meghatároz lete és sa Szabó Pál MTA TTK

Átírás

1 1 LC-MS/MS alapú mennyiségi meghatároz rozásokok elmélete lete és megvalósítása sa Szabó Pál MTA TTK

2 Követelmények 2 Érzékenység Szelektivitás Gyorsaság Magas komponensszám/injektálás

3 Mennyiségi meghatároz rozások 3 Egyszeres kvadrupol Full scan mód SelectedIon Monitoring (SIM) Hármas kvadrupol Reakciócsatornák figyelése (MRM) QTrap: MS/MS/MS Nagyfelbontású MS

4 Egyszeres kvadrupol 4 Q1 full scan Minden iont figyel

5 Egyszeres kvadrupol 5 1. ciklus 2. ciklus Last m/z Last m/z m/z érték m/z 3 m/z 2 m/z 1 m/z 3 m/z 2 Idő

6 Egyszeres kvadrupol 6 Selected Ion Monitoring (SIM) Csak a kiválasztott ionokat figyeli

7 Egyszeres kvadrupol 7 1. ciklus 2. ciklus m/z 3 m/z 3 m/z értékek Hosszabb tartózkodás az egyes tömegeken Jobb jel/zaj viszony m/z 2 m/z 2 m/z 1 m/z 1 idő

8 Egyszeres kvadrupol Full Scan 8 1.5e e8 5.0e e5 1.00e Time, min e4 6.00e e4 2.00e m/z, amu

9 Egyszeres kvadrupol SIM 9 1.6e5 1.5e5 1.4e5 1.3e5 1.2e5 1.1e5 1.0e5 9.0e4 8.0e4 7.0e4 6.0e4 5.0e4 4.0e e4 2.0e4 1.0e Time, min 9.6

10 Hármas kvadrupol 10 Reakciócsatornák követése (MRM) Q1: kiválaszt (anyaion) Q3: kiválaszt (fragmension)

11 MRM módm ciklus 2. ciklus MRM3 MRM3 Q1/Q3 értékek MRM2 MRM2 MRM1 MRM1 idő

12 Hármas kvadrupol MRM Time, min

13 Szelektivitás s (100( 100μg/L) 13 MRM SIM

14 Érzékenység (1μg/L) 14 MRM SIM

15 QTRAP 15 Gyakran előfordulhat, hogy zavaró interferenciák lépnek fel a hagyományos MRM átmenetek során Az MS 3 (MS/MS/MS) a szelektivitás egy újabb lehetőségét kínálja

16 MS/MS MS/MS elve 16 Első anyaion kiválasztása: Q1 Fragmentáció: Q2 Fragmensionok csapdázása Q3 (Lineáris Ioncsapda LIT) Második anyaion kiválasztása: LIT Fragmentálás: LIT Második generációs fragmenseg detektálása

17 MS 3 kvantitálás 17 Intensity, cps Intensity, cps Intensity, cps +EPI (330.90) Max. 4.7e6 cps. 4.7e6 4.0e6 3.0e6 2.0e e m/z, Da +MS3 (330.90),(127.10) Max. 2.5e6 cps. 2.5e e6 1.0e m/z, Da MS3 (330.90),(99.00) Max. 1.3e7 cps e7 1.0e7 5.0e MRM 331/99 (CE=30V) MRM 331/127 (CE=18V) MS/MS/MS 331/127/99 (CE=18V and AF2=35mV) MS/MS/MS 331/99/71 (CE=30V and AF2=70mV) m/z, Da

18 MS 3 kvantitálás 18 XIC of +MRM (4 pairs): 330.9/ Max. 1.0e5 cps. XIC of +MS3 (330.90),(127.10): E... Max. 2.8e7 cps. 1.00e5 8.00e4 Intensity, cps 6.00e4 4.00e4 S/N = MRM 331/127 Intensity, cps 2.8e7 2.5e7 2.0e7 1.5e7 1.0e7 S/N = MS 3 331/127/ e4 5.0e6 Intensity, cps Time, min Time, min XIC of +MRM (4 pairs): 330.9/98... Max. 4.5e5 cps. XIC of +MS3 (330.90),(99.00): Ex... Max. 2.9e7 cps. 4.5e5 4.0e5 3.5e5 3.0e5 2.5e5 2.0e5 1.5e5 matrix interference S/N = MRM 331/99 1.0e5 5.0e6 5.0e Time, min Intensity, cps e7 2.5e7 2.0e7 1.5e7 1.0e7 S/N = 147 MS 3 331/99/ Time, min 10μg/kg mátrixból (MS3: %CV<5, accuracy % )

19 Felbontás % völgy m Felbontás: R = m m Full Width at Half Mass Dm (50% magasságnál) Dm 10 % m

20 Nagyfelbontású analizátorok 20 Repülési idő analizátor (TOF) Q-TOF

21 Nagyfelbontás s (TOF) 21 XIC ± 100mDa S/N = 5.3 XIC ± 9.6mDa S/N = 15.5 XIC ± 4.8mDa S/N = 41.0 XIC ± 1.9mDa S/N = 44.1

22 Triple TOF: SWATH 22 Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical mass spectra lehetővé teszi MS/MS felvételek készítését általános és átfogó módon A Q1 kvadrupólt szélesre nyitjuk és léptetjük a teljes tömegtartományban Data Independent Acquisition (DIA), információtól független mérés MS/MS ALL Regular MS/MS SWATH MS/MS Q1 filter [0.7] CID TOF analyzer Q1 filter [25Da] CID TOF analyzer

