MIKROSZKÓPIA. "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)

Átírás

1 MIKROSZKÓPIA "mikrosz" (kicsiny) "szkopeo" (nézek)

2 Miért is használunk a gyakorlatban mikroszkópot? Leggyakoribb mikroszkópos vizsgálati minták: - Sejtek - Szövetek

3 MÉRETTARTOMÁNYOK AZ ÉL VILÁGBAN

4 MÉRETTARTOMÁNYOK AZ ÉL VILÁGBAN

5

6 MIKROSZKÓPIA

7 A FÉNY Fény: Az elektromágneses spektrum látható tartománya. Elemi részecskékb l (fotonokból) álló, rendezett, több síkban haladó térbeli hullám. Monokromatikus fény: olyan fény, amelyben csak egyetlen hullámhosszúságú sugarak vannak. Összetett fény: Több, különféle hullámhosszúságú fényhullám keveréke. A látható fény hullámhossztartománya nagyjából nm.

8 A FÉNY A fény hullámtani jellemz i: Hullámhossz, (λ): egy adott frekvenciájú hullám ismétlődő egységei (pl. csúcsok) közti távolság. Frekvencia: Az egy másodperc alatti rezgések száma. Amplitúdó: A rezgés hullámok csúcsa és közepe közti távolság, vagyis a hullámok kitérésének mértéke

9 A látható fény komponensei

10 A LÁTHATÓ FÉNY KOMPONENSEI

11 A MIKROSZKÓP FELÉPÍTÉSE okulár objektív makrométer csavar mikrométer csavar tárgyasztal kondenzor diafragma fényforrás

12 A MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA

13 HASZNOSÍTHATÓ-E A MAXIMÁLIS NAGYÍTÁS? A MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA A mikroszkóp nagyítása egyenl az objektív és okulár nagyításának szorzatával: Okulár: ő-30 x nagyítás Objektív: Ő-100 x nagyítás a színkorrekció jelzése Maximum nagyítás : 3000X az immerzió jelzése az objektív nagyítása mechanikus tubushossz (mm) az objektív frontlencséje a numerikus apertúra értéke javasolt fedőlemez vastagság a különleges rendeltetés jelzése immerziós jelzőcsík

14 Optikai lencsék leképzési hibái Szférikus aberráció Gömbi eltérés az optikai lencsék egyik tipikus leképezési hibája. Domború lencsék esetében azoknál a fénysugaraknál jelentkezik, amelyek a lencse optikai tengelyétől távolabb, a lencse szélén haladnak keresztül. Mivel ott más szögben törnek meg, mint a lencse közepe felé, ezért a különböző fénysugarak nem találkoznak egy pontban: pontszerű leképezés helyett szóródási kört hoznak létre.

15 Optikai lencsék leképzési hibái Kromatikus aberráció (Színhiba) A lencsék különböző mértékben törik meg a fényt az egyes hullámhosszokon, ezért a fény sugarak másképp törnek meg, aszerint, hogy milyen a színük. A tárgyról kiinduló sugarak nem ugyanazon fókusz pontra érkeznek. (Színgyűrűk keletkeznek)

16 A MIKROSZKÓP FELBONTÓKÉPESSÉGE FELBONTÓKÉPESSÉG (d) : ~0.25 mm a legkisebb távolság a minta két, még éppen megkülönböztethet pontja között. A felbontóképesség annál jobb, minél közelebbi pontok különböztethet ek meg egymástól.

17 A MIKROSZKÓP FELBONTÓKÉPESSÉGE A mikroszkóp felbontóképessége, (d) : d = 2A fényhullámhossz numerikusappertura objektív tárgy A = n sinα n: a tárgyat takaró fedőlemez és a frontlencse közötti közeg törésmutatója. (n értéke levegőre n=1, desztillált vízre n=1,33, cédrusolajra n=1,51.) α: az optikai főtengely és a legszélső fénysugár által bezárt szög (az objektív nyílásszögének a fele)

18 FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSI LEHET SÉGEI (i) A számlálóban szereplő érték csökkentése, vagyis rövidebb hullámhosszúságú fény alkalmazása. Ultraibolya fény alkalmazásával a felbontóképesség akár 0,1 μm-re csökkenthető, ám mivel költséges kvarc lencséket kell alkalmazni és olyan detektort, amely érzékeli az ultraibolya fényt, az ultraibolyafénymikroszkópot ritkán használják.

