A sejtelmélet kialakulása párhuzamos a mikroszkóp fejlődéstörténetével

Átírás

1 A sejtelmélet kialakulása párhuzamos a mikroszkóp fejlődéstörténetével

2 Élő állati sejtek megfigyelése Anthony van Leeuwenhoek ( ) -elsőként figyelte meg és írta le pontosan a mikroorganizmusokat --egy lencséből, un. bolhalencséből álló mikroszkópot használt

3 Robert Hooke

4 Robert Hook fizika, kémia, meteorológia, geológia, csillagászat, biológia -az Angol Királyi társaság titkára -A sejt/cella/cellula szó megalkotója -Penészeket, protozoákat vizsgált -A fatest szerkezetét vizsgálta -Felismerte a szállítónyalábok szerepét

5 A sejt fogalma Matthias Schleiden Theodor Schwann

6 Omnis cellula e cellula minden sejt sejtből lesz (1855) Rudolph Virchow ( ) All living things are made of cells. The cell is the basic unit of all living things. Cells only come from pre-existing cells. Cellulár-patológia

7 Robert Hook mikroszkópja Az összetett mikroszkóp jellemzői szemlencse - okulár tárgylencse - objektív kondenzor lencse-kontrasztosságot biztosítja A nagyítás kiszámítása: okulár x objektív Nagy volt a torzítás, ezért a baktériumokat nem láthatta

8

9

10 Sejttan avagy citológia elölt vagy élő?

11 A felbontóképesség

12 A citológia klasszikus vizsgálómódszerei mikroszkópia + mikrotechnika Normál fénymikroszkópia Fáziskontraszt mikroszkópia Polarizációs = II = DIC (differencia interferencia kontraszt m.) Fluoreszcens = II = Konfokális Lézer Scanning Mikroszkópia (CLSM) Elektronmikroszkópia transzmissziós (TEM) pásztázó vagy scanning (SCAM) analitikai (AEM)

13 Zsigmondy Richárd Ultramikroszkóp 1903 Tyndall-jelenség: kolloidrészecskéket szuszpendálnak egy sötét hátterű, tartályban, majd a tartályt egy erős fénykúppal világítják meg oldalról úgy, hogy a fénykúp csúcsa a látómezőben legyen. A részecskék diffrakciósgyűrűrendszereket okoznak, amelyek a sötét háttér előtt fehér pettyekként tűnnek fel.

14 Világos látóterű mikroszkópia Sötét látóterű mikroszkópia Nem látjuk a mintát A minta felvillan

15

16 Festet t sejt Festetl en sejt A. A sejt festett része csökkenti a fényhullám amplitúdóját, a normál fénymikroszkópban így alakul ki a kép. B. A fény az eltérő sűrűségű anyagokon áthaladva eltérő időkben (fázisokban) lép ki. A fény fázisok közti különbségeket teszi látható intenzitáskülönbséggé a fáziskontraszt mikroszkóp.

17 FÁZISKONTRASZT MIKROSZKÓP Epiteliális sejt FÉNYMIKROSZKÓP neutrofil granulocita (Metilénkék) (May-Grünwald-Giemsa)

18 Spazmonéma helix Kontrakció: 40% ms alatt Sebesség: 8 cm/s Negative töltések Semlegesítés Ca 2+ -vel

19 Polarizáció: a fény terjedése a térnek csak egy meghatározott síkjában lehetséges ilyen megvilágításban az anizotróp (kettős törő) struktúrák különlegesen viselkednek (szabályos biológiai szerkezetek: izom, kollagén rostok, csont, porc alkotóelemei)

20

21 A fluoreszcens mikroszkópia legfontosabb alkalmazási területe a különböző makromolekulák térbeli és időbeli elhelyezkedésének vizsgálata sejt/szövet szinten. Használják még többek között fehérje interakciók vizsgálatára, de a sejten belüli ph és ionkoncentrációk meghatározására is. Fluoreszcens Mikroszkópia Fluorokróm Természetes vagy szintetikus, fluoreszcenciára képes molekula. A fluorokrómok delokalizált elektronrendszere felelős a specifikus abszorbcióért és emisszióért.

