes oldatban) a megadott tömegben vagy térfogategységre megadott moláris mennyiségben oldott polipeptidet jelent, és így a kifejezés magában foglalja a moláris koncentrációt és a tömeg/térfogat százalékot. Egy adott X koncentrációban vagy legalább X koncentrációban jelen lévõ polipeptid kifejezés nem a polipeptid szárított vagy kristályos készítményeire nem vonatkozik. A leírás szerinti értelemben, a repertoár kifejezés sokféle változat például nukleotidszekvencia tekintetében különbözõ nukleinsavváltozatok vagy aminosavszekvencia tekintetében különbözõ polipeptidváltozatok gyûjteményét jelenti. A találmány szerinti könyvtár polipeptidek vagy nukleinsavak repertoárját tartalmazza. A találmány szerint, egy adott generikus ligandum számára kötõhelyet és egy adott célligandum számára kötõhelyet tartalmazó polipeptidrepertoárt terveztünk. A kötõhelyek egymást átfedhetik, vagy lehetnek a molekula ugyanazon régiójában, de specifikusságuk eltérõ. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott könyvtár legalább 00 tagot tartalmazó polipeptidrepertoár. A leírás szerinti értelemben, a könyvtár kifejezés heterogén polipeptidek vagy nukleinsavak keverékét jelenti. A könyvtár olyan tagokból áll, amelyek mindegyikének egyetlen polipeptid- vagy nukleinsavszekvenciája van. Ebben az értelemben, a könyvtár és a repertoár jelentése azonos. A könyvtár tagjai közötti szekvenciakülönbségek felelõsek a könyvtárban fennálló változatosságért. A könyvtár lehet polipeptidek vagy nukleinsavak egyszerû keverékének formájában, vagy lehet nukleinsavkönyvtárral transzformált szervezetek vagy sejtek például, baktériumok, vírusok, állati vagy növényi sejtek és hasonlók formájában. Elõnyös, ha minden egyedi organizmus vagy sejt csak egyetlen vagy korlátozott számú könyvtártagot tartalmaz. A nukleinsavak által kódolt polipeptidek expressziójának biztosítása céljából elõnyös, ha a nukleinsavak expressziós vektorokba vannak beépítve. A találmány egy elõnyös szempontja szerint, egy adott könyvtár lehet gazdaszervezetek populációjának formájában, ahol minden organizmus a könyvtár egyetlen tagját tartalmazó expressziós vektor egy vagy több kópiáját tartalmazza olyan nukleinsav formájában, amely a megfelelõ polipeptidtag elõállítása végett expresszálható. Eszerint, a gazdaszervezetek populációja potenciálisan képes arra, hogy genetikailag sokféle polipeptidváltozat hatalmas repertoárját kódolja. A leírás szerinti értelemben, a polimer ismétlõdõ monomeregységekbõl készült makromolekula, és a kifejezés jelenthet szintetikus vagy természetes körülmények között elõforduló polimert, mint például adott esetben szubsztituált egyenes vagy elágazó láncú polialkilént, polialkenilént, vagy polioxi-alkilén-polimert vagy elágazó vagy el nem ágazó poliszacharidot. A leírás szerinti értelemben, a polimer kifejezés jelentése elõnyösen poli(etilénglikol), polipropilénglikol vagy poli(vinil-alkohol) vagy ezek származéka, amelyek adott esetben szubsztituáltak. A leírás szerinti értelemben, a PEG vagy PEGpolimer polietilénglikolt jelent, illetve konkrétabban jelenthet derivatizált PEG¹et, ideértve minden korlátozás nélkül a PEG N¹hidroxiszukcinimid (NHS) aktív észtereit, mint amilyenek például az alábbiak: szukcinimidil-propionát, benzo-triazol aktív