Mérımódszerek a kalcium homeosztázis vizsgálatában

Átírás

1 Mérımódszerek a kalcium homeosztázis vizsgálatában Bányász Tamás A Kalcium homeosztázis vizsgálatának célja Sejtmembrán Kalcium szignalizáció Koncentráció (mennyiség) Kontraktilis rendszer 1

2 A kalcium koncentráció mérésének módszerei Iontartalom meghatározások Izotópvizsgálatok Ca szelektív elektródák Festékek Indirekt módszerek Iontartalom meghatározások Inkább csak történeti jelentısége van A szövetek össz-iontartalmát határozta meg (múlt idı!!!!) Szövetminta nyerése Nedvessúly mérés Súlyálandóságig szárítás 104 C-on Szárazsúly mérése Roncsolás H 2 O 2 -vel vagy HNO 3 -al, ismételt beszárításokkal Feloldás ismert térfogatú deszt. Vízzel Koncentráció meghatározása (lángfotométer, v. Atomabszorbciós módszerrel) Visszaszámolás Gyakorlatilag nem volt alkalmas a kalcium dinamikájának vizsgálatára 2

3 Izotóp vizsgálatok Ca 45 Gyors felezési idı (163 nap) Kis energiájú β - sugárzás, bonyolult detekciós eljárásokkal (általában szcintillációs technika) Alacsony biztonsági fokozatú izotóplabort igényel A kalcium ion mindenhova kötıdik (eszközök, edények fala) ami miatt mindent összekoszolt Hatalmas háttér apparátust igényel a biológiai probléma kezelésén túl (az egyetemeknek külön központi izotóp laboratóriuma volt) Felvételi és leadási görbék vizsgálata Izotóp felvételi görbe Hideg szövetet inkubálunk forró közegben Az inkubációs idıt a vizsgálati cél határozza meg, de (technikai okok miatt) pár percnél nem lehet rövidebb és egy-másfél óránál nincs értelme hosszabbat tervezni Párhuzamos minták szolgálnak a felvétel idıfüggésének vizsgálatára (hatalmas mennyiségő szövet és izotóp felhasználása, minta kisérletenként) A felvételi idı végén hasonlóan járunk el mint az össz-iontartalom meghatározásnál (nedves súly, száritás, száraz súly, roncsolás...stb) Eredmény: multiexponenciális felvételi görbe kompartment analízis. Alkalmazás Szöveten gyakorlatilag a membránon át történı transzportsebesség vagy a kalcium raktárak hosszú léptékő változását mérhette. Viszonylag jól mérte a pumpa sebességet hosszú idı átlagában Vezikula preparátumon transzportsebesség mérésére ma is alkalmazható... lenne, de a festékek használata technikailag egyszerübb. 3

4 Izotóp leadási görbe Feltöltés után a forró mintát inkubáljuk hideg oldatban Egy szövetmintához több mosóoldat adja a kimosás idıfüggésének pontjait A mosóoldatok kezelése technikailag lenyegesen egyszerübb mint a szöveté (nem kell száritani, roncsolni, közvetlenül mérhetı) Eredmény: multiexponenciális leadásii görbe kompartment analízis. Alkalmazás: lásd felvételi görbék Kalcium szenzitív elektródák A módszer A mérés alapelve a ph mérés elvével egyezik meg Míg nagy méretekben (pl klinikai laborban vérplazmában meghatározni millimolaris koncentrációjú kalciumot) a technika rendkívül robosztus, a sejten belüli alkalmazása rengeteg technikai problémával jár. (Mikroelektród technika plusz ionszelektív elektródák módszere) Házi gyártmányú, nagy ellenállású mikroelektródákat, egyedi kalibrálással kell készíteni. Elınyei: Sejten belüli mérést tesz lehetıvé Másodpercnél kisebb idıfelbontás (response time<100ms) 100 nm/l-t megközelítı érzékenység Hátrányai: Rendkívül munkaigényes (napi két rekord már jó eredmény) Nagy mérési bizonytalanság A membránpotenciál változás miatt a mért érték korrekciója szükséges (TEVC, illetve double barrell electrodes) Egyéb jelenlévı ionok zavaró hatása A soros ellenállás változása a hegy elszennyezıdése miatt 4

5 FIG. 1. Fabrication and testing of concentric ion-selective microelectrodes (ISMs) Fedirko, N. et al. J Neurophysiol 96: ; doi: /jn Copyright 2006 The American Physiological Society FIG. 2. Use of concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes in a rat hippocampal slice Fedirko, N. et al. J Neurophysiol 96: ; doi: /jn Copyright 2006 The American Physiological Society 5

