FONTOS! a március 14-i előadás március 19-én (szombat) 9 h-kor lesz

Átírás

1 FONTOS! a március 14-i előadás március 19-én (szombat) 9 h-kor lesz

2 2008 Small World contest - 4th Prize - Dr. Matthew Springer (University of California, San Francisco, United States) Specimen: Differentiation of unicellular Dictyostelium discoideum into multicellular slugs (100x) Technique: Stereomicroscopy

3 Mikroszkóp - mikroszkópia görögül: mikron = kicsi + szkopein = nézni MIKROSZKÓP olyan eszköz, mely megjeleníti az emberi szem számára láthatatlan parányokat MIKROSZKÓPIA a szabad szemmel láthatatlan parányok mikroszkóppal való tanulmányozásának tudománya CÉL 1. NAGYÍTOTT 2. MEGFELELŐ FELBONTÁSÚ 3. KONTRASZTOS kép

4 A fény (optikai) mikroszkópia felületi módszerek 3D módszerek NSOM TIRF SPR hagyományos konfokális nem-lineáris interferencia dekonvolúciós SRM több foton reverzibilis szaturáció ApoTome HELM I5M 4Pi SHG CARS 2P, 3P SSIM STED Garini és mtsai Current Biology 2005 MMM-4Pi

5 Geometriai optika - Lencsék Gyűjtőlencsék képalkotása k t t k t k = F F F F F F f f f f f f nevezetes sugármenetek fókuszpont, távolság (f) tárgy-, képtávolság (t, k) valós, látszólagos kép LENCSETÖRVÉNY f t k NAGYÍTÁS N K T k t

6 Geometriai optika - Lencsehibák KROMATIKUS ABERRÁCIÓ Diszperzió n( ) SZFERIKUS ABERRÁCIÓ A lencsék gömbszerű geometriája különböző hullámhosszúságú fénysugarak különböző fókuszpont különböző görbületet elérő fénysugarak különböző fókuszpont

7 Geometriai optika - Fénytörés beeső megtört megtört SNELLIUS-DESCARTES TÖRVÉNY sin sin n n 2 1

8 A fénymikroszkóp képalkotása - Alapelvek TÁRGY KÉP1 (valódi, nagyított, fordított állású) KÉP2 (látszólagos, nagyított, egyenes állású) TÁRGY KÉP2 (látszólagos, nagyított, fordított állású)

9 1. NAGYÍTÁS 2. FELBONTÁS 3. KONTRASZT

10 1. Nagyítás OBJEKTÍV: N objektív = OKULÁR: N okulár = 5 30 MIKROSZKÓP: N mikroszkóp = N objektív x N okulár

11 2. Felbontóképesség az a legkisebb távolság (d), amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól RAYLEIGH EGYENLET XY irányban a minta síkjában d x y, 0.61 NA Z irányban optikai tengely mentén d z 2 2 NA d: két pont távolsága λ: a megvilágítás hullámhossza NA: numerikus apertúra 1/d: a mikroszkóp feloldóképessége

12 2. Felbontóképesség - Hullámhossz d 0.61 NA d z 2 2 NA NA = 1.4 HULLÁMHOSSZ nm FELBONTÁS - XY nm FELBONTÁS - Z nm növelésével a felbontóképesség csökken

13 2. Felbontóképesség - Numerikus apertúra egy optikai rendszernek (pl. egy mikroszkóp lencsének) az a legnagyobb nagyító képessége, amellyel még éles képet ad. az optikai lencserendszerek fénygyűjtő képességének egység nélküli mérőszáma, mely meghatározza a felbontóképességet és a mélységélességet. NA nsin n: a tárgy és az objektív közötti anyag törésmutatója μ: az objektív félnyílásszöge NA =

14 2. Felbontóképesség - Airy korong a tárgy egyes pontjairól érkező fénysugarak az objektív nyílásán elhajlást szenvednek a képpontok helyett koncentrikus körök formájában megjelenő erősítési és kioltási helyek sorozata alakul ki Egyetlen tárgypont elhajlási képe: AIRY KORONG (George Biddel Airy ) TÁRGY KÉP erősítés kioltás

15 2. Felbontóképesség - Airy korong d d?? d 0.61 NA d d Airy korong felbontott nem felbontott az egyik maximuma éppen a másik első minimumába esik

16 2. Felbontóképesség - Airy korong NA NA növelésével a felbontóképesség növekszik

17 3. Kontraszt A minta optikai inhomogenitása miatt (törésmutató, alak,..) a rajta áthaladó a fénysugarak sajátságai (irány, sebesség, fázis, ) megváltozhatnak KONTRASZT

18 3. Fázis-kontraszt mikroszkópia A mintára eső fénysugarak a mintán áthaladva annak törésmutatójától, geometriájától (alakjától), vastagságától függően eltérülhetnek. nem eltérített (S) nem lépett kölcsönhatásba a mintával: HÁTTÉR fáziskésés minta eltérített (D) kölcsönhatásba lépett a mintával: DIFFRAKCIÓ

19 3. Fázis-kontraszt mikroszkópia VILÁGOS LÁTÓTERŰ MIKROSZKÓPIA AZONOS FÁZIS interferencia AZONOS AMPLITÚDÓ HOMOGÉN KÉP FÁZIS-KONTRASZT MIKROSZKÓPIA KÜLÖNBÖZŐ FÁZIS interferencia KÜLÖNBÖZŐ AMPLITÚDÓ KONTRASZTOS KÉP

20 3. Fázis-kontraszt mikroszkópia kép nincs diffrakció (S) diffrakció (D) objektív minta kondenzor FÁZISGYŰRŰ rápárologtatott réteggel ellátott lemez a hengerpalást mentén jövő (összehasonlító) fénysugarat a hullámhossz negyedrészével fázisban eltolja KÜLÖNBSÉGEK MAXIMALIZÁLÁSA a fénysugár henger- vagy kúppalást mentén halad KONDENZOR MASZK fényzáró réteg gyűrű alakú áteresztő területet gyűrű-diafragma

21 2008 Small World contest -18th Prize - Dr. Tamily Weissman (Harvard University - Cambridge, Massachusetts, United States) Specimen: Brainbow transgenic mouse hippocampus (40x) Technique: Confocal

22 Fluoreszcencia mikroszkópia A mintának a megvilágító fény által kiváltott fluoreszcenciáját képezzük le. A képalkotáshoz használt fény fluorofórok emissziójából származik.

23 Fluorofórok BELSŐ (INTRINSIC) FLUORESZCENCIA klorofil KÜLSŐ (EXTRINSIC) FLUORESZCENCIA fluoreszcens molekulák kvantum gyöngy (d = 2-10 nm, atom) fehérje (GFP) (d = 10 nm, 26 kda) kis molekula (d = 1 nm, 20 atom)

24 Mikroszkóp

25 Mikroszkóp GERJESZTÉS SZEMLENCSE MINTA DETEKTOR OBJEKTÍV SZŰRŐK TÜKRÖK

26 Mikroszkóp ÁTESŐFÉNY INVERTÁLT

27 Gerjesztés: Lámpák, lézerek LÁMPA: xenon ív, higanygőz LÉZER, LED

28 Szűrők: gerjesztési/emissziós egy meghatározott hullámhossztartomány kiválasztása

29 Dikroikus tükör egy meghatározott hullámhossztartományban visszaveri a fényt, a többi hullámhossztartományon átenged (NYALÁBOSZTÓ)

30 Szűrők + tükrök EMISSZIÓ emissziós szűrő dikroikus tükör GERJESZTÉS szűrő kocka gerjesztési szűrő

31 Objektív nagyítás fedőlemez tárgylemez típus immerzió immerzió típusa típusa NA fedőlemez típusa nagyítás színkód munka távolság