észterek, maleimiddel, vinil-szulfonokkal vagy tiolcsoportokkal derivatizált PEG. Konkrét PEG-készítmények közé tartozhatnak az alábbiak: PEG O CH 2 CH 2 CH 2 CO 2 NHS; PEG O CH 2 NHS; PEG O CH 2 CH 2 CO 2 NHS; PEG S CH 2 CH 2 CO NHS; PEG O 2 CNH CH (R) CO 2 NHS; PEG NHCO CH 2 CH 2 CO NHS; és PEG O CH 2 CO 2 NHS; ahol R jelentése ((CH 2 ) 4 )NHCO 2 (mpeg). A találmány szerinti megoldásban alkalmazható PEG-molekulák lehetnek olyan lineáris molekulák vagy lehetnek elágazók, ahol egyetlen polimerben több PEG-csoport van jelen. A találmány szerinti megoldásban különösen elõnyös PEGkonformációk közé tartoznak minden korlátozás nélkül az alábbiak: 1

16 ; ; mpeg-mal m PEG2-MAL ; ; mpeg-(mal) 2 multi-arm PEG ; mpeg2-(mal) 2 ;és mpeg-spa mpeg2-nhs A leírás szerinti értelemben, a szulfhidrilszelektív reagens olyan reagens, amely alkalmas a PEG-polimer tioltartalmú aminosavhoz való kapcsolására. A cisztein aminosavon lévõ tiolcsoportok szulfidrilszelektív reagenssel való kölcsönhatásra különösen alkalmasak. A találmány szerinti megoldásban alkalmazha- 16

17 tó szulfhidrilszelektív reagensek közé tartozik minden korlátozás nélkül a maleimid, vinil-szulfon és tiol. A szulfhidrilszelektív regensek cisztein aminosavakhoz való kapcsolásra történõ alkalmazása a technikában ismert, és a találmány szerinti megoldásban szükség szerint adaptálható [lásd például Zalipsky, Bioconjug. Chem. 6, (199); Greenwald és munkatársai, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17, 1 (00); Herman és munkatársai, Macromol. Chem. Phys. 19, 3 (1994)]. A leírás szerinti értelemben, egy adott antigén valamilyen antitest antitest- vagy kötõrégiójához (például, variábilis doménhez) kötõdik. Jellemzõ, hogy az antigének képesek antitestválaszt kiváltani in vivo. Az antigén lehet peptid, polipeptid, fehérje, nukleinsav, lipid, szénhidrát vagy más molekula, és több alegységes molekulák is lehetnek antigének. Általában, immunglobulin-eredetû variábilis doméneket egy adott antigén ellen mutatott célspecificitás alapján válogatunk ki. A leírás szerinti értelemben, az epitóp kifejezés egy adott antitesteredetû szerkezeti egységet jelent, amelyet hagyományosan egy pár variábilis egydomén, av H /V L pár köt. Epitópok határozzák meg a minimális kötõhelyet is egy adott antitest számára, és így célt képeznek a kérdéses antitest specifitása tekintetében. Antitesteredetû variábilis egydomének esetében egy adott epitóp felel meg izolált variábilis domén által kötött szerkezeti egységnek. A leírás szerinti értelemben, a leírtak szerint az antitesteredetû, variábilis egydoménnel kapcsolatban alkalmazott semlegesítõ kifejezés azt jelenti, hogy a polipeptid megzavarja (például, teljesen vagy részlegesen elnyomja vagy eltörli) a célantigén valamely mérhetõ aktivitását vagy funkcióját. Egy adott polipeptidet akkor tekintünk semlegesítõ polipeptidnek, ha a célantigén mérhetõ aktivitását vagy funkcióját legalább 0%-ban és elõnyösen legalább %, 70%, 80%, 90%, 9%-ban vagy annál nagyobb arányban csökkenti, és akár egészen 0%¹os mértékben gátolja (azaz, a célantigénnek nincs kimutatható hatása vagy funkciója). A célantigén ezen mérhetõ aktivitásának vagy funkciójának csökkenését a szakember, az ilyen aktivitás vagy funkció egy vagy több indikátorának mérésére szolgáló