Fény- és fluoreszcens mikroszkópia. A mikroszkóp felépítése Brightfield mikroszkópia

Átírás

1 Fény- és fluoreszcens mikroszkópia A mikroszkóp felépítése Brightfield mikroszkópia

2 Történeti áttekintés Jensen (Hollandia): első összetett mikroszkóp (2 lencse, állítható távolság) Giovanni Faber: mikroszkóp Robert Hook ( ): Micrographia; sejt Antonie van Leeuwenhoek ( ): egyedi, kézzel csiszolt lencse, egyszerű nagyítás (<500x, ~1 µm felbontás!) Joseph von Gerlach: agyszeletek festése első olaj-immerziós objektívek Camillo Golgi ezüst impregnáció Santiago Ramón y Cajal apochromat objektívek (színkorrekció) 1896: Paul Mayer hematoxilin-eozin festés 1904: Gustav Giemsa eozin-metilénkék 1924: Feulgen reakció: DNS hidrolízis és festés 1970 s: peroxidáz reakció immunhisztokémiához

3 Történeti áttekintés ~1850s: Stokes fluoreszcencia elmélete; 1871: Bayer fluoreszcein szintézis Ernst Abbe: diffrakciós limit (optikai rendszer felbontása; numerikus apertúra) 1890s-. Zeiss, Schott: apokromatikus lencsék August Köhler / Oskar Heimstädt: fluoreszcens mikroszkóp August Zernicke: fáziskontraszt mikroszkóp (1953. Nobel díj) plan-apochromat objektívek W. J. Schmidt / Shinya Inoué: polarizációs mikroszkóp Albert Coons: fluoreszcens ellenanyagok Nimsky, Petrán: konfokális mikroszkóp (pinhole) alapelve; gyakorlati megvalósítás dichroikus tükör (fluoreszcens mikroszkóp)

4 Történeti áttekintés 1972, Fluorescence correlation spectroscopy, FRAP, Förster resonance energy transfer (FRET) 1980s. fluoreszcens Ca 2+ indikátorok total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF) dekonvolúciós mikroszkópia foton mikroszkópia GFP fluoreszcens bioszenzorok (FRET: Ca 2+ szint, PKA, stb...) vörös fluoreszcens fehérjék fotoaktiválható fluoreszcens fehérjék 2000 / szuperrezolúciós mikroszkópia (STED / PALM / STORM)

5 A mikroszkóp optikai elemei megvilágítás / fényforrás megvilágítás modulálása kondenzor tárgy (prepi) objektív kép modulálása okulár detektor

6 Az upright mikroszkóp

7 Az inverz mikroszkóp

8 A kép keletkezése a fénymikroszkópban Ernst Abbe / Rayleigh egyenlet: d (felbontás) = 1.22 x (λ/2na)

9 felbontás és numerikus apertúra (NA) Az objektívek jellemzői NA = n(sin µ) n: törésmutató az objektív frontlencséje és a fedőlemez között µ: az anguláris apertúra-érték fele száraz objektív: NA max. 1 (de inkább kisebb) törésmutató növelése: víz (1.33), glicerin (1.47), immerziós olaj (1.51) NA között

10 Az objektívek jellemzői felbontás és numerikus apertúra (NA) a felbontás a nagyítástól nem, csak a megvilágító fény hullámhosszától és a NA-tól függ! a fénymikroszkóp maximális (elméleti) x-y felbontása ~ 200 nm <-> STED és szuperrezolúciós mikroszkópia!

11 Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk szférikus aberráció ált. a törésközeghez való jobb alkalmazkodás segít objektíven korrekciós gallér kromatikus aberráció Apochromat lencsék: korrigáltan

12 Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk komatikus aberráció középtengelytől eltérő megvilágítás mikroszkóp optikai tengelyének centrálása mezőgörbület Plan/Plano objektívek

13 Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk geometrikus aberráció főleg sztereomikroszkópban

14 Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk

15 Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk

16 Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk

17 Az objektívek jelölése

18 A kondenzor cél: a preparátum/látótér egyenletes megvilágítása az objektív NA-jának megfelelő fényoszlop jusson az objektívbe /condensers.html

19 A kondenzor Köhler-féle megvilágítás: optikai fényút centrálása, egyenletes megvilágítás beállítása konjugált síkok a megvilágító és a képalkotó optikai útban: optimálisan mindegyiken egyszerre éles a kép

20 A fénymikroszkóp konjugált síkjai microscopeconjugateplanes/index.html

21 A Köhler-féle megvilágítás beállítása 1. megfelelő objektív kiválasztása 2. kondenzor apertúra az objektív NA-jának megfelelő kinyitása 3. tárgy (prepi) fókuszsíkba hozása (=élesre állás) 4. mezőrekesz beszűkítése (-> kép konjugált síkjának definiálása) 5. kondenzor lencse magasságának állításával a mezőrekesz képét a fókuszsíkba hozzuk (= kép konjugált sík) 6. a kondenzor centrálása: a kondenzor centráló csavarok segítségével a kondenzor lencsét középre hozzuk -> látótér egyenletes 2. megvilágítása mezőrekesz kinyitása ~1/3 átmérővel tágabbra, mint az objektív látótere

22 Hasznos honlapok

23 Az Airy korongok