Lumineszcencia. Dr. Vámosi György

Átírás

1 Lumineszcencia Dr. Vámosi György

2 Lumineszcencia Lumineszcencia: gerjesztett molekulák fényemissziója a hőmérsékleti sugárzáson kívül, hideg emisszió Fluoreszcencia: szinglet-szinglet átmenet Foszforeszcencia: Triplet-szinglet átmenet ( tiltott ) Gerjesztés módjai: fotonabszorpció (fotolumineszcencia) kémiai reakció (kemilumineszcencia) biokémiai reakció (biolumineszcencia) radioaktív bomlás energiája (radiolumineszcencia) Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettős kötéseket tartalmazó gyűrűkkel rendelkeznek

3 A lumineszcencia molekulaszerkezeti értelmezése: Jablonski diagram Vibrációs relaxáció: a vibrációs energia hővé alakul Kasha-szabály: a fluoreszcencia emisszió az első gerjesztett állapot legalacsonyabb vibrációs szintjéről történik. (10-16 s) belső konverzió (k ic ) intersystem crossing S T (k isc ) triplet állapot (T): két e - spinje párosítatlan, eredő spin=1 fluoreszcencia: nem jár spinátfordulással, gyors ( s) Intersystem crossing (isc) és foszforeszcencia: egy elektron spinje átfordul, elsőrendben tiltott átmenet, lassú ( s) szinglet állapot (S): minden e - spinje párosított, eredő spin=0 (10-12 s) belső konverzió: sugárzásmentes átmenet

4 Élő sejtek saját fluoreszcenciája I. aromás aminosavak: triptofán, tirozin, fenilalanin. Q: 0,02-0,3 nagy mennyiség fluoreszcens metabolitok: NAD(H), NADP(H), FAD, piridoxál származékok (B6 vit.), ösztrogén hormonok, stb. Q: 0,06-0,4 közepes mennyiség biolumineszcencia: luciferin/luciferáz + ATP hf

5 Élő sejtek saját fluoreszcenciája II. zöld fluoreszcens protein (GFP): Ser65 Tyr66 β-redős szerk. (11) kromofór Gly67 MW=27 kda Aqueora victoria

6 Fluoreszcens fehérjék spektrumai (R. Tsien) Kék Cián Zöld Sárga Vörös

7 Fluoreszcens fehérjék mutációkkal létrehozott variánsai (R. Tsien)

8 Biomolekulák fluoreszcens jelölése I. Fehérjék Fehérjék direkt módosítása festékkel: Lys, Arg oldalláncok amino (NH2)-csoportja, Cys tiol (SH)-csoportja reaktív csoportot (izotiocianát, szukcinimidil észter, ill. maleimid) tartalmazó festékkel jelölhető. Pl. FITC: fluoreszcein-izotiocianát festék-n=c=s + NH 2 -prot festék-nh-c-nh-prot S Jelölés fluoreszcensen jelzett toxinokkal: falloidin (F-aktin) β-skorpiótoxin (fesz. függő K-csatorna), α-bungarotoxin (acetilkolin receptor) Transzfekció GFP-vel fuzionált fehérjét kódoló DNS vektorral a sejt maga termeli a fluoreszcens fehérjét Piros: rodamin-falloidin (aktin filamentumok) Zöld: epidermális növekedési hormon receptor + GFP

9 Jelölés specifikus antitestekkel (immunfluoreszcens, immunhisztokémai jelölés) Epitóp Antigén kötő rész (variábilis régió) Antitest Antigén Az antitest nagy affinitással és specificitással kötődik az általa felismert molekula felszínhez (epitóphoz). Fab Fc Könnyűlánc Nehézlánc Monoklonális antitest: egyetlen epitóphoz kötődik Poliklonális antitest: különféle szomszédos epitópokhoz kötődő antitestek keveréke Direkt jelölés: az antitesthez fluoreszcens festék van kötve Indirekt jelölés: az elsődleges antitest jelöletlen, az első ellen irányuló, másodlagos antitest van megjelölve. Utóbbi ált. poliklonális erősítés Példák klinikai és biológiai felhasználásokra: vérsejtek felszínén megjelenő antigének diagnosztikai célú kimutatása, expressziós szintjének mérése, különféle sejtfelszíni antigéneket kifejező (pl. CD4+, CD8+) sejtek mennyiségének meghatározása hormonok, virális és bakteriális antigének, egyéb kis mennyiségben előforduló anyagok kimutatása vérből sejtfelszíni fehérjék lokalizációjának, mintázatának, asszociációinak, mobilitásának vizsgálata fluoreszcencia spektroszkópiás és mikroszkópiás módszerekkel

