A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások"

Kornél Szőke
8 évvel ezelőtt
Látták:

1 A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások Dr. Csősz Éva

2 Proteomika Szolgáltató Laboratórium műszerpark MALDI-TOF (ABSciex) PSZL ESI-4000 QTRAP (ABSciex) Kétdimenziós elektroforézis rendszer (Bio-Rad) BioPlex (Bio-Rad)

3 I. Szekvencia alapú fehérje azonosítás - MS/MS spektrumokon alapuló fehérjeazonosítás - A spektrumok segítségével fehérje szekvencia részlet azonosítása történik, majd a megfelelő fehérje hozzárendelése az egyre bővülő adatbázisokból - ProteinPilot 4.0 (ABSciex) illetve Mascot keresőprogramok segítségével, az eredmények manuális értékelésével nagy biztonsággal történik a fehérje azonosítás

hozzárendelése az egyre bővülő adatbázisokból - ProteinPilot 4.

4 I. Szekvencia alapú fehérje azonosítás Fehérjét tartalmazó foltok/sávok kivágása 2DE Enzimes (tripszin) emésztés A sejt lízise Fehérjék azonosítása Tömegspektrometriás analízis

5 II. Fehérje kvantitálás metabolikus jelölést követően intenzitás SILAC Stable isotope labelling with amino acids in cell culture Tápfolyadék normál Arg-el (könnyű Arg) Tápfolyadék 13 C tartalmú Arg-el (nehéz Arg) Sejtek lízise és homogenizálása Minta összekeverése Sejtek lízise és homogenizálása MS/MS 6 Da m/z

(könnyű Arg) Tápfolyadék 13 C tartalmú Arg-el (nehéz Arg) Sejtek lízise és

6 III. Fehérje kvantitálás kémiai jelölést követően intenzitás intenzitás itraq (isobaric tag for relative and absolute quantitation) 114 B R 115 B R 116 B R 117 B R Kontroll Kezelt sejt 60 min Kezelt sejt 120 min Kezelt sejt 240 min Sejtek feltárása, összekeverése MS m/z jelölés MS/MS 115 Fehérje mennyiségi adat a görbe alatti területből számolva m/z

Kezelt sejt 60 min Kezelt sejt 120 min Kezelt sejt 240 min Sejtek feltárása, összekeverése

7 Fehérje kvantitálás metabolikus (SILAC) vagy kémiai (itraq) jelölést követően Metabolikus jelölés Előny 100%-os jelölést biztosítanak Egyazon rendszerben vizsgálható a két minta Hátrány Csak sejtkultúrákra alkalmazható Bizonyos sejtek kiemelt figyelmet igényelnek (speciális tápfolyadék stb.) Kémiai jelölés Előny Tetszőleges mintán alkalmazható Egyazon rendszerben vizsgálható 2-8 minta Hátrány A jelölés hatékonysága soha sem 100% Jelölés nem teljesen specifikus

sejtek kiemelt figyelmet igényelnek (speciális tápfolyadék stb.

8 Könnyfehérjék kvantitálása itraq jelölést követően Csosz et. al. (2012) J. Proteomics

9 IV. Fehérjék kvantitálása MRM/SRM módszer segítségével Q1 analizátor Ütközési cella Q3 analizátor Peptid kiválasztása Peptid fragmentálása Fragmens kiválasztása Detektálás

10 IV. Fehérjék kvantitálása MRM módszer segítségével MRM módszer kidolgozása szöveti fehérjékre AALVLAQAPAALADVLEGDSSEDRAFRVRIAG DAPLQGVLGGALTIPCHVHLRPPPSRRAVLG SPRVKWTFLSRGREAEVLVARGVRVKVNEAY RFRVALPAYPASLTDVSLARCEVQHGIDDSSD AVEVKVKGVVFLYREGSARYAFSFSGAQEAC TPEQLYAAYLGGYEQCDAGWLSDQTV Fehérje szekvencia Elméleti tripszin hasítás BLASTp MRM spektrum MRM átmenetek tervezése Csak a fehérjére jellemző szekvenciák kiválogatása

RFRVALPAYPASLTDVSLARCEVQHGIDDSSD AVEVKVKGVVFLYREGSARYAFSFSGAQEAC TPEQLYAAYLGGYEQCDAGWLSDQTV Fehérje

11 V. Aminosav analízis un. intelligens reagensek segítségével

12 V. Aminosav analízis un. intelligens reagensek segítségével

13 VI. Proteomikai profil változás vizsgálata kétdimenziós gélelektroforézis segítségével Alkalmas a proteomikai profilban bekövetkezett változások kimutatására, nyomon követésére A Minta B Minta gélanalízis kvalitatív és kvantitatív különbségek

profilban bekövetkezett változások kimutatására, nyomon

proliferatív vitreoretinopátiára (PVR) jellemző

14 VI. Proteomikai profil változás vizsgálata kétdimenziós gélelektroforézis segítségével A proliferatív vitreoretinopátiára (PVR) jellemző fehérje profil vizsgálata Dispase TG2 KO egér TG2 KO PVR egér

15 VII. Gélanalízis Kétdimenziós gélelemzés

16 VII. Gélanalízis Géldokumentáció Gélanalízis Master gél Expressziós különbségek

17 VII. Gélanalízis Egydimenziós gélelemzés QuantityOne (BioRad) szoftverrel M H1 AD1 AD2 AD3 H2 240 kda 165 kda 125 kda 93 kda 72 kda 63 kda 42 kda 35 kda H1 H2 AD2 AD3 25 kda 20 kda kda

kda 125 kda 93 kda 72 kda 63 kda 42 kda 35 kda 1 2 3

18 VIII. Szkennelés Quantity One 1-D PDQuest Delta2D szoftverek PharosFX Plus System gélek blottok microplate-ek agar-agar lemezek szkennelése

19 VIII. Szkennelés Fluorescens szkennelés: 488 nm 532 nm 635 nm lézerek Telepszámlálás agar-agar lemezen

20 Összefoglalás Vállalt szolgáltatások: Szekvencia alapú (MS/MS) fehérjeazonosítás Fehérje kvantitálás (SILAC, itraq) MRM alapú fehérje azonosítás és kvantitálás Gyors aminosav analízis 1D és 2D elektroforézisek kivitelezése Géldokumentáció Gélanalízis Fluoreszcens szkennelés Fehérje profilok változásának vizsgálata

azonosítás és kvantitálás Gyors aminosav analízis 1D és 2D elektroforézisek

21 Elérhetőségek Honlap: Cím: DE OEC Elméleti Tömb, 204. Személyes kapcsolat: Dr. Tőzsér József Dr. Csősz Éva Köszönöm a figyelmet!

Hasonló dokumentumok

Proteomika az élelmiszer-előállításában

DEBRECENI EGYETEM Proteomika az élelmiszer-előállításában Czeglédi Levente Gulyás Gabriella Csősz Éva 2014., korrig 2015. TÁMOP-4.1.1.C-12/1/KONV-2012-0014 Élelmiszerbiztonság és gasztronómia vonatkozású