Fény- és fluoreszcens mikroszkópia. Szuperrezolúciós mikroszkópia

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Fény- és fluoreszcens mikroszkópia. Szuperrezolúciós mikroszkópia"

Adél Biróné
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 Fény- és fluoreszcens mikroszkópia Szuperrezolúciós mikroszkópia

2 Szuperrezolúció: nanométeres mérettartomány hagyományos fénymikroszkópia: l és NA által limitált felbontás Resolution x,y = λ / 2[η sin(α)] (~ nm) Resolution z = 2λ / [η sin(α)] 2 (~ nm) fénymikroszkópos szuperrezolúció : x, y, z febontás egyaránt ~ nmes nagyságrendben (3-7x növelés) elméleti lehetőségek a felbontás növelésére: 1. l csökkentése - gerjesztés elektronnyalábbal TEM, SEM (transmission/scanning electron microscopy) introduction.html

~50-100 nmes nagyságrendben (3-7x növelés) elméleti lehetőségek a felbontás növelésére: 1.

3 Szuperrezolúció: nanométeres mérettartomány elméleti lehetőségek a felbontás növelésére (folyt.): 2. nagy felbontású minta-scannelés (scanning probe / tunelling microscopy) 2-5 nm (z); 20 nm (xy) AFM (atomic force microscopy) near-field scanning optical microscopy (NSOM v. SNOM) - a minta a gerjesztő fény l-nál közelebbi távolságon belül vizsgált: evaneszcens hullámok detektálása - csak felszíni detekció 3. PSF méretének módosítása ( far field ) z sík: 4Pi / I 5 M (2 objektív lencse) STED (stimulated emission depletion) GSD (ground state depletion) SSIM (saturated structured illumination microscopy) 4. egyedi molekula detekció és lokalizáció ( far field ) PALM (photoactivated localization microscopy ) STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) FPALM (fluorescence photoactivation localization microscopy)

SNOM) - a minta a gerjesztő fény l-nál közelebbi távolságon belül vizsgált: evaneszcens hullámok detektálása - csak felszíni detekció 3.

5 TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) nem szuperrezolúció, de határfelszínek (ld. sejtmembrán) közeli detekcióra (max nm mélyen) jó eltérő törésmutatójú határfelszínek: kritikus beesési szög alatt teljes visszaverődés + evaneszcens fény az alacsonyabb törésmutatójú közegben közeli molekula gerjesztése nagy beesésszögű lézerfény: prizmával vagy nagy NA-jú (>1.4) objektívvel /tirf/tirfintro.html

visszaverődés + evaneszcens fény az alacsonyabb törésmutatójú közegben közeli molekula gerjesztése http://www.olympusmicro.

6 TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy)

7 4Pi / I 5 M mikroszkópia z felbontás 3-7x növelése (nem igazán szuperrezolúció...): ~ 100 nm 4Pi: 2 egymással szemben elhelyezett objektív, ugyanabba a síkba fókuszálva -> koherens megvilágítás (lézer) és emittált fény detektálás; konfokális pinhole gerjesztési és detekciós térszög növelése (1 objektívre ez max. 2p (bár igazán csak ~1.3p, azaz ~140 ) -> 2 objektívre 4p) /introduction.html I 5 M (incoherent-illumination imaging microscopy / image interference microscopy): 2 egymással szemben elhelyezett objektív, ugyanabba a síkba fókuszálva -> inkoherens, interferencián alapuló widefield megvilágítás, z síkok váltása lényeg: standing wave microscopy interferencia a kapott kép megjelenítése csak dekonvolúciós elemzés után (PSF side lobe)

térszög növelése (1 objektívre ez max. 2p (bár igazán csak ~1.3p, azaz ~140 ) -> 2 objektívre 4p) http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution /introduction.

8 A diffrakciós határ áttörése RESOLFT: reversible saturable (or switchable) optical fluorescence transitions reverzibilis fotoswitching a fluoreszkáló on és a sötét off állapot között: - STED: S 0 / S 1 singlet gerjesztési állapot - GSD: S 1 singlet és sötét triplet állapot - reverzibilisen fotokonvertálható molekulák (Cy5, kindling, Dronpa): PALM, STORM az adott gerjesztési állapot valószínűsége fordított exponenciális arányban áll a gerjesztési intenzitással szaturációs intenzitás: az a gerjesztési intenzitás, aminél a fotoswitching (adott valószínűséggel) állapotváltás lezajlik az adott állapot életidejével fordítottan arányos /introduction.html ha a gerjesztési > szaturációs intenzitás -> fotoswitching reakció hosszú (gerjesztési) életidő -> jobban variálható gerjesztési / szaturációs intenzitások

fordított exponenciális arányban áll a gerjesztési intenzitással szaturációs intenzitás: az a gerjesztési intenzitás, aminél a fotoswitching (adott valószínűséggel) állapotváltás lezajlik az adott