10 Immunfluoreszcens jelölés: target sejt ölősejt kölcsönhatás MHC I (Alexa 488) Kv1.3 ioncsatorna (Alexa 546) Target sejt Ölősejt (CTL) CD8 (Cy5)

11 Nukleinsavak: szelektíven jelölhetők nem kovalensen kötődő festékekkel Interkaláció: beékelődés két szomszédos bázispár közé pl. propidium-jodid (PI), etidium-bromid (EtBr), daunomicin, akridin narancs (AO) Kötődés a DNS kis v. nagy árkához pl. DAPI, Hoechst: kis árok Elektrosztatikus kötődés a negatív foszfátcsoportokhoz (egyszálas RNS-re jellemző) Felhasználás: DNS sávok megjelenítése gél elfo. után EtBr-dal életképesség mérése: PI számára az ép sejtmembrán nem átjárható. DNS/RNS tartalom mérése, sejtciklus analízis: AO + kétszálas nukleinsav: zöld (interkaláció), AO + egyszálas nukleinsav: vörös fluoreszcencia (elektrosztatikus kötődés)

12 Nukleinsavak jelölése Antiszensz DNS oligonukleotid sejtmag sejtmembrán Tárkányi és mtsai, 2005

13 Szekvencia specifikus nukleinsav próbák A cél egyes génszakaszok meglétének, kópiaszámának vizsgálata, a belőlük átírt mrns jelenlétének és mennyiségének meghatározása. A specifikus kötődést a próba és a kimutatandó szekvencia komplementer volta biztosítja. Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH): (a) a kimutatni kívánt génszakasszal homológ, fluoreszcensen jelölt v. jelölhető (biotinált) oligo-nukleotidokat juttatnak a sejtbe (b) a DNS-t denaturálják (egyszálas) (c) a renaturáció során a bázispárosodás nagyobb valószínűséggel jön létre a nagyobb koncentrációban jelenlévő próba és a gén vele komplementer szakasza, mint a gén eredeti komplementer szálai között (d) a jelölésre alkalmas próbához festéket kapcsolnak (biotinált DNS - avidin - biotinált festék) (e) a keresett, fluoreszcensen megjelölt DNS szakaszok elhelyezkedése mikroszkóppal vizsgálható

14 Fluoreszcens jelölők méretarányai Fluoreszcein Biotin Streptavidin Qdot TM IgG GFP Forrás: Fehérjék - MMDB, Qdot TEM-képe - összeállította: Lengyel R.

15 A félvezető nanokristályok Forrás: Shimon Weiss: Single Molecule Spectroscopy and Imaging Óravázlat

16 A Qdot TM streptavidin konjugátum szerkezete Forrás: Qdot Streptavidin Conjugates User Manual - Quantum Dot Corporation

17 Működés CdSe mag ZnS héj Mag felületi csapdáinak kiküszöbölése A gerjesztést a magba zárja A héj a QY-et ~80%-ra növeli.

18 Színkép Forrás: Qdot Streptavidin Conjugates User Manual - Quantum Dot Corporation

19 Színkép Széles abszorpciós spektrum Keskeny emissziós spektrum (FWHM=30-40 nm) Mérettől függő em. maximum Forrás: Chan WC et al. Curr Opin Biotechnol 13,40 (2002. Febr.) Han et al. Nat Biotechnol 19,631 (2001.)

20 Fotostabilitás - összehasonlítás Felső sor Alsó sor Sejtmag QD 630 streptavidin Alexa 488 anti-mouse IgG Mikrotubulusok Alexa 488 anti-mouse IgG QD 630 streptavidin 100 W Hg gőz lámpa; 100x, 1.3 NA immerziós objektív Sejt: 3T3 Forrás: Wu X. et al., Nat Biotechnol. 21,41 (2003. Jan.)

21 Ultrahigh resolution colocalization" Pixel méret: 50 nm Thilo D. Lacoste, Xavier Michalet, Fabien Pinaud, Daniel S. Chemla, A. Paul Alivisatos, and Shimon Weiss Ultrahigh-resolution multicolor colocalization of single fluorescent probes PNAS August 15, 2000 vol. 97 no

22 "Time-Gated Imaging" Fluoreszcencia élettartam: ns Autofluoreszcencia: néhány ns 1. Mouse 3T3 sejt 2 % formaldehid, 0,5% glutáraldehid Impulzusos gerjesztés, házi konfokális mikroszkóp 1. Összes foton ns - 65 ns közötti foton Jel/zaj arány 15-szörösére nőtt. Forrás: Michalet X. et al. Single Mol. 2,261 (2001.)

23 Sejt mozi Q dottal Epidermális növekedési faktor receptor - GFP (zöld) EGF - quantum dot (piros) mozi: EGF kötődése és internalizációja erbb3 receptor citrin (zöld) EGF quantum dot (piros) mozi: EGF transzportja a filopódiumok mentén (D. Liedke, Nagy P. és mtsai, Nature Biotechnology 2004)

24 Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) Sugárzás nélüli energiaátadás két festék, a donor (D) és az akceptor (A) molekula között, dipólusdipólus kölcsönhatás révén. (Theodor Förster, 1948) k t D A D A D A D A Feltételek: a D emissziós és az A abszorpciós spektrumának átfedése, 2-10 nm távolság, D és A megfelelő relatív orientációja. Érzékeny távolságfüggés: 1 E = k t + k f k + k t ic + k isc = +... (k t : a FRET sebességi állandója) R R0 + R 6 = 1 R 1+ R E 0, R/R 0

25 Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) Felhasználás: spektroszkópiai vonalzó, inter- és intramolekuláris távolságok meghatározása molekulák közti asszociáció kimutatása molekulaszerkezet, konformáció vizsgálata. Mérése: D fluoreszcenciájának csökkenéséből E = 1-F DA /F D A fluoreszcenciájának növekedéséből D élettartam csökkenéséből. D fotokioltás időállandójának növekedéséből E = 1-τ DA /τ D E = 1-τ DA /τ D D fluoreszcencia anizotrópia növekedéséből. E = 1-(r 0 /r DA -1)/(r 0 /r D -1)

26 Akceptor fotokioltásos Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (apbfret) hν hν D FRET A hν A D donor akceptor E = 1+ 1 ( R R ) 6 0

27 Akceptor fotokioltásos Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (apbfret) hν hν D FRET A A D donor akceptor E = 1 F / F DA D

28 Interleukin-15 receptor α és Interleukin-2 receptor α alegység molekuláris asszociációja IL-15Rα IL-2Rα átfedés 0 100% FRET <E> ~ 17% pixelszám FRET hatásfok (%)

29 Sejtenkénti FRET mérés áramlási citométerrel: nincs szubcelluláris feloldása, de jó a statisztikája Négy fluoreszcencia intenzitás: Autofluoreszcencia Donor csatorna FRET csatorna Akceptor csatorna FL1(488,530) FL2(532,580) = = AF + FL3(532, > 670) = FL4(633, > 670) = I AF B D 2 + AF B AF B (1 E) S 3 4 I D + I + I (1 E) D A 5 (1 E) S 1 + I A S 2 + I D E α (1) (2) (3) (4) Átvilágítás: Jelöletlen minta FL2 FL3 B 2 =, B3 =, B4 = FL1 FL1 FL4 FL1 Donor minta FL3 S 1 =, S5 = FL2 α = FL3 FL2 A D FL1 FL2 L L D A ε (532) ε (532) D A Akceptor minta S = 2 FL3 FL4 E minden sejtre

30 Sejtszám FRET hatásfok (%)

31 Receptor mintázatok Kit225 K6 Kit225 IG3 Hut102B2

32 Fotokromizmus Donor: Lucifer yellow Diheteroarylethene vegyületek fénnyel átkapcsolható akceptorok fotokromikus FRET méréshez (pcfret)

33 Fotokromizmus Fénnyel indukálható, spektroszkópiai tulajdonságokat változtató átmenet. Néhány foton abszorpciója kiváltja az átmenetet Reverzibilis nm nm Ki-bekapcsolható FRET akceptorként alkalmazható Önkontrollos FRET mérést tesz lehetővé E = 1-F DA /F D

34 Specifikus nukleinsav szekvenciák detektálása molekuláris fáklyákkal (molecular beacon) riporter festék (FRET donor) kioltó (nem fluoreszcens FRET akceptor)

35 Allélek, pontmutációk detektálása FRET-tel monitorozott DNS denaturációval (Herpes simplex vírus)

36 A próba a HSV-1-gyel komplementer magasabb Tm

37 Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia 0,3 µm 1,5 µm A vizsgálandó molekula (fehérje, lipid, stb.) fluoreszcens jelölése Kicsiny, <1µm 3 -es térfogat megvilágítása fókuszált lézernyalábbal A fluoreszcencia időbeli változásának detektálása érzékeny fotodetektorral A jelenlévő molekulák száma kicsi az ingadozás relatív értéke jelentős

38 Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS) V 0.25 fl megvilágított térfogat F(t) time

39 FCCS setup Malte Wachsmuth & Michael Tewes

40 A fluktuáció analízis elve A fluoreszcensen jelölt molekula fotonokat emittál, míg a lézer által megvilágított térfogatelemen áthalad Az időegység alatt kibocsátott fotonok száma függ A molekulaszámtól (konc.) megvilágított folt méretétől (instrumentális paraméter) a kvantumhatásfoktól (a festék tulajdonsága) Az ingadozás kinetikája függ a diffúziós időtől (D, MW)

41 A fluoreszcencia időfüggéséből... G( τ ) = δf ( t) δf ( t F 2 + τ ) = T 0 δf ( t) δf ( t F 2 + τ ) dt δf(t) τ D idő...kiszámítható az autokorrelációs függvény G(τ)... Amit a fluoreszcencia intenzitást befolyásoló molekuláris folyamatok dinamikus paraméterei határoznak meg: G(τ) G(0) ~1/N a detektálási térfogatban lévő molekulák átlagos száma, N a diffúziós korrelációs idő, τ D, ami fordítottan arányos a diffúziós állandóval aggregáció foka (fluoreszcencia/molekula F/N) τ = D ω 2 xy 4D τ fotofizikai időállandók, stb.

42 A fluoreszcencia ingadozás időfüggése: δf(t) δf( t) = F( t) F T 1 F = F( t) dt T G( τ ) = 0 t D A fluoreszcencia időbeli autokorrelációs függvénye: δf ( t) δf ( t F 2 pillanatnyi ingadozás átlagos intenzitás + τ ) = T 0 δf ( t) δf ( t F 2 t + τ ) dt G(0) G(τ) t D τ t<<t D : δf( t) δf( t + τ ) > 0 t>>t D : δ F ( t) δf( t + τ ) > < 0 ( ) ( ) 2 2 (0) (0) 2 (0) F N f N N N N δf δn f δn σn N G(0) = = = = = = N(0) Poisson-eloszlást követ szórásnégyzete σ 2 = λ = N

43 Egyetlen molekula detektálását lehetővé tevő érzékenység 5 Fluoreszcencia fluktuáció 4 I (khz) time (seconds) 4 Autokorrelációs függvény N = 1/G(0) ~ 0.3 G(t) 2 τ ~ 200 ms time (milliseconds)

44 Fluoreszcencia intenzitás változással járó folyamatok kinetikájából származó korreláció additívan szeparálható a diffúziós korrelációs függvénytől: fotofizikai folyamatok: triplet átmenet, sötét komplex keletkezése kémiai folyamatok: kötődés és disszociáció) ( δfdiff (0) δfdiff ( τ) ) ( δf (0) δf ( τ) ) kin kin G ( τ) = + = G ( τ) ( τ) 2 2 diff + Gkin F F Triplet G(τ) G( τ ) = 1 N 1 1+ τ τ D 1+ 1 τ 2 S τ D Parameters: N=1 τ D =100 µs τ T =2 µs S=7 T + 1 T e τ τ tr Bimolekuláris reakció: DNS + L G k + D + L DL k - bim = 1 τ /τ N c D 1 K A e bim Triplet fraction 0 % Triplet fraction 20 % Triplet fraction 60 % τ bim ( c k ) 1 D = k E τ [ms] (c L <<c D )