23 SWATH-MS Adatgyűjtés elmélete m/z Aebersold and coworkers, ETH Zurich min

24 SWATH-MS Adatgyűjtés elmélete m/z m/z tömegtartomány= [ ] 25Da swath ablak 32 swath-ra van szükség 100ms egy ablak 3.2s ciklusidő swath = A kromatográfiás futás során egy adott tömegablakkal kiválasztott anyaionok fragmenseinekösszessége Ciklusidő: azonos tömegablakhoz való visszatéréshez szükséges idő Aebersold and coworkers, ETH Zurich min

25 SWATH-MS adatgyűjtés elmélete: adatgyűjtés és értékelés 25 Aebersold and coworkers, ETH Zurich TIC MS1 map 25

26 SWATH-MS adatgyűjtés elmélete: Adatgyűjtés és értékelés MS2/swath map [swath m/z] TIC 26 Keresett peptid MS1 map Kiválasztott ionkromatogramok: Aebersold and coworkers, ETH Zurich 26

27 SWATH előnyei 27 általános és nem célzott nincs módszerfejlesztés! Az adatok utólagosan visszanyerhetők (mind MS, MS/MS és XIC) A mérési idő nem növekszik a mérendő komponensek számával Aszelektivitása hasonló MRMHR -hez (a háttér általában magasabb)

28 28 Hány komponens mérhetm rhető egy injektálásb sból?

29 Egy csúcs jellemzése 29 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:

30 Egy csúcs jellemzése 30 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:

31 Egy csúcs jellemzése 31 A pontok számának csökkenésével a csúcs ábrázolása torzul S/N viszony nő a csúcsszélesség csőkkenésével A kvantitáláshoz minimálisan szükséges pontok száma:

32 MRM határai 32 Tipikus csúcsszélesség egy HPLC futás során ~ 21 sec Minimálisan szükséges adatpontok száma ~10 Minimális dwell time / ion ~ 5msec Minimális pause time az MRM átmenetek között ~ 2msec MRM átmenetek maximális száma: = 21 sec/csúcs 10pont/csúcs 7 msec/pont = 300

33 Ajánl nlás s mennyiségi meghatároz rozásokhoz 33 Ajánlás 2002/657/EG SIM és MRM (4 azonosítási pont) MS anyaion1.0 MS 2 2 MRMs = 4 fragmens 1.5 (megfelelő ionarány) Full scan spektrum (spektrumkönyvtár) Nagyfelbontású MS (>10 000)

34 Metolachlor Pozit itív találat lat 34 Oldószer 0.1µg/L Standard Felszíni víz 0.01µg/L

35 Metobromuron Negatív találat lat 35 Oldószer 0.1µg/L Standard Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.90 Felszíni víz 0.008µg/L Számolt Quantifier/Qualifier arány = 0.39

36 QTrap kínálta screening lehetőség 36 Survey scan: 300 MRM IDA kritérium (küszöb ) 3 EPI spektrum Dinamikus kizárás 60 sec MRM Survey Scan IDA Criteria Dynamic Exclusion Acquire MSMS Acquire SpectraMSMS Acquire SpectraMSMS Spectra

37 A QTRAP nyújtotta lehetőségek 37 Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben mért koncentráció 0.29 mg/kg maximálisan megengedett érték = 0.05 mg/kg átlag MRM arány a standard esetében = (RSD=8%, n=7) MRM arány a mintában = a standard Rt értéktartománya perc (SD=0.01 perc, n=7) minta Rt = 5.78 perc P Intensity, cps Intensity, cps 1.5e5 1.5e5 1.4e5 1.4e5 1.2e5 1.2e5 1.0e5 1.0e5 8.0e4 8.0e4 6.0e4 6.0e4 4.0e4 4.0e4 2.0e4 2.0e Standard 5.84 Gyömbér minta Time, min 4 6 Time, min További vizsgálatokat igényelt, mivel gyömbérben még nem fordult elő! 6

38 A QTRAP nyújtotta lehetőségek 38 Pozitív Tebufenpyrad találat gyömbérben Enhanced Product Ion spektrumok az m/z=334 (M+H + ) ionokon (API 4000 Qtrap) Qualifier Quantifier Tebufenpyrad standard oldata Gyömbér minta Konklúzió: a kapott EPI spektrumok alapján a Tebufenpyrad jelenléte a gyömbérben egyértelműen kizárható!

39 Komponensszám m növeln velése 39 Csak akkor figyel egy MRM csatornát, amikor ott ion várható Minden MRM csatorna esetén meg kell adni Egy várt Rt. Rt. ablak Minimum dwell time A program automatikusan felépíti a metódot Az idők alapján megtervezi az MRM átmeneteket A minimális ciklusidőt VAGY dwell time-ot veszi alapul

40 Scheduled MRM e6 1.5e6 1.0e6 5.0e Time, min Lényegesen több komponens egyidejű detektálása lehetséges anélkül, hogy az érzékenység vagy a szelektivitás csökkenne

41 High throughput vizsgálat smrm módszerrel e5 1.00e5 9.50e4 9.00e4 8.50e4 8.00e4 7.50e4 7.00e4 6.50e4 10 perces LC futás 1000 MRM módszer 35 vegyület spike-olt vizelet 6.00e4 5.50e4 5.00e4 4.50e4 4.00e4 3.50e4 3.00e4 2.50e4 2.00e4 1.50e4 1.00e Time, min

42 Összefoglalás 42 Komp/inj Érzékenység Szelektivitás Retrospektív Q SIM < Nem QqQ MRM Nem QTrap MS 3 < Nem QTrap MRM/EPI Nem QTrap smrm Nem TOF MS Korlátlan + + Igen TOF MSMS < Nem TOF MSMS SWATH Korlátlan Igen