standard eljárások alkalmazásával meg tudja határozni. Például, amennyiben a cél TNF, a semlegesítõ aktivitás meghatározható a standard L929 sejtölési vizsgálattal vagy annak mérésével, hogy antitesteredetû, variábilis-egydoménes polipeptid képes¹e gátolni az ELAM 1 TNF által indukált expresszióját a HUVEC¹en (amely vizsgálat az TNF által indukált sejtaktiválást méri). A leírás szerinti értelemben, a semlegesítõ kifejezéssel analóg módon alkalmazott gátolja a sejtcitotoxicitást kifejezés a sejthalálban bekövetkezõ például standard L929 sejtölési vizsgálat alkalmazásával mért csökkenésre utal, ahol a sejtcitotoxicitás gátlására akkor kerül sor, ha a sejthalált legalább %-ban vagy annál nagyobb mértékben sikerül csökkenteni. A leírás szerinti értelemben, egy adott célantigén mérhetõ aktivitása vagy funkciója kifejezés minden korlátozás nélkül például sejt-jelátvitelt, enzimaktivitást, kötõaktivitást, ligandumtól függõ internalizációt, sejtölést, sejtaktiválást, sejttúlélés elõsegítését és génexpressziót foglal magában. A szakember képes olyan vizsgálatokat végezni, amely méri az ilyen aktivitásokat egy adott célantigénre nézve. Elõnyös, ha a leírás szerinti értelemben az aktivitás ¹t (1) sejteken alpuló vizsgálatban végzett ND 0 -érték; (2) egy adott célligandummal szembeni affinitás, (3) ELISA-kötõdés, vagy (4) receptorkötési vizsgálat határozza meg. Az ilyen tesztek elvégzésére szolgáló eljárásokat a szakember ismeri és azok az alábbiakban részletes leírásra kerülnek. A leírás szerinti értelemben, a dab aktivitás vagy antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitás kifejezés az antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid antigénkötõ képességét jelenti. A leírás szerinti értelemben, az aktivitását megtartja kifejezés a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid aktivitási szintjére utal, amely a PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid aktivitási szintjének legalább %¹a, elõnyösen legalább %, %, %, 0%, %, 70%, 80%¹a és akár 90%¹a, elõnyösen akár 9%, 98%¹a, és a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménben vagy polipeptidben lévõvel megegyezõ variábilis domént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid aktivitásának akár 0%¹a, ahol az aktivitás mérése a fentiekben leírtak szerint történik. Elõnyösebben, a PEGgel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménnek vagy polipeptidnek a PEG-gel nem kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménhez vagy polipeptidhez viszonyított aktivitását antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid olyan moláris mennyiségével kell meghatározni, ahol minden vizsgálatban a PEG-gel kapcsolt és PEG-gel nem kapcsolt antitesteredetû, variábilis egydomének mólszámának meg kell egyeznie, és ahol az egyes vizsgálatokban minden más körülménynek azonosnak kell lenniük. Annak meghatározására, hogy egy konkrét, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén megtartja aktivitását vagy sem, elõnyös, ha a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitását ugyanazon antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitásával határozzuk meg, PEG hiányában. A leírás szerinti értelemben, a specifikusan köti kifejezés egy antigénnek egy immunglobulin-eredetû, variábilis