22 A fluoreszcens mikroszkóp felépítése

23 Mikroszkópia: múlt és jelen vékonybél keresztmetszet, haematoxilin/eozin festés vékonybél keresztmetszet, immunofluoreszcens festés

24 Pásztázó lézer konfokális mikroszkópia A konfokális mikroszkóp segítségével a hagyományos fluoreszcens mikroszkópnál mélyebben lehet behatolni a sejtekbe/szövetekbe. A mintát lézer gerjeszti pontonkként, x-y irányban pásztázva. Az emittált fotonokat egy fotoelektron sokszorozó detektálja A mintából vékony optikai metszetek sorozatát készítjük, ugyanis a detektor előtti csapnyílások kiszűrik a más fókuszsíkokból jövő zavaró fluoreszcenciát. Az optikai metszetekből a vizsgált minta háromdimenziós szerkezete számítógéppel meghatározható. a konfokális mikroszkóp fényútja lézer fókuszsíkok fókuszban levő emittált sugár minta fotoelektron sokszorozó detektor detektor csapnyílás fókuszon kívüli emittált sugarak dikroikus tükör objektív gerjesztő sugár

25 Pásztázó lézer konfokális mikroszkóp

26

27 A fénymikroszkóp különböző fajtái Emberi epiteliális sejtek FM: Festetlen: a fény áthalad a mintán - kis kontraszt FM: Festett, de fixált ( nem élő) preparátum Fáziskontraszt mikroszkóp: élő, festetlen preparátum - törésmutató különbségen alapul Interferencia - differenciál mikroszkóp Fluoreszcens mikroszkóp: a fluoreszcens festék elnyeli az UV és kibocsátja a látható fényt Konfokális mikroszkóp: fluoreszcens festék + lézerfény

28 A felbontóképesség növelése A képalkotáshoz nem látható fényt, hanem elektronsugárzást használunk.

29

30 Transzmissziós elektronmikroszkóp TEM

31

32 Transzmissziós electron mikroszkóp (TEM)

33 Pásztázó Elektron Mikroszkóp (SEM) Elektron sugár Első kondenzor lencse Kondenzor apertúra Második kondenzor lencse Objektív apertúra Pásztázó tekercs OBJEKTÍV MINTA Visszavert elektronok Erősítő/Detektor Másodlagos elektronok

34 SCEM

35

36

37

38 Nem elég a feloldóképesség! --- megfelelő preparációs eljárásokkal kell megőrizni, kontrasztot fokozni vagy szelektíven jelölni. Az anyag feldolgozásának lépései Fixálás (kémiai (aldehidek, pl.formalin) vagy fizikai (fagyasztás) Mosás (fixálószer eltávolítás) Víztelenítés (a beágyazó anyag ált. hidrofób) Beágyazás (tartást ad, paraffin/fm-re, műgyanta/em-re) Metszés (mikrotomokkal)

39 Fénymikroszkópra

40 Paraffinos sorozatmetszés kerekes mikrotom kriosztát

41 Tartósítás - Fedés Festés

42 Citológiai festések Savas + bázikus (hematoxilin-eozin) Bázikus (toluidinkék, Nissl ) Redukció (ezüstimpregnáció) Metakromázia

43 Az általános magés citoplazma festés Hematoxilin-eozin kettős festés

44 Nissl festés krezilibolyával Toluidinkék

45 Metakromázia Ezüstimpregnáció

46 Amikor valami nem festődik ilyen egyszerűen Pl. Nyák Lipidcsepp Myelin

47 és jött a biokémia! In vitro vagy in situ? Citokémia

48 Lipid Nyálka szénhidrát - PAS

49 Elektronmikroszkópra - Ultramikrotóm

50

51

52 Itt a tárgylemez a mikrostély vagy grid! Meglehetősen kicsi. a preparátum pedig vékony Hogy is van ez? FM: 5-10 µm metszet EM vizsgálat előtt tájékozódásra : 0,5-1 µm ún félvékony metszet EM-re nm ultravékony metszet

53 Az EM anyag különlegessége: kettős fixálás Aldehid + ozmium(utóbbi a membránok egyes alkotóihoz köt alapkontrasztot ad) Kontrasztosítás vizsgálat előtt: további nehézfémsókkal (ólomsók, uranilsók)

54 FM (balra) és TEM kép (jobbra) részletgazdagságána k összehasonlítása Hepatocyták

55 SEM (balra) és TEM kép (jobbra) összehasonlítása Hepatocyták FUSA/NEUROSCIENCE/CALCIU M/CalciumLab.html

56 Nehézfém árnyékolás Miozin Kromatin

57 A számítógépes képfeldolgozás példája: álszínezés Riboszómák

58 Fagyasztva törés (balra) és fagyasztva maratás (jobbra) összehasonlítása cellbio.utmb.edu/cellbio/nucpore4.jpg cellbio.utmb.edu/cellbio/nucpore5.jpg

