Biofizika 2 Fizika-Biofizika

Átírás

1 AJÁNLOTT HONLAPOK Biofizika 2. Fizika-Biofizika & 26. Dr. Bugyi Beáta -PTE ÁOK Biofizikai Intézet AJÁNLOTT HONLAPOK 2. MIKROSZKÓPIA - MÉRFÖLDKÖVEK KÉTFOTON MIKROSZKÓPIA INTRAVITÁLIS MIKROSZKÓPIA élı egérben véráram a májban FÁZIS KONTRASZT MIKROSZKÓPIA Listeria monocytogenes PtK2 sejtben forrás Julie Theriot, Dan Portnoy TIRF MIKROSZKÓPIA aktin filamentumok in vitro forrás Bugyi Beáta 3D KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA tengeri csillag petesejt, meiozis forrás Péter Lénárt FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA EGFP aktint expresszálób16 melanoma sejt forrás Klemens Rottner FRAP lamellipodium aktin dinamikája EGFP aktin expresszló B16-F1 sejtekben forrás Lai et al. EMBO Journal 2008 HISZEM, HA LÁTOM BIOLÓGIA ALKOTÓ TECHNIKÁK!? Abbe elv emberi szem Az emberi szem felbontóképességének (α) hullámoptikai határa: 0.1 mm a tisztánlátás távolságából (25 cm) Emlékeztető: I. félév 9. előadás - Látás ~ ~ a fény hullámhossza: λ a pupilla átmérıje: d MIKROSZKÓPIA PET, SPECT MRI, CT, ultrahang optikai koherencia tomográfia (OCT) széleslátóterő, íííííííííííííííí evaneszcens mikroszkópia konfokális mikroszkópia 4Pi, I5M high resolution structured illumination (hrsim) ground state depletion (GSD) saturated structured illumination (ssim) stimulated emission depletion (STED) egyedi molekula lokalizáció (PALM, STORM) közeli mezı optikai mikroszkópia (NSOM) elektron mikroszkópia (EM) 1

2 MIKROSZKÓPIA - MIKROSZKÓP MIKRO SZKÓPIA (görög)= MIKRON = kicsi + SZKOPEIN = nézni az emberi szem számára láthatatlan, apró vizsgálati objektumok megjelenítése, láthatóvá tétele eszköze: mikroszkóp OPTIKAI - FÉNYMIKROSZKÓPIA Képalkotás: látható fény (λ = nm) üvegbıl készült lencsék A mikroszkópia segítségével láthatóvá tehetjük az élı rendszerek különbözı szervezıdési szintjeit: szervektıl (cm 10-2 m) egyedi molekulákig (nm 10-9 m). 7 nagyságrend!!!! NA = EGYSZERŐ MIKROSZKÓP LUPE (1 GYŐJTİLENCSE) ÖSSZETETT MIKROSZKÓP (2 GYŐJTİLENCSE) retina szem GYŐJTİLENCSE fókusztávolságon belül OKULÁR - szemlencse OBJEKTÍV - tárgylencse 1: objektív nagyított valódi fordított állású Emlékeztető: Geometriai optika nagyított egyenes állású látszólagos 2: okulár nagyított egyenes állású látszólagos MODERN FÉNYMIKROSZKÓP minta FÉNYFORRÁS KONDENZOR MODERN FÉNYMIKROSZKÓP LEGFONTOSABB OPTIKAI ELEMEK OBJEKTÍV (tárgylencse, 1db) a tárgyhoz közelebb esı lencserendszer nagyítás OKULÁR (szemlencse, 2db) a megfigyelıhöz közelebb esı lencserendszer nagyítás OKULÁR KONDENZOR DETEKTOR:SZEM OBJEKTÍV KONDENZOR a fényforrás fényének összegyőjtésére és a tárgyra fókuszálásáraszolgáló lencserendszer egyenletes megvilágítás OBJEKTÍV OKULÁR (2db) SZŐRİK TÜKRÖK VÁZ DETEKTOR:KAMERA 12 2