doménhez vagy polipeptidhez, 1 mm vagy annál alacsonyabb disszociációs konstanssal (K d ) való kötõdését jelenti, ahol a kötõdést felszíni plazmonrezonanciával mérjük, például, BiaCore felszíni plazmonrezonanciás rendszer és BiaCore kinetikai értékelõ szoftverrel (például, 2.1 verzió) alkalmazásával. Specifikus kötési kölcsönhatás esetén az affinitás vagy K d elõnyösen körülbelül 1 mm vagy alacsonyabb, elõnyösen 00 nm vagy alacsonyabb, elõnyösen körülbelül 0 nm, még elõnyösebben körülbelül 80 nm vagy alacsonyabb, és elõnyösen akár pm. A leírás szerinti értelemben, a heterodimer, heterotrimer, heterotetramer, és heteromultimer kifeje- 17

18 zések két vagy több, különbözõ immunglobulin-eredetû variábilis-egydoménes polipeptidszekvencia két, három vagy több (például, négy, öt, hat, hét vagy akár nyolc, sõt annál több) monomerjeit tartalmazó molekulákat (megfelelõen) jelentik. Például egy adott heterodimerben lehet két V H -szekvencia, például V H1 és V H2, vagy V HH1 és V HH2, vagy esetleg tartalmazhat V H és V L kombinációt. A homodimerhez, ¹trimerhez vagy tetramerhez hasonlóan, egy adott heterodimer, heterotrimer, heterotetramer, vagy heteromultimer monomerjei összekapcsolhatók fúziós fehérjeként történõ expresszálással, például monomerek közötti peptidlinkerrel, vagy transzláció után a monomerek kémiai úton közvetlenül vagy közvetetten vagy linker például, diszulfidkötéssel vagy di¹, tri- vagy multivalens kapcsolócsoporthoz való kötéssel kapcsolhatók egymáshoz. A találmány egyik megvalósítási módjában, a heterodimer, ¹trimer, ¹tetramer, vagy ¹multimer monomerjei többkaros PEG-polimerrel kapcsolhatók egymáshoz, ahol a dimer, trimer, tetramer, vagy multimer minden monomere a fentiekben leírtak szerint vannak a többkaros PEG PEG-csoportjához kapcsolva. A leírás szerinti értelemben, a féléletidõ kifejezés azt az idõt jelenti, amely a ligandum (például, immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén) szérumban mért koncentrációjának például, a ligandum lebomlása és/vagy kiválasztása (clearance) vagy a ligandum természetes mechanizmusok általi kizárása (sequestration) miatt bekövetkezõ 0%¹os csökkenéséig eltel. A találmány szerinti, antitesteredetû, variábilis egydoméneket in vivo stabilizáltuk és féléletidejüket megnöveltük a lebontásnak és/vagy kiválasztásnak vagy kizárásnak feltehetõen ellenálló molekulákhoz, például PEG-hez, való kötés révén. Egy adott dab vagy polipeptid féléletidejét akkor tekintjük megnöveltnek, ha annak funkcionális aktivitása hosszabb ideig marad fenn, in vivo, mint a hasonló, de PEG-polimerhez nem kapcsolt dab¹jé. Jellemzõ, hogy a PEG-ezett dab vagy polipeptid féléletideje a nem PEG-ezett dab-jéhez vagy polipeptidéhez viszonyítva %-kal, %-kal, %-kal, %-kal, 0%-kal vagy annál nagyobb arányban megnõtt. A féléletidõ növekedése a 2, 3, 4,,,,, 0 tartományba esik sõt még annál nagyobb mértékû is lehet. Esetleg, vagy ráadásul, a féléletidõt illetõen akár,, 0,, 70, 80, 90, 0, növekedés is lehetséges. A találmány szerint, egy adott, PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén vagy polipeptid féléletideje 0,2 és 170 óra, elõnyösen 1 és 0 óra, elõnyösebben és 0 óra, és ennél is elõnyösebben 0 és 0 óra közé esik, és akár 170, 180, 190 és 0 óra vagy annál