6 Ca szelektiv elektróda paraméterei Amplitude, ph Time to peak, ms Half-Time to Peak, ms Half-Time Decay, ms Conventional ± ,111 ± ± 87 2,428 ± 234 Concentric 0.04 ± 0.01 * 399 ± 36 * 186 ± 16 * 813 ± 102 * Amplitude, Ca, mm Time to peak, ms Half-Time to Peak, ms Half-Time Decay, ms Conventional ± ± ± 47 1,974 ± 294 Concentric 0.18 ± 0.03 * 365 ± 23 * 197 ± 10 * 860 ± 67 * 6

7 Festékek Müködési elv Alkalmazás A fluorescencia jelenségérıl általában Jablonsky diagramm Az excitációs hullámhossz nem befolyásolja az emisszió spektrális tulajdonságait, csak az intenzitását Az oldószer (közeg) módosítja az emisszió spektrális tulajdonságait Badan in: 1. Toluene 2. Chloroform 3. Acetonitrile 4. Ethanol 5. Methanol 6. Water Méréstechnika átfedı spektrumok esetén (nagy érték az intenzitás) 7

8 Festékek jellemzıi Spectrum Photobleaching Na mégegyszer!!!!!! Az oldószer (közeg) módosítja az emisszió spektrális tulajdonságait Vannak olyan festékek amelyek spektrális tulajdonságai a közeg kalcium koncentrációjának függvényei 8

9 Két klasszikus kalcium érzékeny festék Indo-1 Fura Single vawelength versus ratiometric methods Mik változtatják meg a fluorescencia intenzitását mérés közben? Photobleaching Ha változik a sejt Pozíciója Alakja 9

10 Single vawelength versus ratiometric methods R=I 1 /I 2 I 1 I 2 ( ) R Rmin i C Kd B := i ( R Rmax i ) Hullámhosszkijelzık Felsı monokromátor kijövı rés Felsı monokromátor bemenı rés Monokromátor rés állítók Felsı monokromátor Alsó monokromátor Disc Tükör elmosódva Alsó monokromátor kijövı rés Alsó monokromátor bemenı rés 10

11 Chopper versus bifurcation cable A festékek használata 11

12 Isolated cardiac myocyte A festék sejtbejuttatásának módja Mikroinjekció AM forma 12

13 Principle of epifluorescent measurement Microscope for epifluorescent measurement 13

14 Calcium Transients measured in mammalian cardiac cell Confocal microscopy 14

15 Marvin Minsky Fig.2 Z-line L~2 m RyR labeling T-tubule labeling 15

16 A. Longitudinal axis B. Transverse axis T L C. Frequency Frequency Longitudinal z-line spacing (µm) D. Frequency Number Transverse spacing distances spacing (µm) ( (µm) E. CRU spacing (µm) Control tissue Longitudinal ** SHR-HF tissue Control cell ** SHR-HF cell Transverse * SHR-HF cell Control cell 16

17 Spark analysis x-y image Elementary calcium release events on mammalian muscle line scan image 20 µm 30 mm thymol control 400 ms 512 p 73.1 um 2 F 0 17

18 ECRE under control conditions spark ember F 0 3 F ms trailing ember leading ember 250 p Total Internal Reflection Fluorescence Microscope (TIRFM) Probléma 1.: 18

19 Total Internal Reflection Fluorescence Microscope (TIRFM) Probléma 2.: tárgy kép A megoldás: teljes visszaverıdés 19

20 1. Specimen 2. Evanescent wave range 3. Cover slip 4. Immersion oil 5. Objective 6. Emission beam (signal) 7. Excitation beam A háttér zajának csökkentése TIRFM-el 20

21 Kontasztfokozás TIRFM -el Izolált, dobogó szív, szövetek 21

22 A mérırendszer Gyakorlatilag epifluorescens jelet mérünk Indirekt módszer: I Na/Ca mérése C caffeine R-indo I-NCX (pa) s 22

23 Ca homeosztázis módositasa Diffúzibilis/non Diffúzibilis Ca pufferek (BAPTA) Caged calcium/puffer Modellezés 23

24 Tematika A kalcium homeosztázis vizsgálatának célja A Calcium koncentráció mérésének módszerei Iontartalom meghatározások Izotópvizsgálatok Ca szenzitiv elektródák Festékek Története A festékek mőködési módja Single wavelength Ratiometric A festékek használata Single cell Szövet-szerv Indirekt módszerek: INa/Ca Caged Calcium/Buffers Modellezes 24