19 FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSI LEHET SÉGEI (ii) A nevező, vagyis a numerikus apertúra értékének növelése. n növelése: A fedőlemez és a frontlencse közé a levegőnél nagyobb törésmutatójú anyagot cseppentünk, és a frontlencsét a folyadékcseppbe merítjük. Ezeket a lencséket (leggyakrabban a 100-szoros nagyítású objektíveket), immerziós (bemerülő) objektíveknek nevezzük. Az immerziós folyadék leggyakrabban cédrusolaj. Az olajos objektívek az ún. olajimmerziós, vagy más néven homogén immerziós objektívek (jelük HI). Ha az objektíven a WI jel van, az objektív és a fedőlemez közé desztillált vizet kell csöppenteni. Cédrus olaj (n=1,51) használata esetén a numerikus apertúra értéke 1,43 (sin72 =0,95; 0,95x1,51= 1,43, vagyis ekkor a fénymikroszkóp felbontása 0,28 μm). a növelése: A lencse fél nyílásszögét hozzávetőleg 72 -ig lehet fokozni, mert a nagyobb beesési szöggel érkező fénysugarak már teljes visszaverődést szenvednek. Minthogy a levegő törésmutatója 1, a legjobb felbontású száraz objektívek numerikus apertúrája 0,95.

20 MIKROSZKÓPOS MÉRETMEGHATÁROZÁS objektív mikrométer okulár mikrométer

21 MIKROSZKÓPOS MÉRETMEGHATÁROZÁS hajszál objektív mikrométer skála okulár mikrométer skála mikrométer okulár mikrométer skála

22 Mikroszkópos sejtszámlálás A Bürker kamra A fedőlemez és tárgylemez közötti távolság 0,1 mm

23 Speciális mikroszkópos vizsgálati módszerek 1. Fáziskontraszt mikroszkópia 2. Polarizációs mikroszkópia 3. Fluoreszcens mikroszkópia 4. Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia 5. Elektron mikroszkópia

24 Vizsgált mikroszkópos minták Natív minták Festett minták (előny, hátrány)

25 Fáziskontraszt mikroszkópia A biológiai minták jelentős része átlátszó, ha hagyományos fénymikroszkóppal vizsgáljuk. A fáziskontraszt mikroszkóp képes a kontraszt növelésére festetlen minták esetében, a felbontóképesség jelentős csökkentése nélkül. A fáziskontraszt mikroszkópot elsősorban élő, festetlen minták vizsgálatára használjuk. Fritz Zernike 1953-ban Nobel díjat kapott a fázis kontraszt mikroszkóp feltalálásáért. A minta optikailag sűrűbb részén áthaladó, fáziskésést szenvedett, elhajlott fénysugarak útja elválik a mintán elhajlás nélkül áthaladó fénysugarakétól, melyeket az objektív fázislemeze késleltet. A két fénysugárpopuláció interferenciája kontrasztos képet eredményez, ahol az optikailag sűrűbb részek sötétebbek. Élő sejtek hagyományos fény (a) és fáziskontraszt mikroszkóppal (b) vizsgálva

26 Fáziskontraszt mikroszkópia fázislemez fázisgyűrű

27 Fáziskontraszt mikroszkópia baktérium a minta által megtört fénysugarak 1/Ő fáziskésést szenvednek a minta által megtört fénysugarak 1/2 fáziskésést szenvednek kioltás a nem érzékelhető fáziskülönbségek szemmel látható amplitúdó változássá alakulnak

28 Fáziskontraszt mikroszkópia A B

29 Polarizációs mikroszkópia A közönséges fény a tér minden síkjában rezgő (sok síkban poláros) fényhullámok B A keveréke. A B A A polarizált fény alkalmas anizotróp, kettős fénytörő anyagok vizsgálatára.