32 Detektorok foton elektromos jel FOTOELEKTRON SOKSZOROZÓ FOTODIÓDA CCD KAMERA (charged coupled device)

33 Fluoreszcencia mikroszkópia Probléma 1 emisszió m gerjesztés HÁTTÉRFLUORESZCENCIA!!! Z IRÁNYÚ FELBONTÁS JAVÍTÁSA konfokális technika evaneszcens mező alkalmazása több foton gerjesztés

34 Konfokális mikroszkópia

35 Konfokális mikroszkópia - Alapelvek KONJUGÁLT FOKALITÁS : KONFOKÁLIS detektor emisszió fókuszponton kívüli apertúra fókuszpontból gerjesztő lézer gerjesztés apertúra fókuszsíkok

36 Konfokális mikroszkópia

37 Konfokális mikroszkópia felbontás XY: 200 nm Z :600 nm

38 TIRFM Total Internal Reflection Microscopy Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia

39 TIRFM - Alapelvekc TELJES BELSŐ VISSZAVERŐDÉS teljes belső visszaverődés sin sin n 2 n 1 n n kritikus o megtört

40 TIRFM - Alapelvek EVANESZCENS MEZŐ I( z) I0 exp( z / d) [z], nm I(z) %-ban

41 TIRFM - Alapelvek nagy NA immerziós olaj (n) a gerjesztő nyaláb tengelyen kívüli helyzete

42 TIRFM

43 TIRFM felbontás XY: 200 nm Z :100 nm

44 Több-foton gerjesztéses mikroszkópia

45 Több-foton gerjesztéses mikroszkópia - Alapelvek Nemlineáris optika E hc Jablonski diagram 1 1 t s LÉZER!! impulzuslézer

46 Több-foton gerjesztéses mikroszkópia

47 Fluoreszcencia mikroszkópia Probléma 2 FELOLDÓKÉPESSÉG RAYLEIGH EGYENLET d 0.61 NA HULLÁMHOSSZ nm FELBONTÁS - XY nm XY FELBONTÁS JAVÍTÁSA fizikai módon matematikai módon

48 STED Stimulated Emission Depletion Microscopy Fluoreszcencia emisszió stimulált gyengítésén alapuló mikroszkópia

49 STED - Alapelvek Fluoreszcencia emisszió stimulált gyengítése gerjesztés fluoreszcencia nem lineáris le-gerjesztés alapállapot - nonfluoreszcens maradék fluoreszcencia

50 STED - Alapelvek fázislemez gyengítő lézer STED lézer gerjesztés gyengítés red shift dikroikus tükrök gerjesztő lézer objektív minta széleslátóterű STED

51 STED Aktin filamentumok Elise Stanley, Division of Genetics & Development, Toronto Western Research Institute (TWRI), Canada

52 STED felbontás XY: nm Z :100 nm

53 SIM Structured Illumination Microscopy Struktúrált megvilágítás mikroszkópia

54 SIM - Alapelvek rács forgatása + képkészítés képanalízis fontos: rács geometriája forgatások száma

55 SIM felbontás XY: 100 nm Z : nm

56 FRAP Fluorescence Recovery After Photobleacing Fluoreszcencia intenzitás visszatérése kioltás után

57 FRAP Fluoreszcencia intenzitás intenzív lézerimpulzus kioltás kinetikai analízis fluoreszcencia intenzitás visszatérésének sebessége mennyisége kioltás visszatérés mobilis 50% immobilis idő (t)

58 FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy FADIM Fluorescence Anisotropy Decay Imaging Microscopy Fluoreszcencia élettartam/anizotrópia mikroszkópia

59 FLIM - FADIM

60 További érdekességek 2010 Small World contest - 7th Prize - Mr. Yongli Shan (UTSW - Dallas, Texas, USA) Specimen: Endothelia Cell attached to synthetic microfibers (2500x) Technique: Epifluorescence, Confocal