3 MEGVILÁGÍTÁS - transzmissziós ÁTESİFÉNY - TRANSZMISSZIÓS MEGVILÁGÍTÁS - epi EPI FÉNYFORRÁS DETEKTOR DETEKTOR FÉNYFORRÁS MIKROSZKÓPVÁZ upright / inverted ALKOTÁS: SZEM -PONT FOTON DIGITÁLIS JEL - PONT PIXEL INTENZITÁS TÉR A ALKOTÁS LEGFİBB KÖVETELMÉNYEI 1. NAGYÍTÁS elég nagy legyen 2. FELBONTÁS minden érdekes részlet láthatóvá váljon milyen kicsi dolgokat láthatunk? 1. NAGYÍTÁS NAGYÍTÁS: N é é á é v 3. KONTRASZT minden érdekes részlet jól elkülönüljön a környezetétıl OBJEKTÍV: N objektív x OKULÁR: N okulár 10 25x MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA: N mikroszkóp 50x 1200x ó í á 3

4 2. FELBONTÁS FELBONTÓESSÉG DIFFRAKCIÓ (ELHAJLÁS) FELBONTÓESSÉG: d az a legkisebb távolság, amelyre lévı két tárgypont képe még megkülönböztethetı egymástól a képen DESTRUKTÍV kioltás - sötét kép INTERFERENCIA KONSTRUKTÍV erısítés - világos nem olyan egyszerő, mint amilyennek tőnik az 1D-s pont képe nem pont, hanem egy 3D-s mintázat objektív elhajlási irány optikai rács fényáteresztı képesség periódikusan változik ELHAJLÁS DIFFRAKCIÓ tárgy OPTIKAI RÁCS kondenzor fényrekesz Emlékeztető: I. félév 18. előadás EM hullámok tulajdonságai: diffrakció, interferencia FELBONTÓESSÉG AIRY MINTÁZAT George Biddel Airy ( ) AIRY MINTÁZAT: egyetlen tárgypont elhajlási képe egyetlen tárgypontról képpont helyett koncentrikus körök formájában megjelenı erısítési és kioltási helyek sorozata alakul ki elhajlási kép FELBONTÓESSÉG AIRY MINTÁZAT 1D POINT SPREAD FUNCTION erısítés kioltás 3D d maximum 1. minimum Airy korong nem felbontott felbontott Az egyik maximuma éppen a másik elsı minimumába esik. AIRY MINTÁZAT OBJEKTÍV NUMERIKUS APERTÚRA OBJEKTÍV NUMERIKUS APERTÚRA APERTÚRA SZÖG (α) az objektív által összegyőjtött fénysugarak félkúpszöge NUMERIKUS APERTÚRA (NA) az optikai lencserendszerek fénygyőjtı képességének egység nélküli mérıszáma az objektív mekkora szögben (α) képes begyőjteni az egy tárgypontból érkezı sugarakat objektív apertúra szöge: α a minta és az objektív közötti közeg törésmutatója: n NA = sin é, sin öé Emlékeztető: Geometriai optika IMMERZIÓS KÖZEG törésmutató: n levegı olaj 1.5 glicerin víz