30 Polarizációs mikroszkópia Poláros fény előállítására alkalmas pl. a mészpát kristály. Ha a kristályon természetes fényt bocsátunk át, a fény két sugárra bomlik: Egyikük, az ordinárius sugár, követi a Snellius-Descartes törvényt, és a beesési síkban halad. A másik, az extraordinárius sugár nem követi a Snellius-Descartes törvényt, és kilép a beesési síkból. Az ordinárius sugár rezgési síkja a kristály főmetszetével párhuzamos, az extraordináriusé merőleges a kristály főmetszetére. Polarizációs vizsgálatnál a két sugár zavarja egymást, az egyik sugarat el kell távolítani. Nicol angol fizikus egy olyan prizmát készített, melyben az ordinárius fénysugár teljes visszaverődést szenved, az extraordinárius fénysugár viszont áthalad a kristályon és mint poláros fény lép ki.

31 Polarizációs mikroszkópia Régebben Nicol prizmákat alkalmaztak a polarizációs mikroszkópokban, újabban úgynevezett polarizációs szűrőket építenek be. A polarizációs szűrő két üveglemez közé ragasztott nagyon vékony hártya, amelyben tű alakú párhuzamos főtengelyű kristályok helyezkednek el sűrűn egymás mellett. A polarizációs mikroszkópok speciális alkatrészei 1. Polarizátor, amellyel a polarizált fényt állítjuk elő 2. Analizátor, amellyel a poláros fényt vizsgáljuk 3. Kerek, fokbeosztással ellátott forgatható tárgyasztal

32 Polarizációs mikroszkópia

33 Polarizációs mikroszkópia Az anyagokat fénytörésük alapján két nagy csoportra lehet osztani: (1) Az ún. izotróp anyagok a fényt egyszeresen törik. Bennük a fény minden irányban egyforma sebességgel terjed és a közeg egyetlen törésmutatóval jellemezhető. Amorf, rendezetlen szerkezetűek. Izotróp a legtöbb gáz és folyadék, valamint számos szilárd, általában nem kristályos anyag (például az üveg). Kivétel: NaCl (kősó) (2) Az ún. anizotróp anyagok a fényt kettősen törik. Bennük a beeső fény két, egymásra merőlegesen polarizált fénysugárra bomlik, amelyek a polarizációs mikroszkópban vizsgálhatók. Az anizotróp anyagok jellegzetes képviselői a kőzetek, a növényi rostok, keményítő-szemcsék, valamint a rendezett struktúrát mutató biológiai rendszerek, mint pl. a lipoproteid membránok. Polarizációs optikával való vizsgálatra csak az anizotróp anyagok alkalmasak

34 Polarizációs mikroszkópiás vizsgálat eredménye Burgonya keményitő (Cirkuláris dikroizmus)

35 Fluoreszcens mikroszkópia/ Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia ultraibolya Látható fény infravörös Hullámhossz (nanométer)

36 Mikroszkópia: múlt és jelen vékonybél keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés vékonybél keresztmetszet, immunofluoreszcens festés

37 Mikroszkópia: múlt és jelen here keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés here keresztmetszet, immunofluoreszcens festés

38 Fluoreszcencia. Fluoreszcencia -egy atom vagy molekula külső sugárzás hatására átmenetileg gerjesztett állapotba kerül, majd alacsonyabb energiájú (nagyobb hullámhosszú) fotont bocsájt ki (emittál). A fluoreszcens abszorpció és emisszió egy nanoszekundumon belül játszódik le.

39 Fluoreszcens Mikroszkópia A fluoreszcens mikroszkópia napjaink leggyorsabban fejl d mikroszkópiás technikája, mind az orvostudomány, mind a biológiai kutatások nélkülözhetetlen eszköze. Legfontosabb alkalmazási területe a különböz makromolekulák térbeli és id beli elhelyezkedésének vizsgálata sejt/szövet szinten. Használják még többek között fehérje interakciók vizsgálatára is.

40 A fluoreszcens mikroszkóp felépítése

41 A fluoreszcens filter kocka felépítése Gerjesztő szűrő (exciter filter): a higanygőz/xenon lámpa fényének csak meghatározott tartományát engedi a vizgálandó mintára. Határoló szűrő (barrier filter): csak a megfelelő hullámhosszú emittált fénysugarakat engedi át a detektor felé, a gerjesztő sugarakat kiszűri. Dikroikus tükör (dichroic mirror): visszaveri a gerjesztő, átengedi az emittált fénysugarakat.