9 A diffrakciós határ áttörése RESOLFT: reversible saturable (or switchable) optical fluorescence transitions a gerjesztő, ill. a depléciós megvilágítás intenzitása eltér: /introduction.html - STED: az S 1 -> S 0 kikapcsoláshoz igen nagy energia kell - GSD / fotokonverzió: az S 1 -> T kikapcsoláshoz v. a metastabil sötét állapot bekapcsolásához sokkal kevesebb energia is elég! egyedi molekula detekció (PALM, STORM): kisebb energia, de sztochasztikus aktiváció nem könnyű megfelelő fluorokrómokat kiválasztani: nagy intenzitás erős bleaching

html - STED: az S 1 -> S 0 kikapcsoláshoz igen nagy energia kell - GSD / fotokonverzió: az S 1 -> T kikapcsoláshoz v.

10 STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia psec pulzus gerjesztő / depléciós lézerek STED lézer: fázismoduláció -> lyukas fánk depléciós minta (250 MW/cm 2!) -> fluoreszcencia nélküli visszatérés az S 0 állapotba -> PSF redukció a megmaradt fluorokrómoknál

) -> fluoreszcencia nélküli visszatérés az S 0 állapotba -> PSF redukció a megmaradt

11 Donut Mode for Depletion Excitation Beam Depletion Beam Result + = In focal point ZOOM

12 Depletion Beam direction Reception of photons through the pinhole Emission of excited photons Direction of emission of photons depleted

13 STED depléciós lézer

14 STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia feltételek: a fluorochróm a depléciós hullámhosszon ne gerjesztődjön fotostabilitás mindkét hullámhosszon igen ritka Triplet-átmenet gyenge photobleaching (legyen reverzibilis!) piko/femtoszekundum pulse lézerek < 20 nm (x, y) és ~40-50 nm (z) felbontás

hullámhosszon igen ritka Triplet-átmenet gyenge photobleaching (legyen

15 STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia

16 STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia x-y mellett már Z síkban is alkalmazható a depléció: STED 3x

17 Confocal STED Examples 40nm beads

18 Examples neurons CONFOCAL STED Actin microfilaments of dendritic spines in culture Olivier thoumine and ph Legros.

19 Examples Chromosomes Immunomarquage de la protéine Sycp3 sur spermatocytes de souris au stade pachytène Bernard de Massy et julien Cau UPR 1142 CNRS Institut de Génétique humaine, équipe Méiose et recombinaison, Montpellier et BIC

Massy et julien Cau UPR 1142 CNRS Institut de Génétique

20 PALM (photoactivated localization microscopy) egyedi molekulák lokalizációja nm-es felbontással, ha - elegendő foton gyűjthető - ritka molekulák (<100/mm 2 ) - ~200 nm-es körzetben nincs más emittáló molekula - kis hányad fluoreszkál átfedő PSF-ek is elkülöníthetőek, ha az egyik szignál kioltható több cikluson át: sztochasztikus és kis arányú gerjesztés (alacsony gerjesztési lézer intenzitás) -> képrögzítés -> aktivált fluorochrómok photobleachelése gyak. hagyományos mikroszkópokon is alkalmazható, EM-CCD kamerával (single foton detekció) a jó SNR-hez nagy kontrasztú, fotoaktiválható molekulák kellenek gyakran TIRF mikroszkópiával kombinálva

sztochasztikus és kis arányú gerjesztés (alacsony gerjesztési lézer intenzitás) -> képrögzítés -> aktivált fluorochrómok photobleachelése gyak.

21 PALM (photoactivated localization microscopy)

22 PALM (photoactivated localization microscopy) Molecules Off (inactive) Technique à très haute résolution microscopie PALM: Photoactivation Localization Microscopy Activation Photoconversion Acquire Localisation Reconstruction before after Single Molecules On Bleach 15 Molecules Molecules Off Reconstruction 35 Molecules wavelength Absorption Emission Activation Acquire Single Molecules On Localisation Reconstruction 100 Molecules Bleach Molecules Off 7000 Molecules

23 PALM (photoactivated localization microscopy) fluorochrómok mérete és sejten belüli penetrációja korlátozó tényező -> ált. membrán-fehérjék extracelluláris nyomonkövetése szintetikus festékek (Alexa, Atto, Cy) jelölésre jók, de fotoaktivációjuk élő sejtekre toxikus

24 STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) dstorm (direct stochastic optical reconstruction microscopy) PALMIRA (PALM with independently running acquisition) gyakorlatilag azonos elv, más technikai megvalósítás / gyártó on/introduction.html erresolution/stormintro.html

25 STED és STORM összehasonlítás

26 STED depléciós lézer

Hasonló dokumentumok

Fény- és fluoreszcens mikroszkópia. Optikai szeletelés

Fény- és fluoreszcens mikroszkópia Optikai szeletelés Widefield mikroszkópia Z Focal plane Z Focal plane Widefield mikroszkópia vs optikai szeletelés http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/opticalsectioning/confocalwidefield/index.html