hosszabb. A leírás szerinti értelemben, dab-monomerhez vagy multimerhez kapcsolt PEG vagy más polimer vonatkozásában alkalmazott degradálásnak ellenálló vagy degradálásnak ellenáll kifejezés azt jelenti, hogy amennyiben PEG-gel vagy más polimerrel kapcsolt dab-monomert vagy multimert ph=2,0-nál, percig pepszinnel érintkeztetjük, akkor a kérdéses monomer vagy multimer %-nál nagyobb mértékben nem degradálódik, és elõnyösen egyáltalán nem degradálódik. A találmány szerinti, PEG-hez vagy más polimerhez kötött dab-multimerre (például, hetero- vagy homodimer, trimer, tetramer stb.) vonatkozóan, amennyiben ilyen multimert ph=2,0-nál, percig pepszinnel érintkeztetünk, akkor az %¹nál nagyobb mértékben nem degradálódik, és elõnyösen egyáltalán nem degradálódik. A leírás szerinti értelemben, a hidrodinamikai méret kifejezés a molekula (például, fehérjemolekula) vizes oldaton át történõ diffúzióján alapuló, nyilvánvaló méretét jelenti. A fehérje oldaton át történõ diffúziója vagy mozgása felhasználható a fehérje nyilvánvaló méretének származtatására, ahol a méretet a fehérjepartikulum Stokes rádiuszaként vagy hidrodinamikai rádiuszaként adjuk meg. A fehérje hidrodinamikai mérete függ a tömegtõl és az alaktól (konformáció), oly módon, hogy két, ugyanazon molekulatömegû fehérjének eltérhet a fehérjék általános konformációján alapuló hidrodinamikai mérete A PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén (ideértve a leírás szerinti, antitesteredetû, variábilis-doménes multimereket) hidrodinamikai mérete a 0 00 kda; 00 kda; 0 00 kda; 00 kda; 0 00 kda és 00 kda tartományba eshet. A találmány szerinti, PEG-ezett dab hidrodinamikai mérete elõnyösen 0 0 kda. A leírás szerinti értelemben, a TAR1 kifejezés olyan dab¹t jelent, amelynek célantigénje TNF. A leírás szerinti értelemben, a TAR2 kifejezés olyan dab¹t jelent, amelynek célantigénje az emberi p- TNF receptor. Az ábrák rövid leírása 1. ábra: Egy sorozat PEG-ezett TAR1 19 formátum affinitását bemutató receptorkötési vizsgálat eredménye. 2. ábra: Egy sorozat PEG-ezett TAR1 19 formátum affinitását bemutató sejtcitotoxicitási vizsgálat eredménye. 3. ábra: Különféle PEG-ezett HEL4 dab formátum lizozimhez való affinitási kötõdésének eredményeit bemutató SDS-PAGE gélek. A sávok leírása a példákban található. 4. ábra: A TAR2 27 és a K PEG-ezett monomer affinitását bemutató receptorkötési vizsgálat eredményei.. ábra: A TAR1 19 és PEG-ezett változatok ph=2,0-nál végzett pepszinkezelés elleni proteázstabilitása. 6. ábra: dab¹k monomer PEG-ezésének vázlatos bemutatása ábra: módosítatlan V H vagy V L dab ábra: Felszínen PEGezett V H vagy V L ábra: PEG-hez kapcsolt C¹terminális ciszteint tartalmazó V H vagy V L dab. 7. ábra: PEG-ezett V H vagy V L hetero- or homodimer dab¹k vázlatos bemutatása ábra: C¹terminális diszulfidkötéssel 18