42 Fluorokrómok Fluorokróm Természetes vagy szintetikus, fluoreszcenciára képes molekula. A fluorokrómok delokalizált elektronrendszere felelős a specifikus abszorpcióért és emisszióért.

43 Fluorokrómok

44 Immunofluoreszcens Mikroszkópia

45 Immunofluoreszcens Mikroszkópia

46 Fluoreszcens fehérjék Green Fluorescent Protein (GFP) - Medúzából származó fluoreszcens fehérje. Használjuk fehérjék elhelyezkedésének, koncentrációjának, kölcsönhatásainak és dinamikájának meghatározására élő sejtekben/szövetekben. Gyakorlatilag bármely fehérjét nyomon tudunk követni ha hozzá GFP-t fuzionáltatunk. Genetikailag módosított GFP variánsok, mint YFP (sárga), cián (CFP) léteznek a megfelelő irányba eltolt emissziós spektrummal (lásd FRET). DsRed -Vörösben emittáló fluoreszcens fehérje

47 Fluoreszcens immunhisztokémia SLE anti-nukleáris autoantitestjeinek kimutatása (FITC)

48 Fluorescent Proteins Tubulin-GFP

49 Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia A konfokális mikroszkóp segítségével a hagyományos fluoreszcens mikroszkópnál komplexebb módszert a sejtek/szövetek viszgálatára. A mintát lézer gerjeszti pontonkként, x-y irányban pásztázva. Az emittált fotonokat egy fotoelektron sokszorozó detektálja. A mintából vékony optikai metszetek sorozatát készítjük, ugyanis a detektor előtti csapnyílások kiszűrik a más fókuszsíkokból jövő zavaró fluoreszcenciát. Az optikai metszetekből a vizsgált minta háromdimenziós szerkezete számítógéppel meghatározható. a konfokális mikroszkóp fényútja lézer fókuszsíkok fókuszban lev emittált sugár minta fotoelektron sokszorozó detektor detektor csapnyílás fókuszon kívüli emittált sugarak dikroikus tükör objektív gerjeszt sugár

50 Pásztázó lézer konfokális mikroszkóp

51 Fényforrások fluoreszcens/konfokális mikroszkópiához

52 Fluoreszcens és konfokális képmin ség összehasonlítása

53 Béka asztrocita Mitotikus orsó

54 A hagyományos fluoreszcens mikroszkópos detektálás eredménye Fluoreszcens immunhisztokémia - aktin mikrofilamentumok kimutatása

55 A konfokális mikroszkópos detektálás eredménye Tüdő artéria endotél sejtjei

56

57 Z-szeletelés

58 3D Rekonstrukció Z-szeletelés után a mikroszkóphoz kapcsolt számítógép segítségével a minta térbeli szerkezete modellezhet, a minta térbeli képét bármilyen irányb l vizsgálhatjuk.

59 3D Rekonstrukció Drosophila Egg Chamber

60 3D modelling

61 ŐD képalkotás A konfokális mikroszkópot be lehet programozni hogy tetsz leges id nként készítsen képeket az él mintáról. Az igy készült képekb l mozi fájlokat készítünk.

62 ŐD képalkotás Tubulin-GFP

63 ELEKTRON MIKROSZKÓPIA Elektron-sugár forrás (Elektron ágyú) Filament Melegítés (500 C) e Wehnelt sapka (negatív potenciál) Töltés kollektor e - e - e Anód (positív potenciál)

64 Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM) Elektorn sugár Kondenzátor lencsék Kondenzátor apertura Minta OBJEKTÍV Objektív apertura Közbeiktatott lencsék PROJEKTOR Detektor

65 Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM)

66 Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM) Elektorn sugár Első kondenzátor lencse Kondenzátor appertúra Második kondenzátor lencse Objectív apertúra Pásztázó teketrcs OBJEKTÍV MINTA Visszavert elektronok Erősítő/Detektor Másodlagos elektronok

67 Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM)