Feloldóképesség Mikroszkópos módszerek. DIC mikroszkópia. Fáziskontraszt mikroszkópia. Barkó Szilvia A MIKROSZKÓPIA RÖVID TÖRTÉNETE

Átírás

1 A MIKROSZKÓPIA RÖVID TÖRTÉNETE Mikroszkópos módszerek Barkó Szilvia 1667: Robert Hooke cellulákat ír le parafában összetett mikroszkóp segítségével. 1674: Antony van Leeuwenhoek élő mikróbákat figyel meg saját maga által csiszolt egyszerű mikroszkóp segítségével. 1873: Ernst Abbé; a felbontóképesség korlátozottságának elméleti felismerése. 1893: August Köhler; kidolgozza a róla elnevezett mikroszkópos megvilágítási technikát. Feloldóképesség Egy fénypont ideális optikai lencsével leképezett képe az Airy disk (elhajlási korong). Két Airy disk éppen elkülöníthető egymástól, ha a köztük levő távolság (d) egyenlő az Airy disk sugarával (r). Feloldható minimális távolság: dmin = 0.61λ/nsinα = 0.611/NA Fáziskontraszt mikroszkópia DIC mikroszkópia Olyan minták esetén hasznos, amelyek megváltoztatják a megvilágító sugárzás fázisát, de egyébként kontrasztszegények (pl. típusos biológiai minta). A minta által diffraktált fénysugarak fáziskésésbe (vagy előnybe) kerülnek a nem diffraktált sugarakhoz képest; ez konstruktív vagy destruktív interferenciát hoz létre, mely kontrasztnövekedésben jelentkezik. 1

2 Az Elektromágneses sugárzás hatása az atomokra A gerjesztő ill. az emittált sugárzás spektrális jellemzői Az epifluoreszcens mikroszkóp Az inverz fluoreszcens mikroszkóp 2

3 FRAP 5 FRAPa Rapid translocation of bleached actin to the cell front). B16-F1 cell expressing EGFP-actin was bleached in the lamella (as indicated by red rectangle), which rapidly translocates to the leading edge, and subsequently travels rearwards with the lamellipodium network. Mazza et al., Biophysical Journal Volume 95 October Photoactivation of actin within the lamellipodium of B16-F1 cell. Cell coexpressing PA-GFP-actin (green) and mrfp-actin (red). Red rectangle (labelled 2 ) marks activation region. 3

4 Movies S6: Live cell wide-field imaging of a COS cell expressing VSVG-GFP (Kinesin-1 cargo) 2 h after shift to the permissive temperature. An image of the acetylated microtubules (red) in the same cell was obtained by fixation and retrospective immunostaining with an antibody to acetylated tubulin. The movie is an overlay of the image sequence of VSVG-GFP vesicles on the image of acetylated microtubules. S7: Live cell wide-field imaging of an HL-1 atrial myocyte expressing Kv1.5-GFP (Kinesin-2 cargo). An image of the total microtubules (red) in the same cell was obtained by fixation and retrospective immunostaining with an antibody to total β-tubulin. The movie is an overlay of the image sequence of Kv1.5-GFP vesicles on the image of total microtubules Movies show two examples of HeLa cells microinjected with 10 ng/μg Cyclin A-Cer and Cdk1YFP with images taken every 4 minutes starting 2hours after microinjection. Images are overlays of the DIC image (greyscale) and the acceptornormallized FRET efficiency (colour). Change of CaspeR3 green fluorescence lifetime upon staurosporineinduced apoptosis. This movie demonstrates that upon staurosporineinduced apoptosis fluorescence lifetime of TagGFP within CaspeR3 changed dramatically, switching from 1.5 ns to 2.5 ns. 4

5 Konfokális mikroszkóp 1. A nem képsíkból eredő nyalábok kiküszöbölése: konfokális elv. A konfokális mikroszkópban egy apertura (konfokális apertura) segítségével takarjuk ki a nem fókuszsíkból eredő fénynyalábokat, így a fénydetektorba csupán a fókuszsíkból eredő nyalábok jutnak A tárgysík szélső területeiről érkező nyalábok kiküszöbölése: pásztázás. Az egész minta helyett a minta egy pontját világítjuk meg. A pásztázás gyakorlati megoldási lehetőségei: a. Mintaasztal mozgatása. Lassú, pontatlan, nem használatos b. Nipkow korong c. Pásztázás lézernyalábbal. Manapság ez a legelterjedtebb A konfokális mikroszkóp típusai: 1. Tandem pásztázó mikroszkóp (Tandem scanning microscope, TSM) 2. Konfokális lézer pásztázó mikroszkóp (Confocal laser scanning microscope, CLSM) 3. Dekonvoluciós konfokális mikroszkóp (Deconvolution Confocal Microscope). A mikroszkópos kép nem kivánatos részeit dekonvoluciós algoritmusok segítségével távolítjuk el A konfokális mikroszkóp előnyei A hagyományos mikroszkópokkal szemben a konfokális mikroszkóp elõnyei a következõk: a) jobb felbontású képek készíthetõk; b) képes kiszûrni a fókuszsíkon kívülrõl eredõ fényt, így a képek kontrasztosabbak és kevésbé elmosódottak; c) az "optikai szeletelés" és a számítógépes adatfeldolgozás segítségével vastag minták 3-dimenziós struktúrái is feltérképezhetõek. 5

6 6