19 képzett V H vagy V L diszulfid dimer. 7. ábra: Egyetlen alegységen PEGezett V H vagy V L diszulfid dimer ábra: Mindkét alegységen PEGezett V H vagy V L diszulfid dimer ábra: Elágazó/villás/többkarú PEGgel a C¹terminális ciszteinen át kialakított V H vagy V L dimer ábra: Felszíni diszulfidkötéssel képzett V H vagy V L diszulfid dimer ábra: Egyetlen alegységen PEG-ezett V H vagy V L diszulfid dimer. 7. ábra: Mindkét alegységen PEG-ezett V H vagy V L diszulfid dimer ábra: Elágazó/villás/többkarú PEG-gel a felszíni ciszteineken át kialakított V H vagy V L dimer. 8. ábra: A találmány szerinti, PEG-ezett V H vagy V L hetero- vagy homodimerek további vázlatos bemutatása ábra: (Gly 4 Ser) n linkerrel (n=0 ) kialakított V H vagy V L linker dimer ábra: Egyetlen alegységen PEG-ezett V H vagy V L linker dimer ábra: Mindkét alegységen PEG-ezett V H vagy V L linker dimer ábra: A linker révén PEGezett V H vagy V L linker dimer ábra: C¹terminális cisztein aminosavat tartalmazó V H vagy V L linker dimer ábra: Két, diszulfidkötésekkel dimerizált V H vagy V L linker dimer. 9. ábra: PEG-ezett linker dab dimerek vázlatos bemutatása és ábrák: Egyetlen alegységen lévõ C¹terminális cisztein aminosav révén PEG-ezett V H vagy V L linker dimerek. 9. ábra: A linkerben lévõ cisztein révén PEG-ezett V H vagy V L linker dimer ábra: Egyetlen alegységen lévõ cisztein révén PEG-ezett V H vagy V L linker dimer ábra: Mindkét alegységen lévõ ciszteinek révén PEGezett V H vagy V L linker dimer.. ábra: V H vagy V L hetero- vagy homodimer dab¹k PEG-ezésének vázlatos bemutatása. 23. és 24. ábrák: dab tirmerek PEG-ezése és kialakítása C¹terminális aminosavak révén történõ kovalens trimerizálással 3 ágú PEG alkalmazásával. 2. ábra: Egy vagy több dab monomer felszíni PEG-ezése, ahol a dab trimer kialakítása linkerpeptidekkel történt. 26. ábra: A dab-trimer monomerjei egyikének C¹terminális PEG-ezése. 27. ábra: Két specifikus dab-trimer, amelyben a dab-monomerek közül kettõnek kötési affinitása van az TNF¹re, a harmadik monomernek pedig szérumalbuminra van kötési specificitása. Ez a formátum is PEG-ezhetõ a 2. vagy 26. ábrákon bemutatottak szerint. 11. ábra: V H vagy V L heterovagy homotetramer dab¹k vázlatos bemutatása ábra: 4 ágú PEG-nek az egyes dab-monomerek C¹terminális ciszteinjéhez való kötésével kialakított dab-tetramer és ábrák: dab-tetramer kialakítása két dab-linkerdimer, elágazó/többkarú PEG révén történt kapcsolásával, ahol a PEG vagy C¹terminális ciszteinhez (11 29) vagy pedig a kapcsoló peptidhez (11 31) van kapcsolva. 11. ábra: dab-tetramer, amelyben a tetramer minden monomerje a monomerek C¹terminális cisztein aminosavához kapcsolódó, egyetlen elágazó PEG-gen keresztül van összekapcsolva ábra: dab-tetramer, amelyben az egyes monomerek linker peptiddel vannak egymáshoz kapcsolva. Ez a konfiguráció a 2. vagy 26. ábrákon bemutatott bármely stratégia alkalmazásával PEG-ezhetõ. 12. ábra: A találmány szerinti megoldásban alkalmazható, PEG-gel kapcsolt, más multimer dab-formátumok ábra: dab linkerdimerek tetramerje, amelyek a tetramer kialakítása végett, többkaros PEG-gel önmagukban vannak összekapcsolva, ahol a PEG az egyes dimereket alkotó monomerek egyikének C¹terminális ciszteinjéhez kapcsolódik. 32. ábra: dab linkerdimerek tetramerje, amelyek a tetramer kialakítása végett, többkaros PEG-gel önmagukban vannak összekapcsolva, ahol a PEG az egyes dimerpárok linkerjében lévõ cisztein aminosavhoz kapcsolódik. 13. ábra: A V H váz, DP47 H4b csíravonal-szekvencián alapuló szekvenciája (a szekvencialistában 1 3. azonosító számokon megadott szekvencia), ahol az 1 3 HCDR-eket aláhúzással jelöltük. 