Gyógyszerek és DNS mutációk kimutatása vérből

Átírás

1 Gyógyszerek és DNS mutációk kimutatása vérből AKI kíváncsi kémikus kutatótábor Kolostyák Zsuzsanna, Békés Márta, Varga Bálint Július 2.

2 Enzimek; metabolizmus - A legtöbb biokémiai lépést enzimek katalizálják - Specifikusak - A szubsztrát átalakítása után változatlanul maradnak vissza - Az átalakítást metabolizmusnak nevezzük - A keletkezett termék a metabolit

3 Citokróm P450 szupercsalád - Testidegen anyagok (gyógyszerek, növényvédőszerek) átalakítása - Elsősorban a májban fejeződik ki, de megtalálható más szervekben is (pl. tüdő, vese) - Az enzimek rendszerbe sorolása aminosav sorrendjük homológiája alapján történik CYP2D6 enzim alcsalád család - A leggyakoribb gyógyszermetabolizálók a CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6,CYP3A4, CYP3A5

4 Metodika Vér Szérum izolálása Fehérvérsejt izolálása Betegek: Vizsgált hatóanyagok: Vérszint meghatározása P.N. K.T. G.L. Carbamazepine Risperidone Quetiapine Clonazepam? DNS izolálása Genotipizálás pontmutációk kimutatása 2C9*2 2C19*3 P.N. 2C9*3 3A5*3 K.T. 2C19*2 G.L. Vizsgáló módszer: LC-MS technika Kvantitatív real time PCR

5 hatóanyag terápiás metabolizmus alkalmazott kategória plazma IS koncentráció carbamaze pine 4-12 ug/ml CYP2C8, CYP3A4 6-metilrisperidone antiepileptikum quetiapine ng/ml, túladagolás esetén postmortem vérszint: 25 ug/ml CYP3A4 clonidine és 6- metilrisperidone antipszichotikum, 2. generációs, atípusos risperidone ng/ml CYP2D6 antipszichotikum, 2. generációs, atípusos clonazepam ng/ml CYP3A4 pánikbetegségben a küszöb: 17 ng/ml clonidine és 6- metilrisperidone 6-metilrisperidone antiepileptikum, anxiolitikum

6 Folyadékkromatográf (HPLC) LC-MS Tömegspektrométer (MS)

7 Metodika Vér Szérum izolálása Fehérvérsejt izolálása Betegek: Vizsgált hatóanyagok: Vérszint meghatározása P.N. K.T. G.L. Carbamazepine Risperidone Quetiapine Clonazepam? DNS izolálása Genotipizálás pontmutációk kimutatása 2C9*2 2C19*3 P.N. 2C9*3 3A5*3 K.T. 2C19*2 G.L. Vizsgáló módszer: LC-MS technika Kvantitatív real time PCR

8 Real Time PCR (polimeráz láncreakció) TaqMan próbával

9 Carbamazepin MRM 237/194

10 Clonazepam

11 Vérszérumszintek Minta\hatóanya g Carbamazepi ne (μg/ml) Clonazepam (ng/ml) Risperidone (ng/ml) Quetiapine (ng/ml) KT1 0 18,76 21,12 247,6 KT2 0 18,48 21,14 276,8 PN1 4,68 16, PN2 4,92 16, GL1 0 11, GL2 0 14, Terápiás plazma konc

12 2C9*3 - homozigóta

13 PCR eredmények 2C19*2 2C19*3 2C9*2 2C9*3 3A5*3 P. N. K. T. G. L. Heterozigóta Heterozigóta Heterozigóta mutáns mutáns

14 PCR eredmények 2C19*2 2C19*3 2C9*2 2C9*3 3A5*3 P. N. K. T. G. L. Heterozigóta Heterozigóta Heterozigóta mutáns mutáns P.N: a gyorsabb metabolizmus miatt dózisnövelés

15 PCR eredmények 2C19*2 2C19*3 2C9*2 2C9*3 3A5*3 P. N. K. T. G. L. Heterozigóta Heterozigóta Heterozigóta mutáns mutáns P.N: a gyorsabb metabolizmus miatt dózisnövelés K.T: magas Quet. c miatti dóziscsökkentés

16 PCR eredmények 2C19*2 2C19*3 2C9*2 2C9*3 3A5*3 P. N. K. T. G. L. Heterozigóta Heterozigóta Heterozigóta mutáns mutáns P.N: a gyorsabb metabolizmus miatt dózisnövelés K.T: magas Quet. c miatti dóziscsökkentés G.L: a mutáns enzimekkel metabolizálódó gyógyszerek kerülése

17

18 Módszerek SNP analízis TaqMan próbákkal: CYP2C19*2 G>A báziscsere azonosításának példáján Sense szál: forward primer és a próba az anti sense szálhoz fog bekötni GCATATTGTA TCTATACCTT TATTAAATGC TTTTAATTTA ATAAATTATT GTTTTCTCTT AGATATGCAA TAATTTTCCC ACTATCATTG ATTATTTCCC G/A GGAACCCATA ACAAATTACT TAAAAACCTT GCTTTTATGG AAAGTGATAT TTTGGAGAAA GTAAAAGAAC ACCAAGAATC GATGGACATC AACAACCCTC GGGACTTTAT TGATTGCTTC Forward primer szekvencia: 5 -CTTAGATATGCAATAATTTTCCCAC-3 Reverse primer szekvencia: 5 -GAAGCAATCAATAAAGTCCCGA-3 Vad típusú próba szekvencia: 5 CalGold540-TGATTATTTCCCGGGAACCCATAAC-BHQ-1 3 Mutáns típusú próba szekvencia: 5 Quasar670-TGATTATTTCCCAGGAACCCATAAC-BHQ-2 3