5 FELBONTÓESSÉG ABBE ELV DIFFRAKCIÓS LIMIT Ernst Abbe ( ) NUMERIKUS APERTÚRA - FELBONTÓESSÉG XY irányban a minta síkjában, 1 2 megvilágítás hullámhossza: λ objektív numerikus apertúrája: NA (NA = n*sinα) Z irányban optikai tengely mentén 2 Annál jobb a mikroszkóp felbontása, minél kisebb d, azaz: megvilágítás hullámhossza: λ apertúra szög: α a minta és az objektív közötti közeg törésmutatója: n Fénymikroszkóp felbontása: d x,y ~ 200 nm és d z ~ 1000 nm 3. KONTRASZT KONTRASZT a tárgynak a leképezés szerinti inhomogenitását erısítjük fel (azt a tulajdonságát használjuk ki, ami megkülönbözteti a környezetétıl) például: OPTIKAI INHOMOGENITÁS miatt fényelnyelés törésmutató alak szín a tárgyon áthaladó FÉNYSUGARAK SAJÁTSÁGAI MEGVÁLTOZHATNAK irány sebesség fázis polarizáltság hullámhossz FÁZIS-KONTRASZT MIKROSZKÓPIA Frits Zernike Fizikai Nobel-Díj törésmutatóbeli eltérések fázisbeli különbségek intenzitásbeli különbségek fényeslátóterő n c fázis-kontraszt technikák: fázis-kontraszt-, differenciál-interferencia kontraszt- (DIC), Hoffman-modulációs kontraszt-, sötétlátóterő-, polarizált fény-, fluoreszcencia- mikroszkópia NA = emberi glia agysejtek egyrétegő kultúrában FÁZIS-KONTRASZT MIKROSZKÓPIA SZTEREOMIKROSZKÓPIA 3D két mikroszkóptubus 14 o 2 objektív + 2 okulár NE KEVERJÜK ÖSSZE A BINOKULÁRRAL!!! sejtmozgás forrás Vic Small Listeria monocytogenes PtK2 sejtben forrás Julie Theriot, Dan Portnoy 14 o két 2D kép (bal - jobb) egy 3D alkalmazás: mikrosebészet aktin hálózat modell rendszerben forrás Bugyi Beáta 5

6 FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA Képalkotás: a mintának a megvilágító fény által kiváltott fluoreszcencia emissziója üvegbıl készült lencsék nem invazív August Köhler: UV mikroszkóp Oskar Heimstadt: fluoreszcencia mikroszkóp FLUOROFÓROK BELSİ (INTRINSIC) FLUOROFÓR: korlátozott klorofil KÜLSİ (EXTRINSIC) FLUOROFÓR: széles spektrális lehetıségek szintetikus festékek kvantum gyöngy fehérje GFP (zöld fluoreszcens fehérje) és változatai Kémiai Nobel-díj: Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Tsien antitest immunofluoreszcencia direkt (target-antitest*fluorofór) Indirekt (target-elısdleges antitest-másodlagos antitest*fluorofór) Emlékeztető: II. félév 2. előadás Fluoreszcencia spektroszkópia FLUOROFÓROK FOTOSZABÁLYOZHATÓ FLUOROFÓROK: speciális alkalmazások STANDARD MIKROSZKÓPVÁZ EPIFLUORESZCENS ELRENDEZÉS DETEKTOR OKULÁR EMISSZIÓS SZŐRİ FOTOAKTIVÁLHATÓ DIKROIKUS TÜKÖR FOTOKAPCSOLHATÓ OBJEKTÍV GERJESZTÉSI SZŐRİ FÉNYFORRÁS MINTA FÉNYFORRÁS SZŐRİK, TÜKRÖK HULLÁMHOSSZTARTOMÁNY ADOTT HULLÁMHOSSZ higanygız lámpa lézer ALULÁTENGEDİ SÁV FELÜLÁTENGEDİ DIKROIKUS SZŐRİ/TÜKÖR xenon lámpa fém halogenid LED TRANSZMITTANCIA (%) HULLÁMHOSSZ (nm) Emlékeztető: I. félév 23. előadás - Lézer 6

7 SZŐRİKOCKA GERJESZTÉS EMISSZIÓ DETEKTOROK - PMT (photomultiplier tube): FOTOELEKTRON SOKSZOROZÓ Albert Einstein Fizikai Nobel-díj vákuumcsı dinódalánc fém elektród anód fotokatód másodlagos emisszió foton e - emissziós szőrı fókuszáló elektróda - + elektromos jel SZŐRİ KOCKA dikroikus tükör gerjesztési szőrı fotoelektromos hatás foton elektron Emlékeztető: I. félév 19. előadás Fényelektromos hatás DETEKTOROK - CCD (charge-coupled device): TÖLTÉS-CSATOLT ESZKÖZ Boyle és Smith megosztott Fizikai Nobel-díj foton e - egymáshoz csatolt kondenzátorok fotoelektromos hatás foton elektron elektromos jel Biofizika 2. Fizika-Biofizika & 05. Dr. Bugyi Beáta -PTE ÁOK Biofizikai Intézet BIOLÓGIA ALKOTÓ TECHNIKÁK ABBE ELV emberi szem MODERN MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK KÖVETELMÉNYEK MIKROSZKÓPIA PET, SPECT MRI, CT, ultrahang optikai koherencia tomográfia (OCT) széleslátóterő, íííííííííííííííí evaneszcens mikroszkópia konfokális mikroszkópia 4Pi, I5M high resolution structured illumination (hrsim) ground state depletion (GSD) saturated structured illumination (ssim) stimulated emission depletion (STED) egyedi molekula lokalizáció (PALM, STORM) közeli mezı optikai mikroszkópia (NSOM) elektron mikroszkópia (EM) térbeli felbontás növelése ( apró objektumok láthatóvá tétele) idıbeli felbontás növelése (gyors folyamatok megfigyelése) behatolóképesség növelése ( deep tissue imaging, szövetek vizsgálata) non-invazív (károsítás nélkül, intravital imaging élı rendszerekben történı vizsgálatok) egyszerre több komponens vizsgálata 7

8 A FELBONTÓESSÉG JAVÍTÁSA A fénymikroszkóp felbontása: Abbe elv, diffrakciós limit Z d z ~ 1000 nm emisszió Y d x,y ~ 200 nm µm VIZSGÁLT SÍK Marvin Minsky elsı konfokális mikroszkóp gerjesztés HÁTTÉRFLUORESZCENCIA AIRY MINTÁZAT X KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA MULTIFOTON MIKROSZKÓPIA EVANESZCENS MEZİ MIKROSZKÓPIA STIMULÁTL EMISSZIÓ (STED) EGYEDI MOLEKULA LOKALIZÁCIÓ (PALM, STORM) KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA ALAPELVEK detektor SZÉLESLÁTÓTERŐ MIKROSZKÓPIA egy sík van fókuszban mégis az összes sík hozzájárul a képhez KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA ALAPELVEK detektor APERTÚRA KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA egy sík van fókuszban APERTÚRA (rés) térbeli szőrés objektív fókuszpontból fókuszponton kívüli fókuszponton kívüli APERTÚRA objektív egy sík járul hozzá a képhez az apertúra kiszőri a többit KONJUGÁLT SÍK KONJUGÁLT FOKALITÁS minta fókuszsík minta fókuszsík apertúra mérete: 1 Airy egység Airy egység:airy korong átmérıje KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA HAGYOMÁNYOS KONFOKÁLIS KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA OPTIKAI SZELETELÉS minta felszeletelése optikai szeletek sok 2D kép összefőzése 3D felbontás hagyományos konfokális XY, nm Z, nm !! pollen autofluoreszcencia 8

9 KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA 4D: 3D + idı tengeri csillag petesejt meiozis kromoszómák aktin mikrotubulusok TIRFM - ALAPELVEK TIRFM TELJES BELSİ VISSZAVERİDÉS - EVANESZCENS MEZİ HAGYOMÁNYOS TIRFM sin é, sin öé exponenciális lecsengés hagyományos TIRFM B16/F1 melanoma sejt ~ Aktin filamentumok exp felbontás hagyományos TIRFM XY, nm Emlékeztető: Optika, Refraktometria gyakorlat Z, nm !! TÖBB-FOTON MIKROSZKÓPIA - ALAPELVEK EGY-FOTON MIKROSZKÓPIA gerjesztés: 1 db foton abszorpció: t = s E = E gerjesztett E alap a foton hullámhossza: λ KÉT-FOTON MIKROSZKÓPIA gerjesztés: 2 db foton E = E gerjesztett E alap a fotonok hullámhossza: 2*λ Feltétele: két foton egyidejő abszorpciója (t = s) kis valószínőség nagy fotonsőrőség lézernyaláb fókuszálása mode-locked lézer (*10 6 fotonsőrőség) Emlékeztető: I. félév 23. előadás Lézer, II. félév. 2 előadás Fluoreszcencia nemlineáris jelenségek 9