14. ábra: A V váz, DP 9 J l csíravonal-szekvencián alapuló szekvenciája (a szekvencialistában 3., 4. azonosító számokon megadott szekvencia), ahol az 1 3 LCDR-eket aláhúzással jelöltük. 1. ábra: A dab¹k natív hidradinamikus mérete és az egérben mért in vivo féléletidõ közötti összefüggést bemutató diagram. A 8. táblázatban bemutatott adatokat alkalmaztuk a grafikon elkészítéséhez. 16. ábra: Monomer és K PEG-ezett TAR1 19 proteázstabilitási profilja. A relatív aktivitás a proteázt nem tartalmazó kontroll százalékában van megadva. Az alkalmazott proteázok az alábbiak voltak: pepszin, sertéseredetû bélnyálkahártyából származó peptidáz, elasztáz, borjúhasnyálmirigybõl származó nyers proteáz (CBP), és patkánybélbõl készült por (Rat In). 19

20 Részletes leírás A találmány tágyát megnövelt féléletidejû és proteolitikus lebontásnak a PEG-gel kapcsolt dab-khez képest ellenálló, PEG-gel kapcsolt dab¹k és dab-homo- és heteromultimerek képezik. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát PEG-gel kapcsolt dab-monomerek, ¹dimerek, ¹trimerek és tetramerek képezik, amelyek féléletideje legalább 0,2 óra, és hidrodinamikai mérete legalább 0 kda. Elõnyös, ha a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydomén aktivitását a PEG-gel kapcsolt, antitesteredetû, variábilis doménnel megegyezõ antitesteredetû, variábilis domént tartalmazó, de PEG-gel nem kapcsolt, antitesteredetû, variábilis egydoménhez képest megtartja. Ez fokozott terápiás hatékonyságot biztosít a dabmolekuláknak, mivel így megnõ azok keringési ideje és potens és hatékony aktivitásuk. A találmány egyik megvalósítási módjában, a találmány tárgyát olyan, PEG-gel kapcsolt dab-multimerek képezik, amelyek legalább két, nem komplementer variábilis domént tartalmaznak. Például, a dab¹k tartalmazhatnak egy pár V H domént vagy egy pár V L domént. Elõnyös, ha a domének nem tevefélékbõl származnak; elõnyösen emberi domének vagy emberi vázrégiókat (FW¹k) és egy vagy több heterológ CDR¹t tartalmaznak. A CDR¹ek és vázrégiók az immunglobulinok variábilis doménjeinek azon régiói, amelyeket a Kabat-féle Sequences of Proteins of Immunological Interest adatbázisban meghatároztak. A találmány egyik megvalósítási módjában, a dab domének tevefélékbõl származnak. Elõnyösek azok az emberi vázrégiók, amelyeket a DP47 és DPK9 csíravonal-génszegmensek kódolnak. Elõnyös, ha egy adott V H vagy V L domén FW1, FW2 és FW3 vázrégióinak szekvenciája megegyezik a DP47- bõl vagy DPK9-bõl származó FW1, FW2 és FW3 vázrégiók szekvenciájával. Az emberi vázrégiók (frameworks) adott esetben tartalmazhatnak mutációkat, például a találmány szerinti dab-kben alkalmazott emberi vázrégiók esetében összesen akár aminosavváltoztatást vagy akár aminosavváltoztatást Immunglobulin-eredetû, variábilis egydomén elõállítása: A találmány szerinti alkalmazásra szolgáló, antitesteredetû, variábilis egydomének (vagy dab¹k) olyan feltekert polipeptiddomének, amelyek immunglobulineredetû variábilis doménekre jellemzõ szekvenciákat tartalmaznak és amelyek specifikusan (azaz, a 00 mm vagy annál kevesebb disszociációs konstanssal) kötnek egy adott antigént, és amelyek variábilis egydoménként, azaz bármilyen komplementer variábilis domén nélkül, kötnek antigént. Ennélfogva, egy adott antitesteredetû, variábilis egydomén magában foglal teljesen antitesteredetû variábilis doméneket és