59 A Golgi EM kimutatása Fagyasztva törés TEM

60 A Golgi EM kimutatása TEM metszet

61 Fáziskontraszt mikroszkóp A mitokondriumok fénymikroszkóppal is kimutathatók Paraffinos metszet félvékony metszet

62 Mitokondrium, fagyasztva maratás

63 Harántkrisztás mitokondriumok, TEM

64 Kehelysejtek: FM metszet (bal), TEM metszet (jobb), SEM (bal) M N GYTK N= nucleus, M = mucinogén szemcék

65 Specifikus jelölések: az immunreakció - immuncitokémia

66 Az antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapuló kimutatási módszerek alaptípusai Direkt módszer Indirekt módszer Jelzés Secunder ellenanyag Primer ellenanyag Antigén Az antigén leggyakrabban fehérje. A jelzés lehet: enzim ami majd látható csapadékot termel (ált. barna vagy kék) fémszemcse pl. arany fluoreszcens anyag ún. kromofor pl. Alexa, Cy, FITC néven

67 ---Enzimes Arany----- Fluoreszcens

68 .és ha szeretnénk ÉLŐ sejteket vizsgálni, mit tehetünk? Válasszunk bizonyos mikroszkópokat/üzemmódokat - Fáziskontraszt - Polarizációs - DIC Válasszunk in vivo festések Normál fénymikroszkópra: Neutrálvörös lizoszóma Janus zöld mitokondrium Metilénkék mag Tus citoplazma fagocitózissal DE Leggyakrabban fluoreszcens festékkel fluoreszcens mikroszkópra (permeabilizálással, mikroinjektálva, vezikulába zárva, ami fuzionál a sejtmembránnal, vagy észteresítéssel amfipatikussá alakítva)

69 Manipulációs tér Nagyobb munkatávolság A sztereomikroszkóp Az inverz mikroszkóp

70

71 Nukleinsav-festések DAPI (2,4 diamidino-2-fenilindol) magfestés (Hoechst kék, könnyeben diffundál) (propidium-jodid piros lenne) Akridin-orange Egy festék, két emissziós tartomány RNS-tartalmú citoplazma piros DNS tartalmú mag zöldessárga

72 Sejtszervecskékre jellemző fehérjékhez kötnek: Lysotracker - lizoszóma Mytotech - mitokondrium

73 Membránpotenciál változás töltésmegoszláson alapuló próbákkal. Ionkoncentráció alakulása a sejtben: indikátor festékek Pl. FURA-2 Zöld: ic. Ca ++ cc nő

74 Egysejt jelölés nyomjelző molekulák bejuttatása / tracerek Pl. Lucifer yellow, biotin immunreakcióval előhívni

75 -Jó modellszervezetek: Saccharomices cerevisiae Caeonorrhabditis elegans Drosophila melanogaster Mus musculus.és jött a molekuláris biológia In situ hibridizáció: nukleinsavhoz jelölt nukleinsav darabot (próbát) kötünk, hibridizáltatunk Mire jó? -gének keresése - -mrns mennyiség mérése génexpresszió mértékének ismerete Miért in situ? -Mert a szövetben, a sejtben zajlik, mikroszkóppal láthatóvá tehető/vizualizálható. GFP (zölden fluoreszkáló fehérje/green fluorescent protein génjét inzertáljuk a sejtbe, a keresett fehérjénk génje mellé -Fúziós fehérjéket fejeztetünk ki látjuk a célfehérje megjelenését, mennyiségét

76 FISH fluorescent in situ hibridization Meghatározott DNS szekvenciát keresünk fluoreszcens kromoforral jelölt próbával

77 Aequoria victoria

78 K + -csatorna + GFP

79 És az utolsó megfontolások: -gyakran egy jelöléssel indítunk be egyegy folyamatot a sejtben (pl. szignál transzdukciót - a sejtek in vivo általában szöveti kötelékben fordulnak elő viselkedésük és morfológiájuk izolálva eltérő

80 A XXI. században: Morfológia, biokémia, molekuláris biológia, fejlődésbiológia, fiziológia mikrobiológia a sejttan/citológia ma már SEJTBIOLÓGIA (funkcionális mikromorfológia)