45 Többkomponensű rendszerek: az egyes komponensek hozzájárulása a G-hez a Q i részecskénkénti fluoreszcencia négyzetével arányos. (Y i : molekuláris hányad) G( τ ) = 1 N' = i N w i i 1 YQ i 1 1+ τ τ i i 2 i 1 1+ YQ i τ 2 S τ i 2 i 1 1+ τ τ i 1,9 1, τ 2 S τ i 1/N = 1,5 N = 1/G(0) mindig felülbecslése a tényleges molekulaszámnak, ha Q i -k különböznek. G(τ) 1,3 1,1 0,9 τ free τ bound τ [ms] 0,01 0,

46 Milyen kölcsönhatások vizsgálhatók? Fehérje - DNS Nukleinsavak hibridizációja Antigén - Antitest Receptor Ligandum kötődés

47 Kalibráció G( τ ) = 1 N 1 1+ τ τ D 1+ 1 τ 2 S τ D T + 1 T e τ τ tr G(τ) nm fluorescein 2 nm 5 nm 10 nm N τ(ms) N = c N A V ellipsoid 1.33 V ellipsoid ~ 1.35 femtol c (nm)

48 Antitest diffúziója oldatban és membrán receptorhoz (IL-2Rα) kötve G(τ ) szabad Fab τ D receptorhoz kötött Fab lag tim e (m s) A diffúziós állandó 3 nagyságrenddel csökken

49 MHC II receptorok mobilitása JY sejtek ép membránjában és apoptotikus bleb -jeiben ép sejt bleb G(τ) τ D τ (ms) D (cm 2 /s) ép sejt bleb

50 b a b a F F t F t F G ) ( ) ( ) ( τ δ δ τ + = Két spektrálisan különböző festék fluoreszcenciájának ingadozása hogyan korrelál egymással - molekuláris asszociáció kimutatása olyan esetben is, amikor nem változik jelentősen a diffúziós állandó az asszociáció következtében a + b ab Keresztkorreláció:

51 Fluoreszcencia keresztkorrelációs spektroszkópia (FCCS) Asszociált molekulák együttmozgása Fluoreszcencia intenzitások párhuzamos ingadozása Pozitív keresztkorrelációs jel G a + b ab cab ( τ ) V c c ( )( ) eff atot, btot,

52 I. és II. osztályú fő hisztokompatibilitási komplex fehérjék diffúziójának vizsgálata B-limfocita sejtvonalon G(τ) Cross corr Alexa-L243 Cy5-W6/ τ (ms) MHC II autokorreláció MHC I autokorreláció MHC I - MHC II keresztkorreláció

53 Fos és Jun stabil asszociációja (ko-mobilitás) Fos-GFP (autokorr.) Jun-mRFP (autokorr.) Keresztkorreláció 1 Fos és Jun heterodimert alkotó transzkripciós faktorok Dimerizációs domén (leucin cipzár) DNS-kötő domén Transzaktivációs domén b DNA b N 380 Fos C Jun N. Baudendistel és mtsai

54 Diffúzió mérése fotokioltáson alapuló technikákkal (Lippincott-Schwartz) FRAP: diffúziós állandó, mobilis hányad FLIP (Kioltás során fellépő fluoreszcencia veszteség): a molekulák mely térrészekből juthatnak el a kiválasztott területre Fotoaktiválható GFP: láthatóvá tétel csak a kiválasztott térrészben, organellumban, kompartmentek közti vándorlás

55 pagfp fotoaktivációja és diffúziója (Lippincott-Schwartz) pagfp abszorpciós spektrumának és fluoreszcenciaájának megváltozása 400 nm-es fénnyel történő fotoaktiváció hatására pagfp diffúziója a magból a citoplazmába

56 Aktivált sejtek, sejtcsoportok nyomon követése kísérleti állatok egyedfejlődése során

57 Fluoreszcens indikátorok IND--AM IND--AM észteráz Ca 2+ IND IND enzim acetoximetilészter (hidrofób) Fura 2 Ca 2+ -indikátor szabad festék spektruma Ca 2+ -kötő festék λ (nm)

58 Fluoreszcens ion-indikátorok Ca 2+ Fura-2 Indo-1 H + K + Na + BCECF PBFI SBFI

59 Ca 2+ -válasz mérése 2.9 Mn F 340 / F ionomycin szabad festék spektruma Ca 2+ -kötő festék nm EGF λ (nm)