módosított variábilis doméneket például olyanokat, amelyekben egy vagy több hurok, antitesteredetû variábilis doménekre nem jellemzõ szekvenciákra lett cserélve vagy csonkolt vagy N¹ illetve C¹terminális kiterjesztést tartalmazó, antitesteredetû variábilis doméneket, továbbá variábilis doménekbõl származó, olyan feltekert fragmentumokat, amelyek megtartják 00 nm vagy kevesebb (például, nm vagy kevesebb, 0 nm vagy kevesebb, nm vagy kevesebb, 0 nm vagy kevesebb, nm vagy kevesebb, 0 nm vagy kevesebb, nm vagy kevesebb, 0 nm vagy kevesebb) disszociációs konstansukat és a teljes hosszúságú domén, célantigénnel szembeni specificitását. Elõnyös, ha a találmány szerinti megoldásban alkalmazható antitesteredetû, variábilis egydomén az alábbi csoportból van kiválasztva: V HH,V H és V L, így V és V. Immunglobulin-eredetû, variábilis egydomének különféle módon elõállíthatók. Mindezen megközelítéshez alkalmasak a nukleinsavszekvenciák elõállítására (például amplifikálás, mutáció stb.) és manipulálására szolgáló jól ismert eljárások. Az egyik mód a kívánt antigént ismerten kötõ klónozott antitest nehézláncának vagy könnyûláncának V H vagy V L régióját kódoló gén amplifikálása és expresszálása. A V H és V L domének határai a Kabat és munkatársai publikációjában találhatók [Kabat és munkatársai, mint fenn (1991)]. A nehézlánc- és könnyûlánc-gének V H és V L doménjeinek határaival kapcsolatos információt alkalmazzuk a kívánt antigént ismerten kötõ antitesteredetû klónozott nehézlánc vagy könnyûlánc V domént amplifikáló PCR-láncindítók tervezésére. Az amplifikált V domént alkalmas expressziós vektorba, például, phen 1¹be [Hoogenboom és munkatársai, Nucleic Acids Res. 19, (1991)] illesztjük és egyedül vagy más polipeptidszekvenciával képzett fúzióként expresszáljuk. Az expresszált V H vagy V L domént a kívánt antigénnel szembeni nagy affinitású kötésre szûrjük a nehéz- vagy könnyûlánc-polipeptid maradékától való eltávolítás céljából. A találmány minden szempontja szerint, a kötésre való szûrést a technikában ismertek vagy az itt leírtak szerint végezzük. V H vagy V L domének repertoárját, például, a kívánt antigén elleni fágbemutatással szûrjük. Bakteriofágkönyvtárak és lambda fág expressziós könyvtárak elõállítására szolgáló eljárások a technikában jól ismertek, és az irodalomban le vannak írva [például, McCafferty és munkatársai, Nature 348, 2 (1990); Kang és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 4363 (1991); Clackson és munkatársai, Nature 32, 624 (1991); Lowman és munkatársai, Biochemistry, 832 (1991); Burton és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88, 134 (1991); Hoogenboom és munkatársai, Nucleic Acids Res. 19, 4133 (1991); Chang és munkatársai, J. Immunol. 147, 36 (1991); Breitling és munkatársai, Gene 4, 147 (1991); Marks és munkatársai, J. Mol. Biol. 222, 81 (1991); Barbas és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 447 (1992); Hawkins és Winter, J. Immunol., 22, 867 (1992); Marks és munkatársai, J. Biol. Chem., 267, 7 (1992); és Lerner és munkatársai, Science, 28, 1313 (1992)]. scfv fágkönyvtárak is le vannak írva az irodalomban [például Huston és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 8, (1988); Chaudhary és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87,