10 KÉT-FOTON MIKROSZKÓPIA - ALAPELVEK KÉT-FOTON MIKROSZKÓPIA INTRAVITÁLIS MIKROSZKÓPIA (IVM) Elınyei: Z irányú felbontás növelése deep-tissue imaging: képalkotás mélyebb rétegekben is konfokális: 100 µm két-foton 1000 µm kevésbé károsítja a mintát (alacsony fototoxicitás) képalkotás élı szövetekben, élı állatokban véráram a májban (élı egérben) Dextran (TexasRed) Hepatociták (endogén fluoreszcencia) makorfágok migárciója tumor sejtekben (élı egérben) nukleusz (Hoechst) endocitózis (élı egér májában) Dextran 70 kda (Texas Red) Dextran kda (FITC) Texas Red-Dextran internalizációja a nyálmirigyek sztrómális sejtei által STED - ALAPELVEK FLUORESZCENCIA EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE gerjesztés gerjesztett állapot - fluoreszcencia Stefan Hell nem lineáris le-gerjesztés alapállapot - nonfluoreszcens maradék fluoreszcencia Emlékeztető: I. félév 23. előadás Lézer STED - ALAPELVEK STED fázislemez gerjesztés gyengítés HAGYOMÁNYOS STED gyengítı lézer STED lézer red shift dikroikus tükrök gerjesztı lézer objektív minta Aktin filamentumok felbontás hagyományos STED XY, nm !!!! Z, nm !!!! 10

11 PALM - ALAPELVEK fotoativálható fluorofór Emlékeztető: II. félév 5. előadás Fluoreszcencia mikroszkópia fotoaktiválható fluorofórok PALM felbontás hagyományos PALM XY, nm nm!!! Z, nm nm!!! FRAP PHOTOBLEACHING : fotohalványodás FOTOHALVÁNYODÁS, KIFEHÉREDÉS a fluorofór irreverzibilis fotokémiai destrukciója a gerjesztı fény tönkreteszi a fluoreszcens molekulát HÁTRÁNY: anti-photobleaching oldat (pl. glükóz oxidáz kataláz merkaptoetanol) expoziciós idı csökkentése pulzusszerő gerjesztés alacsonyabb intenzitású gerjesztı fény ellenállóbb fluorofór ELİNY: háttér eliminálása autoquenching FRAP, FLIP FRAP ALAPELVEK elıtte INTENZÍV LÉZERIMPULZUS fluoreszcencia kioltás kioltás visszatérés fluoreszcens molekulák nem-fluoreszcens molekulák fluoreszcens molekulák mobilis nem-fluoreszcens molekulák fluoreszcencia intenzitás visszatérés 50% 50% DIFFÚZIÓ mobilis utána immobilis immobilis idı (t) idı (t) 11

12 FRAP FRAP fluoreszcencia kioltás fluoreszcencia visszatérése LAMELLIPODIUM DINAMIKÁJA Lai és mtsai EMBO Journal 2008 Fluoreszcencia intenzitás kioltás visszatérés 50% mobilis immobilis kioltás visszatérés 50% mobilis immobilis B16-F1 sejt EGFP-aktin idı (t) idı ELEKTRONMIKROSZKÓPIA (EM) Ernst Ruska Nobel-díj képalkotás OPTIKAI - FÉNY fénynyaláb üveg lencsék EM elektronnyaláb elektromágnes hullámhossz, nm felbontás, nm nagyítás 1000 x x ELEKTRONMIKROSZKÓPIA (EM) TRASZMISSZIÓS ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (TEM) áteresztett e - PÁSZTÁZÓ ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM) visszafelé szórt e - rendszámbeli különbségek, nehézatomok másodlagos e - felület topográfiája Auger e - karakterisztikus rtg sugárzás spektruma felület kémiai összetétele SEM TEM NA =